Les rétrovirus spumeux : du nouveau chez les rétrovirus

Les virus foamy ont été mis en évidence en 1954 par Enders et Peebles au sein de cultures de cellules de rein de singe Rhésus, puis ont été isolés pour la première fois par Gajdusek en 1967 à partir de suspensions de cerveau de chimpanzé. Par la suite, ces virus ont été retrouvés dans des tissus de nombreuses espèces animales comme les bovins, les félins, les hamsters et les primates. En 1971, Epstein et al. ont décrit, chez un patient atteint d'un cancer du nasopharynx, l'isolement d'un virus foamy qui a été considéré comme le prototype « humain » des spumarétrovirus. Cet isolat représente, jusqu'à aujourd'hui, le seul virus foamy isolé chez l'homme disponible pour la communauté scientifique. Les premières analyses réalisées en microscopie électronique montrent que la particule extracellulaire des spumarétrovirus, d'un diamètre de 100 à 140 nm, est entourée d'une membrane lipidique d'origine cellulaire hérissée de spicules de 5 à 15 nm, et bourgeonne essentiellement à partir des membranes du réticulum endoplasmique. Ces virus amphotropes infectent divers types cellulaires, suggérant l'ubiquité du récepteur. En culture cellulaire, les spumarétrovirus, qui sont lytiques, induisent dans un premier temps l'apparition de cellules géantes multinucléées présentant de nombreuses vacuoles (figure 1).

Une étude moléculaire récente

La nouvelle classification proposée par B. Cullen a permis de différencier les rétrovirus simples et les rétrovirus complexes [1] (tableau 1). Les rétrovirus simples, tels que le MLV (moloney leukemia virus), codent seulement pour les gènes structuraux et enzymatiques gag, pol et env. Ils ont un profil de transcription simple et leur régulation dépend essentiellement de la cellule hôte qu'ils infectent. Contrairement à ces virus, les rétrovirus complexes ont un profil de transcription plus élaboré et, outre ces trois gènes classiques, des gènes appelés « accessoires » ou « régulateurs » vont leur permettre d'acquérir un degré supplémentaire d'indépendance vis-à-vis de la cellule hôte. Cette dernière classe virale est formée de trois groupes : les lentivirus, dont le prototype humain est le VIH, les virus des leucémies T représentés chez l'homme par le HTLVI, enfin, les spumarétrovirus, dont le seul et unique isolat humain disponible est le HFV (human foamy virus) (figure 2).

Bien que la découverte des rétrovirus spumeux ait été antérieure à celle des autres rétrovirus, leur étude moléculaire a seulement commencé en 1987 par le clonage moléculaire du virus HFV [2]. L'analyse de la séquence du HFV a montré la présence de gènes accessoires situés, non pas de part et d'autre du gène env comme chez les rétrovirus VIH ou HTLV, mais entièrement en 3' de ce gène (figure 2). Cette particularité fut à l'origine de la nomenclature de ces gènes : les gènes bel pour between env and LTR.

La réplication des spumarétrovirus suit dans ses grandes lignes celle des autres rétrovirus. L'ARN viral subit une transcription inverse au sein de la cellule pour devenir un ADN double brin qui possède une interruption ou « gap » sur le brin d'ADN(+) lorsqu'il n'est pas intégré. Cette particularité est également retrouvée chez les lentivirus ; elle est due à une double initiation du second brin d'ADN lors de la transcription inverse. Cette interruption est réparée après intégration du virus dans le génome cellulaire.

