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Development of a mass spectrometry-based approach for epoetin beta quantitation


Journal de Pharmacie Clinique. Volume 27, Number 3, 181-8, juillet, août, septembre, article original

DOI : 10.1684/jpc.2008.0093

Résumé   Summary  

Author(s) : F Xuereb, JM Schmitter, S Chaignepain, F Godde, N Canelo, MC Saux, D Breilh , Laboratoire de pharmacocinétique clinique EA 2968, Université Victor-Segalen–Bordeaux-II et pharmacie, Hôpital Haut-Lévêque, CHU de Bordeaux, Bordeaux, Université de Bordeaux, UMR 5248 CNRS, Université Bordeaux-I, ENITAB, Institut européen de chimie et de biologie, Pessac.

Summary : Epoetin beta is a recombinant human glycoprotein used to correct anemia in dialysis patients. When administered with dosing 30 000 to 60 000 IU per week, epoetin beta has recently shown an interest in prevention and treatment of anemia induced by cancer chemotherapy in adults with solid and liquid tumors. The development of a sensitive and specific analytical method is necessary to individualize and optimize treatments in non-responding patients, and in responders to determine effective maintenance doses. We have developed a new strategy based on mass spectrometric analysis of epoetin beta isolated after depletion of major human plasma proteins, and digested by trypsin before chemical labelling used for quantification. The first step of enrichment of epoetin beta from human plasma uses affinity chromatography to remove the seven major plasma proteins (HU-7, Agilent Technologies). Epoetin beta enriched fraction is desalted and purified by reversed phase chromatography before tryptic proteolysis. To quantify the erythropoietin, tryptic peptides obtained are labelled on lysine residues (68.03 Da increment). Epoetin beta tryptic peptides labelled by the same reagent bearing an isotopic label (72.06 Da increment) are used as internal standards for absolute quantification. In a first development phase, analysis was made in MALDI ionization mode. Analysis with an ESI-Q-TOF spectrometer identified three labelled peptides, one of which was used for quantification. This quantitative analysis strategy has two major interests, because it does not require a synthetic labelled reference peptide and this methodology can be used for the analysis of other plasma protein drugs.

Keywords : epoetin beta, anemia, mass spectrometry, peptide labelling

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ARTICLE

Auteur(s) : F Xuereb1,2, JM Schmitter2, S Chaignepain2, F Godde2, N Canelo2, MC Saux1, D Breilh1

1Laboratoire de pharmacocinétique clinique EA 2968, Université Victor-Segalen–Bordeaux-II et pharmacie, Hôpital Haut-Lévêque, CHU de Bordeaux, Bordeaux
2Université de Bordeaux, UMR 5248 CNRS, Université Bordeaux-I, ENITAB, Institut européen de chimie et de biologie, Pessac

L’anémie est fréquemment diagnostiquée chez les patients atteints de cancers, et son étiologie est multifactorielle. L’anémie, induite par les traitements myélosuppresseurs tels que la radiothérapie et la plupart des chimiothérapies cytotoxiques, occupe une place importante. Le traitement de choix actuellement est l’érythropoïétine (EPO) humaine recombinante (époétine alpha [EPO α], époétine bêta [EPO β]) ou la darbépoétine alpha. Mais l’EPO, communément utilisée pour le traitement de l’anémie chez les patients insuffisants rénaux chroniques, est une thérapie coûteuse, et tous les patients ne répondent pas au traitement [1, 2]. La dose initiale d’EPO β recommandée est de 30 000 unités internationales (UI) par semaine administrée par voie sous-cutanée en une fois ou répartie en 3 à 7 injections, les deux modalités d’administration ayant la même efficacité [3, 4]. La dose initiale peut être doublée après 4 semaines de traitement chez les patients non répondeurs [5].

Parmi les patients non répondeurs (40 % en moyenne), après un mois de traitement, 28 % ont obtenu une réponse complète avec une double dose d’EPO humaine recombinante. Cependant, les risques d’accidents thromboemboliques et d’hypertension artérielle sont élevés avec les doses importantes d’EPO employées chez les patients cancéreux [1, 2], et aucune étude n’a examiné l’effet d’un traitement sur une longue période à la dose initiale [1, 2]. Malgré l’utilisation croissante en cancérologie de l’EPO humaine recombinante à forte dose une fois par semaine sans effets secondaires sérieux [6], peu de données pharmacocinétiques sont disponibles [7].