Le LTR (long terminal repeat) a une structure classique avec les trois régions U3, R et U5, mais sa taille est supérieure à celle retrouvée chez les autres rétrovirus ; la différence se situe essentiellement dans la région U3. Paradoxalement, cette dernière région, qui comporte une multitude de sites de fixation à des facteurs de transcription cellulaires chez les autres rétrovirus complexes, ne semble posséder chez le HFV que deux sites AP1 qui n'interviennent que de façon mineure dans l'activation du LTR. L'activité transcriptionnelle du LTR est entièrement dépendante de la présence du transactivateur viral nucléaire Bel1, l'activité basale en l'absence de cette protéine étant quasiment nulle [3]. En revanche, plusieurs éléments de réponse au transactivateur viral Bel1 ont été retrouvés dans la région U3. Ces séquences ne présentent aucune similitude et, par comparaison aux transactivateurs rétroviraux (Tat, Tax), il a initialement été postulé que Bel1 ne fixerait pas directement l'ADN viral mais s'associerait plutôt à des facteurs cellulaires de transcription lui conférant sa spécificité. Or, il a été démontré récemment, par des expériences de retard sur gel et de protection à l'ADNase I, que Bel1 se fixait sur le LTR viral, ouvrant ainsi la voie à toute une série d'interrogations concernant son mode d'action [4]. D'autres régions de régulation négative ont été localisées dans R-U5.

Le LTR dirige la synthèse des ARNm des gènes structuraux et des ARNm bel, selon un profil de transcription complexe ; ces ARNm possèdent tous une séquence leader de 51 pb. Il est à noter que des délétions spécifiques dans le LTR de HFV ont été mises en évidence et sont plus fréquemment retrouvées dans des systèmes d'infection chronique [5].

Les gènes structuraux et enzymatiques

Le gène gag permet la synthèse d'un précurseur protéique retrouvé sous forme d'un doublet de 74-78 kDa dans les cellules infectées. Ces précurseurs sont clivés par la protéase virale (codée par le gène pol) en protéines de la matrice MA (p27), de la capside CA (p33) et de la nucléocapside NC (p16) (tableau 2). Contrairement aux autres rétrovirus chez lesquels la nucléocapside possède un doigt de zinc fixant l'ARN viral, ce motif est remplacé par trois boîtes riches en Arg et Gly, fortement basiques ; le deuxième domaine Arg-Gly joue le rôle d'un signal de localisation nucléaire à l'origine de l'accumulation des précurseurs Gag néosynthétisés dans le noyau lors des étapes précoces de l'infection [6].

Le gène pol, très conservé parmi les spumarétrovirus, permet la synthèse de la protéase virale Pro (p10), de la transcriptase inverse/ARNaseH-RT (p80) et de l'intégrase IN (p40) à partir d'un précurseur Pol de 127 kDa. Alors qu'un saut de cadre de lecture de + 1 des ribosomes ou la suppression d'un codon stop sont à l'origine de la synthèse du précurseur Pol à partir d'un ARNm gag-pol chez les autres rétrovirus exogènes, chez les spumarétrovirus, la synthèse de ce précurseur dérive d'un ARNm pol spécifique. La transcription de cet ARNm dépend à la fois du LTR mais aussi, dans une moindre mesure, d'un activateur de la transcription (dépendant également du transactivateur viral) situé en 3' du gène gag [7, 8]. Le mode de synthèse de la protéine Pol rappelle ce que l'on peut observer pour l'expression de la protéine P chez le virus de l'hépatite B ou celui de la mosaïque du chou-fleur, deux pararétrovirus. Mais cette particularité pose un problème. En effet, chez les rétrovirus, la quantité de protéine Pol synthétisée est invariablement couplée à celle de la protéine Gag en raison de l'efficacité de la suppression du codon stop ou du saut de cadre de lecture par les ribosomes qui conduiront à la synthèse d'une protéine de fusion Gag-Pol. Ainsi, l'incorporation des protéines Pol au sein du virion passe par la compartimentation de la protéine Gag. Chez les spumarétrovirus, il se pourrait que la localisation de cette protéine dans le virion passe par une interaction spécifique avec les protéines Gag ou avec les acides nucléiques viraux, comme c'est le cas chez les hépadnavirus, ou bien avec ces deux composants viraux à la fois.

Le gène env donne naissance à un précurseur de 130 kDa clivé par une protéase cellulaire en protéine de surface SU (gp70-80) et transmembranaire TM (gp48). La queue cytoplasmique, comparativement plus longue chez les spumarétrovirus, par rapport aux autres rétrovirus, contient un motif dilysine responsable de la séquestration des virions dans le réticulum endoplasmique, caractéristique partagée, là aussi, par le virus de l'hépatite B qui bourgeonne également au niveau de cet organelle.

Les gènes régulateurs

La localisation particulière des gènes accessoires bel est à mettre en parallèle avec l'existence d'un promoteur interne situé en 3' du gène env permettant la synthèse des ARNm régulateurs indépendamment du LTR. D'activité basale plus élevée que celle du LTR, ce promoteur dirige l'expression des ARNm accessoires très tôt dans l'infection, conduisant à la synthèse du transactivateur Bel1 qui va activer la transcription des gènes à partir du LTR et des promoteurs internes. Ainsi, le passage de la phase précoce à la phase tardive de l'infection s'effectue par une simple bascule de promoteurs. Cette particularité rend inutile la présence d'un régulateur post-transcriptionnel tel que les protéines Rex et Rev qui remplissent ce rôle chez les virus HTLV et VIH.

Le transactivateur viral Bel1 est une phosphoprotéine nucléaire de 36 kDa composée d'un domaine d'activation et d'une région impliquée dans la fixation à l'ADN viral. Cette protéine active la transcription en se fixant sur l'ADN viral au niveau du LTR, mais aussi du promoteur interne situé en 3' du gène env. Enfin, elle possède in vitro une activité transactivatrice sur le LTR du VIH, mais pas sur celui du HTLV.

Peu d'informations sont disponibles sur les éventuelles fonctions de la protéine Bet (pour Bel1 plus Two). C'est une protéine produite après épissage de 301 paires de bases dans le gène bel1, fusionnant les 88 premiers acides aminés de Bel1 avec la totalité du cadre ouvert de lecture de la protéine Bel2. D'un poids moléculaire apparent de 60 kDa, elle est retrouvée à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau, et peut être sécrétée dans le milieu extracellulaire. La localisation nucléaire serait due soit à un signal de localisation nucléaire qui reste à identifier, soit à l'entraînement de Bet par la protéine Bel1 via la formation d'un hétérodimère par leur domaine N-terminal commun. Nous avons montré que cette protéine joue un rôle clé dans la persistance virale observée chez les spumarétrovirus, comme nous le verrons.

L'existence d'autres protéines accessoires nommées Bel2, Bel3 a été supposée d'après l'analyse génomique, mais ces protéines n'ont jamais pu être mises en évidence au sein de la cellule infectée.

Une relation étroite avec le cytosquelette

Comme énoncé précédemment, l'une des caractéristiques des virus foamy est l'accumulation des protéines Gag dans le noyau très tôt dans l'infection. Ce phénomène permet d'obtenir en immunofluorescence un marquage nucléaire intense dans les premières heures qui suivent l'infection. L'analyse des étapes précoces du cycle réplicatif nous a permis de montrer que, seulement deux heures après l'infection, les protéines Gag se concentrent à la périphérie du noyau autour du centrosome, puis pénètrent progressivement dans le noyau. L'utilisation de zidovudine (AZT) qui bloque la transcription inverse, démontre qu'il s'agit de protéines virales entrantes, et non d'une synthèse protéique de novo. Par ailleurs, en microscopie électronique, nous avons pu montrer une juxtaposition des marquages entre le génome viral et les protéines Gag, suggérant que le complexe de préintégration se localise autour de cette structure cellulaire (figure 3).

La localisation spécifique des protéines Gag autour de l'organisateur microtubulaire de la cellule nous a amené à penser que les protéines Gag pourraient interagir avec la tubuline pour accéder à cet organite, puis au noyau. Un traitement à la colchicine (inhibiteur de la polymérisation dynamique du réseau microtubulaire) nous a conforté dans notre hypothèse car les cellules traitées ne permettent plus une réplication active du virus [9].