C’est pourquoi, la mise au point d’une méthode de dosage plasmatique sensible et spécifique de l’EPO humaine recombinante s’impose pour individualiser et optimiser les traitements chez les patients non répondeurs, mais aussi chez les répondeurs pour déterminer les doses d’entretien efficaces. Un traitement par EPO recombinante humaine bien conduit permet de diminuer les effets secondaires, de réduire significativement le recours à la transfusion de globules rouges, d’améliorer la qualité de vie [2] et de réduire le risque de progression des tumeurs chez les patients cancéreux [4]. La concentration plasmatique maximale (Cmax) d’EPO β attendue dans le plasma après une injection sous-cutanée (SC) de 36 000 UI est de l’ordre de 2 000 mUI/mL, soit 0,5 fmol d’EPO/μL de plasma, l’EPO β ayant une pharmacocinétique linéaire de 9 000 à 36 000 UI administrées [7]. Ainsi, les Cmax attendues suite à des injections SC de 30 000 à 60 000 UI d’EPO β en cancérologie seront de l’ordre de 0,5 à 1 fmol d’EPO/μL de plasma, une concentration qui peut correspondre aux seuils de quantification actuels par spectrométrie de masse, à condition de mettre en place une stratégie d’analyse adaptée au dosage en milieu plasmatique.

Intérêt de la spectrométrie de masse pour la quantification des protéines médicaments

Le dosage des EPO humaines recombinantes dans le sérum, le plasma hépariné et l’urine est effectué habituellement par des techniques immunologiques de type immunoassay. Les techniques couramment utilisées pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques de ces médicaments sont des techniques immunologiques de type enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) et radioimmunoassay (RIA) ou très rarement des techniques de bioassay (mesure de prolifération d’une lignée cellulaire induite par l’EPO) [8, 9]. Cependant, les techniques d’immunoassay précises et rapides pour détecter l’EPO in vitro présentent sur des échantillons de sérum ou de plasma humain un manque de spécificité. En effet, des faux-positifs peuvent apparaître si la liaison de l’anticorps s’effectue sur une protéine autre ou inactive [10, 11], et des auto-anticorps résultant de l’administration répétée des protéines thérapeutiques peuvent engendrer des interférences analytiques [12]. La technique Elisa est employée pour rechercher rapidement, dans des échantillons plasmatiques ou urinaires équins lors de contrôles antidopage, la présence d’EPO recombinante humaine. En revanche, cette technique ne peut être utilisée pour confirmer la présence à cause de la possibilité de réaction croisée [13]. Par ailleurs, les techniques d’immunoblot utilisées pour doser l’EPO humaine recombinante plus particulièrement dans les urines détectent des faux-positifs dans certains échantillons d’urines riches en protéines, car les anticorps monoclonaux utilisés ne sont pas exactement spécifiques à l’EPO thérapeutique à quantifier [14]. Ainsi, ces différences de spécificité et de sensibilité avec lesquelles les anticorps reconnaissent l’EPO peuvent engendrer une mauvaise reproductibilité des dosages.

Le choix de la technique d’analyse s’est porté sur la spectrométrie de masse qui est une méthode de référence en protéomique en raison de sa grande reproductibilité, de sa sensibilité, de sa spécificité, de la large gamme de masse analysable, de l’exactitude et de la précision des mesures [8, 15]. En raison de la sensibilité supérieure de l’analyse des peptides par spectrométrie de masse par rapport à celle des protéines entières, nous avons d’emblée choisi de soumettre l’EPO β à une digestion protéolytique et de faire reposer la méthode de quantification sur l’analyse de peptides trypsiques [16, 17].