Notons que l'interaction protéines virales-tubuline n'est pas uniquement retrouvée chez les spumarétrovirus : elle semble aussi importante dans le cycle réplicatif d'autres virus tels que le HSV, l'Ad 2 ou certains réovirus [10]. Enfin, récemment, il a été montré que le complexe de préintégration du VIH1 pouvait emprunter le réseau de vimentine pour atteindre le noyau dans les cellules bloquées en G1/S.

Un pouvoir pathogène non établi

S'il est vrai que les spumarétrovirus sont hautement lytiques in vitro, rien, à l'heure actuelle, ne permet d'affirmer qu'ils sont pathogènes in vivo. Depuis leur découverte, les spumarétrovirus ont été isolés à partir de cellules de rein, de prélèvements de gorge, ou plus simplement à partir de cellules du sang périphérique de différentes espèces animales telles que les chimpanzés, les hamsters, les bovins ou les félins. Chez ces derniers, le virus induit une forte réponse immunitaire et persiste toute la vie, suggérant un contrôle strict de sa réplication soit par l'organisme, soit par le virus lui-même, soit par ces deux protagonistes. à part cette manifestation immunologique, aucune pathologie n'a pu être mise en évidence chez les animaux naturellement infectés.

Cela n'a pas empêché plusieurs groupes de rechercher la présence de marqueurs d'infection par des spumarétrovirus dans diverses conditions pathologiques, plus précisément chez des patients atteints de maladies d'étiologie inconnue. Plusieurs travaux ont décrit des marqueurs d'infection chez des patients atteints de maladies auto-immunes, telles que la maladie de Basedow, la thyroïdite de Quervain, certaines encéphalopathies, pour ne citer que ces exemples. Cependant, ces travaux n'ont pas été en mesure de démontrer formellement une réelle association de ces pathologies avec les spumarétrovirus, et ont été pour la plupart invalidés par des travaux plus récents [11].

Pour étudier le potentiel pathogène de ces virus en laboratoire, deux voies complémentaires ont été empruntées : l'infection d'animaux de laboratoire (souris, lapins) et l'obtention de souris transgéniques pour le virus HFV.

L'inoculation intraveineuse ou intramusculaire du HFV chez des lapins ou des souris induit une séroconversion rapide et le suivi de ces animaux montre, d'une part qu'ils sont infectables par le virus et, d'autre part, qu'ils ne révèlent aucune maladie, si ce n'est une immunodéficience transitoire quelques jours après l'infection [12, 13]. En revanche, les souris transgéniques développent une myasthénie et des syndromes neurologiques entre six et huit semaines après leur naissance. Ce phénotype, caractérisé par une ataxie, une tétraparésie spastique et, dans certains cas, par une cécité, conduit rapidement à la mort, entre quatre et six semaines après l'apparition des premiers symptômes. Les lésions sont principalement retrouvées dans le muscle strié et le système nerveux central [14]. Dans ce dernier compartiment, il semblerait que la protéine régulatrice Bet soit neurotoxique, sans doute par son motif RGD, retrouvé également dans la protéine Tat impliquée dans certains dysfonctionnements du système nerveux central [15].

Récemment, il a été décrit le cas d'un orang-outan décédé rapidement après l'apparition de symptômes ressemblant à ceux retrouvés chez ces souris transgéniques. L'examen post-mortem de l'animal a permis de révéler, outre la présence de spumarétrovirus (ce qui n'est pas original chez les primates supérieurs), la présence de lésions pathologiques dans le système nerveux central, lésions identiques à celles observées chez les souris transgéniques [16]. Bien sûr, il est impossible de conclure à partir d'un cas unique et, jusqu'à aujourd'hui, les résultats obtenus par les différents groupes de recherche ne permettent pas d'affirmer avec certitude l'innocuité des virus spumeux.

Le HFV : un virus humain ?