Plusieurs stratégies de dosage de peptides par spectrométrie de masse sont actuellement possibles. L’une des mieux établies utilise une solution commerciale : Protein Aqua™ (Sigma-Aldrich), qui requiert comme étalon interne un peptide issu de la protéine portant un marquage isotopique stable (la synthèse à façon de ce peptide est un service assuré par Sigma-Aldrich). L’analyse par spectrométrie de masse permet de quantifier la protéine d’intérêt par comparaison des hauteurs relatives du pic du peptide à doser et de celui de l’étalon interne, qui possède un écart de masse de 6 à 10 Da [18-20].

En dehors des considérations de coût de cette méthodologie, nous avons choisi une approche à caractère plus universel en utilisant une stratégie de marquage chimique des peptides comportant des résidus lysine, grâce à un réactif synthétisé au laboratoire dans une version légère (D0) et une version deutérée (D4). L’ensemble des peptides trypsiques de l’EPO β portant une lysine au C-terminal et contenus dans l’échantillon plasmatique est modifié par le réactif D0. Une solution aqueuse standard interne de peptides trypsiques d’EPO β modifiés par le réactif D4 est ajoutée en quantité dosée à l’échantillon plasmatique, fournissant ainsi un choix élargi de standards pour la quantification.

Cependant, la quantification d’un médicament protéique tel que l’EPO humaine recombinante dans le plasma humain est une tâche ardue. En effet, le rapport entre la quantité estimée de protéines plasmatiques dans l’échantillon à analyser, de l’ordre de 884 000 fmol de protéines/μL de plasma et la quantité attendue d’EPO β, de l’ordre de 0,5 à 1 fmol/μL de plasma est très important [7]. En conséquence, il est indispensable de procéder à une première étape d’enrichissement de l’EPO β à partir de plasma humain. Nous avons choisi de réaliser une déplétion des protéines majeures par chromatographie d’affinité [21], puis de procéder à une purification par chromatographie à polarité de phase inversée avant la digestion trypsique et le marquage chimique et isotopique permettant la quantification.

Matériel et méthodes

Enrichissement du plasma en EPO β

Un volume de 12 μL de plasma humain contenant de l’EPO β est enrichi en EPO β au moyen d’une cartouche de 0,45 mL, permettant la déplétion des protéines plasmatiques majoritaires (Spin Cartridge HU-7®, Agilent Technologies). Cette immunodéplétion a pour cible sept protéines majoritaires du plasma (albumine, immunoglobuline G, immunoglobuline A, transferrine, haptoglobine, antitrypsine et fibrinogène), ce qui correspond à environ 90 % du total des protéines plasmatiques. L’échantillon introduit dans la cartouche est lavé par centrifugation (3 étapes de 2,5 minutes à 100 g) avec 1 mL de tampon A Agilent (solution de sel de phosphate à pH 7,4 contenant 0,02 % de NaN3), éluant les protéines minoritaires du plasma non retenues ainsi que l’EPO β, alors que les 7 protéines majoritaires sont retenues par la cartouche. Les protéines majoritaires du plasma retenues par la cartouche sont éluées par 3 mL de tampon B Agilent (solution aqueuse d’urée concentrée à pH 2,25) puis éliminées et la cartouche rééquilibrée avec 1 mL de tampon A. La même cartouche d’affinité peut être réutilisée 200 fois.

Purification par chromatographie à polarité de phase inversée

L’EPO β collectée en sortie de la cartouche HU-7 est dessalée et purifiée par chromatographie en phase liquide à polarité de phase inversée (colonne Aquapore C4 Brownlee BU-300 particules de 7 μm, 30 × 2,1 mm [Perkin Elmer]) en mode gradient (débit de 0,2 mL/min de 0 à 90 % d’éluant B en 10 minutes ; éluant A : 0,05 % acide trifluoroacétique [TFA], éluant B : acétonitrile 80 %/isopropanol 20 % vol/vol avec 0,05 % de TFA). L’EPO β est détectée par son absorbance à 280 nm dans la fraction de 11 à 13 minutes qui est collectée puis concentrée à 50 μL par évaporation sous vide (SpeedVac, Savant).

Protéolyse par la trypsine

L’échantillon de 50 μL obtenu après évaporation est traité pendant 4 heures à 37 °C avec 9,76 pmol de trypsine porcine (Sigma) en milieu tamponné (NH4HCO3 100 mM pH 8).

Modification chimique des peptides

Parmi les peptides trypsiques obtenus, les peptides porteurs de lysines terminales font l’objet d’une réaction chimique entre le groupement ε-NH2 terminal de leurs lysines et le réactif léger D0 (2-méthoxy-4,5-dihydro-imidazole), qui conduit à une augmentation de la masse du peptide de 68,03 Da. L’échantillon plasmatique d’EPO β est traité avec un volume équivalent de réactif D0 en solution aqueuse de 0,8 M pendant 3 heures à 55 °C. La réaction est arrêtée par ajout de TFA (1 μL de TFA pour 10 μL de réactif D0 à 0,8 M). La solution étalon interne est préparée dans les mêmes conditions à partir d’une solution aqueuse d’EPO β digérée par la trypsine et traitée par du réactif lourd D4 (incrément de masse de 72,06 Da par lysine modifiée). Une quantité constante d’étalon interne est ajoutée à l’échantillon plasmatique d’EPO β avant l’analyse par spectrométrie de masse.

Spectrométrie de masse

Le mode d’ionisation Maldi a été utilisé pour la phase de mise au point de la stratégie d’analyse. Les peptides trypsiques marqués sont dessalés par microchromatographie sur ZipTip C18 (Millipore) et élués dans un volume final de 2 μL d’une solution acétonitrile/eau 7/3 avec 0,1 % de TFA. 0,9 μL de solution de peptides trypsiques (purifiés et concentrés sur ZipTip) est mélangé à un volume équivalent d’une solution de matrice (acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (Sigma) à 3,6 mg/mL dans acétonitrile/eau 1/1 avec 0,1 % de TFA. Le mélange est déposé sur une cible Maldi à 96 puits (Waters). Après séchage à température ambiante, l’analyse est réalisée avec un spectromètre Maldi-Q-ToF Premier (Waters) [22].

Le spectromètre de masse utilisé pour le dosage quantitatif de l’EPO β marquée est un ESI-Q-ToF micro (Waters) couplé à une nanochromatographie comprenant une colonne C18 (colonne Atlantis 75 μm × 150 mm, particules de 3 μm, Waters). L’ionisation dans la source électrospray est effectuée en mode positif.

Résultats

Purification de l’EPO β

L’étude est menée parallèlement sur trois échantillons : une référence ne contenant que de l’EPO β en solution aqueuse, un échantillon de plasma humain non surchargé en EPO β, mais contenant de l’EPO endogène aux concentrations physiologiques, et un échantillon de plasma humain surchargé avec une quantité connue d’EPO β. L’analyse de l’EPO β de référence a permis de vérifier l’absence de pertes sur la cartouche d’affinité HU-7 et de déterminer le temps de rétention du médicament sur la colonne de chromatographie en phase inverse. Cette étape de chromatographie permet le dessalage de l’échantillon, nécessaire en sortie de cartouche HU-7, tout en fournissant une purification supplémentaire (figures 1 et 2 haut).

Marquage isotopique et analyse par spectrométrie de masse Maldi

Le réactif utilisé (2-méthoxy-4,5-dihydro-imidazole) est spécifique des groupements ε-NH2 des résidus lysine, tout en ne modifiant pas les groupements NH2 terminaux des peptides [23]. Ce réactif a été synthétisé au laboratoire dans une version légère (réactif D0, isotope 1H) qui provoque un incrément de masse de 68,03 Da de chaque lysine modifiée. Une version lourde de ce réactif a également été préparée (réactif D4, isotope 2H, incorporation de 4 deutérons dans la molécule), produisant un incrément de masse de 72,06 Da par lysine modifiée.