Après l'isolement du premier virus foamy humain à partir d'un patient atteint d'un carcinome du nasopharynx, l'étude d'une réponse immunitaire contre des spumarétrovirus a été entreprise dans l'espèce humaine. Les premiers résultats, basés sur des études d'immunofluorescence, ont montré une séroprévalence de 4 %, pouvant atteindre 9 % selon la région géographique. Dix ans plus tard, un test Elisa permettra de confirmer ces résultats et d'avancer que la prévalence mondiale moyenne se situe aux alentours de 3 %, avec un taux plus élevé en Afrique.

Cependant, des études postérieures n'ont pas confirmé ces résultats. En effet, la fausse positivité des tests immunologiques a conduit plusieurs équipes à se mettre d'accord sur des critères de positivité, ainsi que sur des méthodologies moléculaires pour l'étude des marqueurs d'infection des virus foamy. C'est ainsi qu'une étude récente, réalisée à l'aide de différentes techniques immunologiques et moléculaires sur plus de 6 000 sérums humains, a montré une prévalence nulle (quelle que soit la région géographique considérée), suggérant fortement que l'infection par des spumarétrovirus n'est pas un événement courant dans l'espèce humaine [17]. De plus, une étude moléculaire comparant les différents isolats simiens et le virus HFV a montré que ce dernier serait un variant de l'isolat du chimpanzé SFV-cpz [18].

Bien que l'infection chez l'homme soit remise en question, l'analyse de cas d'infection accidentelle de laboratoire (qui n'ont entraîné aucune maladie chez les sujets) a démontré que les humains sont infectables par HFV. Mais aucun cas de transmission inter-humaine n'a pu être montré dans l'entourage de ces personnes [19].

S'il est démontré que les spumarétrovirus ne sont pas des agents pathogènes naturels chez l'homme et qu'ils ne provoquent aucune maladie chez leurs hôtes naturels, l'élaboration de vecteurs de transfert génique à partir de ces virus pourrait être envisageable [20].

Les virus spumeux : un modèle d'infection persistante

Comme nous venons de le voir, l'une des caractéristiques des spumarétrovirus est d'induire chez leurs hôtes naturels une infection qui va persister toute la vie de l'animal. Le virus est retrouvé dans tous les organes et tissus dans lequel il a été recherché. In vitro, la réplication des spumarétrovirus conduit très rapidement à la lyse cellulaire. Néanmoins, quelques clones cellulaires résistants émergent au sein de la boîte de culture lorsque ces cellules sont conservées en culture, plusieurs jours après la lyse. L'étude du statut viral dans de telles lignées chroniquement infectées a permis de montrer que le HFV existe sous deux formes moléculaires : une souche sauvage (HFV) et une autre (DHFV) possédant une délétion de 301 paires de bases dans le gène régulateur Bel1. Cette délétion est générée par un épissage sur l'ARN génomique. Cette dernière forme ne pouvant plus coder pour le transactivateur Bel1 est défective pour la réplication, mais s'exprime en présence du virus sauvage ou de protéine Bel1 exogène [21].

Le clonage de cette délétion a permis de montrer que les extrémités de celle-ci correspondaient exactement aux sites donneur et accepteur d'épissage donnant naissance à l'ARNm bet. Cette forme défective du virus est non seulement majoritaire dans les lignées chroniquement infectées, mais également dans les modèles animaux d'infection par HFV. Cette observation suggérait fortement que le DHFV pourrait être un élément clé dans l'initiation et/ou le maintien de la persistance virale in vitro et in vivo. Notons par ailleurs que l'examen rétrospectif de la littérature et les travaux publiés par la suite ont montré que cette forme défective du virus est retrouvée chez tous les membres de la famille des spumarétrovirus, démontrant que la formation d'un tel virus est un événement important dans la biologie de ces agents viraux.

De plus, nous avons montré que des lignées cellulaires ayant intégré de manière stable le DHFV sont résistantes à la lyse induite par le virus sauvage et que l'infection conduit à l'établissement de lignées chroniquement infectées caractérisées par une très faible production de protéines structurales et un taux élevé de la protéine régulatrice Bet. Ces observations démontrent que le DHFV est un rétrovirus défectif interférant, et que la protéine Bet doit certainement jouer un rôle important dans ce phénomène d'interférence. En effet, la présence d'un virus DHFV possédant une mutation dans le cadre ouvert de lecture de la protéine Bet s'avère incapable d'induire un état de résistance à la lyse [22]. Enfin, des lignées cellulaires exprimant de manière stable cette protéine à partir d'un vecteur d'expression sont résistantes à la lyse induite par le virus sauvage.