L’étalon interne destiné au dosage quantitatif est préparé parallèlement à l’échantillon biologique : il s’agit d’une solution aqueuse d’EPO β digérée par la trypsine puis marquée par le réactif D4. La quantification absolue de l’EPO β est réalisée par la mesure des hauteurs relatives des signaux en spectrométrie de masse des peptides trypsiques sous leurs formes D0 et D4 [24]. En mode Maldi, les peptides modifiés sont détectés sous formes d’espèces monochargées produisant des doublets séparés de 4 unités de masse (spectres non présentés). Lorsque le mode ESI est utilisé, les peptides trypsiques sont surtout détectés sous forme d’espèces doublement chargées [25] ; l’écart entre les pics servant à la quantification est alors de 2 unités de masse (figure 3 haut).

La spectrométrie de masse Maldi-Q-ToF a été utilisée durant la première phase de mise au point de l’extraction de l’EPO β du plasma. Cette technique est intéressante par sa rapidité d’analyse liée au mode d’ionisation laser direct de l’échantillon déposé sur la cible et sa capacité à traiter automatiquement des séries allant jusqu’à 96 échantillons. L’empreinte peptidique de l’EPO β, ainsi obtenue avec une solution aqueuse de référence pour un dépôt de 1 200 fmol sur la cible Maldi, présente trois peptides marqués caractéristiques (figure 1 bas) ; l’écart avec les masses théoriques des peptides trypsiques de l’EPO β ne dépasse pas 5 ppm (tableau 1), et les séquences de ces peptides ont été vérifiées à l’aide des ions fragments obtenus en mode MS/MS [26]. Cette analyse a permis de déterminer, pour l’instrumentation Maldi-Q-ToF, une limite de détection d’environ 0,70 fmol d’EPO β/μL d’une solution aqueuse diluée de peptides trypsiques [27], voisine des concentrations plasmatiques maximales attendues pour l’EPO β utilisée en cancérologie [7].

L’analyse en mode Maldi-Q-ToF de l’échantillon plasmatique d’EPO β a été effectuée après l’indispensable étape d’immunodéplétion des protéines majoritaires du plasma. Conformément à l’attente, la chromatographie en polarité de phase inversée montre, dans la zone de 11 à 13 minutes, un pic d’intensité très supérieur à celui de l’EPO β de l’échantillon de référence, en raison de la présence des autres protéines plasmatiques non retenues par la colonne HU-7. La fraction de 11 à 13 minutes collectée, soumise à la trypsinolyse puis analysée par Maldi-Q-ToF (figure 2 bas), ne montre plus qu’un seul peptide marqué d’EPO β (masse : 995,512 Da, figure 1 bas) parmi de nombreux autres peptides provenant en majorité du plasma. Ce phénomène de désorption-ionisation sélectives est caractéristique du mode Maldi dans le cas de mélanges complexes de peptides [28].

De plus, l’analyse d’un plasma humain non surchargé en EPO β, préparé et analysé dans les mêmes conditions, a révélé que le signal à m/z 995,512 Da est absent. Ce peptide marqué de m/z 995,512 Da apparaît ainsi comme le seul peptide permettant le dosage du médicament en mode Maldi-Q-ToF, ainsi que l’a confirmé la vérification de sa séquence en mode MS/MS.

Tableau 1 Peptides trypsiques de l’époétine bêta détectés par spectrométrie de masse Maldi-Q-ToF en mode MS après marquage chimique.

Position dans la séquence

  • Masse théorique
  • (Da)


  • Masse expérimentale
  • (Da)


15-20

804,461

804,465

46-52

995,509

995,514

46-53

1151,610

1151,616

Couplage chromatographie en phase liquide/spectrométrie de masse ESI

Le spectre de masse Maldi, présenté en figure 2 (en bas), montre l’extrême complexité d’un échantillon plasmatique d’EPO β malgré les étapes d’enrichissement par immunodéplétion et chromatographie en phase inversée. Cette complexité, s’ajoutant au fait que nous ne disposions que d’un seul peptide pour la quantification, nous a amenés à continuer le développement de la méthode d’analyse avec une autre technique de spectrométrie de masse faisant appel au couplage entre la nanochromatographie et une instrumentation ESI-Q-ToF. La nanochromatographie sur colonne de 75 μm de diamètre interne associée au mode d’ionisation ESI permet d’abaisser considérablement le seuil de détection par rapport aux colonnes de chromatographie de diamètres conventionnels (> 1 mm), et permet de s’affranchir de la majeure partie des phénomènes de désorption-ionisation sélectives lors de l’analyse de mélanges complexes de peptides [29].