Ces résultats nous ont permis de décrire un aspect original et unique parmi les rétrovirus : l'existence d'un ARN messager subgénomique qui n'utilise pas le site donneur d'épissage à la jonction LTR/gag classiquement utilisé chez les rétrovirus. Par ailleurs, ils permettent d'expliquer par un simple événement d'inactivation spécifique du transactivateur essentiel, provoquée par un épissage sur l'ARN génomique, comment le HFV, qui est hautement lytique, conduit à une infection persistante ; l'inactivation de gènes clés représente un nouveau mécanisme de régulation de l'expression génique chez les rétrovirus (figure 4). Dans ce contexte, il est intéressant de noter que des délétions des gènes tat et nef de VIH1 ont été retrouvées chez des patients asymptomatiques à long terme. Le rôle de ces virus défectifs dans l'évolution de la maladie reste à être évalué.

Le tableau ne serait pas complet si d'autres mécanismes moléculaires pouvant être impliqués dans la persistance virale n'étaient pas évoqués. Ainsi, il a été montré, dans un cas d'infection latente in vitro par le SFV-3 (simian foamy virus type 3), que la persistance du génome au sein de la cellule hôte était due à un blocage de la transcription des gènes viraux par méthylation des LTR (une réactivation du virus s'obtient par traitement avec des agents déméthylants). D'autres mécanismes décrits chez certains rétrovirus sont aussi envisageables, comme, par exemple, une transcription inverse incomplète, une persistance de formes virales non intégrés (latence de préintégration), une transcription incomplète du provirus (latence de post-intégration), sans oublier un effet spécifique de la cellule hôte [23].

Nous avons trouvé des similitudes de séquences avec les protéines Rev et Rex des virus VIH et HTLV. Ces protéines possèdent deux domaines essentiels : le premier, constitué d'acides aminés hydrophobes, est responsable de l'export nucléaire des ARN messagers viraux et de la fixation à des facteurs cellulaires indispensables à leur activité, l'autre intervient dans l'homopolymérisation et la fixation spécifique aux ARN viraux. Or, ces deux domaines sont retrouvés dans la protéine Bet [22]. Cependant, nous avons vu que les spumarétrovirus effectuent le passage de la phase précoce à la phase tardive de l'infection par une utilisation temporelle de deux promoteurs, le promoteur interne en 5' des gènes structuraux et le LTR. Par ailleurs, un virus HFV muté dans le gène bet se réplique comme le virus sauvage, au moins in vitro [24]. Quelle est alors la pertinence de telles similitudes protéiques ? L'obtention de mutants de Bet dans ces deux domaines et l'analyse de leurs effets vis-à-vis de l'infection par le virus sauvage permettra de mieux appréhender le mécanisme d'action de cette protéine.

Les directions futures

Les récents travaux sur les spumarétrovirus ont permis de montrer que ces virus, bien qu'appartenant à la famille des rétrovirus, s'en distinguent par plusieurs aspects. Étonnamment, ces mêmes aspects les rapprochent des hépadnavirus, illustrant ainsi une plasticité dans la réplication rétrovirale [24].

Néanmoins, plusieurs questions restent encore en suspens, comme le mode d'encapsidation de l'ARN viral (la séquence d'encapsidation n'est pas encore localisée avec précision sur le génome) ou la connaissance du récepteur viral. Par ailleurs, il serait intéressant d'étudier le rôle du bourgeonnement à partir du réticulum endoplasmique, phénomène qui, chez certains virus tels que le cytomégalovirus ou les adénovirus, permet de réguler la présence de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité et ainsi de moduler la réponse du système immunitaire de l'hôte.