Après modification chimique des peptides trypsiques issus d’un échantillon plasmatique surchargé en EPO β, trois peptides à lysine terminale de l’EPO sont détectés avec une bonne intensité. Ces trois peptides mis en évidence sur l’échantillon d’EPO de référence sont absents d’un plasma non surchargé en EPO β, préparé et analysé dans les mêmes conditions (spectres non présentés). Le plus abondant, obtenu dans l’échantillon plasmatique et retenu pour la quantification, est présenté dans la figure 3 dans sa version non marquée (figure 3 bas) et dans sa version marquée par D0 et par D4 (figure 3 haut).

Cependant, la limite de détection que nous obtenons actuellement lors de l’analyse d’un échantillon plasmatique d’EPO β, associant notre stratégie de marquage peptidique à chacune des deux techniques de spectrométrie de masse utilisées pour ces premiers travaux, est de 150 fmol d’EPO β/μL de plasma, ce qui est encore insuffisant.

Discussion et perspectives

La technique de spectrométrie de masse Maldi-Q-TOF a permis de mettre au point une stratégie intéressante de préparation de l’échantillon plasmatique d’EPO β en vue du marquage isotopique et de la quantification du médicament. L’étape de déplétion des protéines plasmatiques majeures est indispensable au dosage, et nous avons démontré qu’elle ne conduisait pas à des pertes significatives d’EPO β : le risque que l’EPO β se fixe aux protéines plasmatiques paraît ainsi limité. Les étapes de dessalage et purification par chromatographie à polarité de phase inversée suivies d’une concentration sont également nécessaires pour amener l’échantillon dans de bonnes conditions à la spectrométrie de masse. La trypsine, seule enzyme protéolytique que nous avons testée, présente l’avantage de générer des peptides avec des acides aminés basiques (lysine et arginine) en C-terminal assurant une bonne ionisation du peptide et permettant une bonne efficacité de fragmentation en mode MS/MS pour confirmer l’identité du peptide. La trypsine génère de plus des peptides à lysine terminale, cible de notre réactif de marquage. Le procédé de marquage chimique introduit une étiquette isotopique propice au marquage quantitatif sur la base de plusieurs peptides. Cependant, sur les trois peptides marqués obtenus dans l’échantillon de référence, un seul présente une bonne efficacité d’ionisation permettant sa détection pour de très faibles concentrations d’EPO β dans le plasma. Plusieurs peptides ne permettraient pas d’obtenir une meilleure sensibilité, car le peptide servant de base à la quantification est le plus abondant ; en revanche, plusieurs peptides abondants permettraient de rendre plus fiable la quantification [20].

Malgré son exactitude de mesure, sa bonne sensibilité et sa rapidité d’analyse, la méthodologie Maldi-Q-ToF ne permet pas d’obtenir une sensibilité suffisante pour atteindre le seuil de quantification fixé pour un dosage de l’EPO aux concentrations plasmatiques attendues en thérapeutique. La principale limitation rencontrée est ici liée à un phénomène de désorption-ionisation sélectives dû à la complexité du mélange des protéines plasmatiques.

La technique de couplage entre nanochromatographie et un instrument ESI-Q-ToF est mieux adaptée à l’identification et la quantification d’espèces dans un mélange complexe tel que le plasma, grâce à la sélectivité introduite par la chromatographie. Néanmoins, cette approche instrumentale a également montré ses limites, dans la mesure où il n’a pas été possible d’atteindre un seuil de détection permettant de doser l’EPO β aux concentrations plasmatiques attendues en cancérologie.

Les améliorations visant à abaisser la limite de détection de l’EPO β peuvent intervenir à différents stades de la stratégie mise en place.

La première action possible consiste à augmenter la taille de l’échantillon plasmatique analysé par l’utilisation d’une colonne de déplétion des protéines majoritaires du plasma de plus grande capacité permettant la déplétion de 14 protéines plasmatiques et le traitement de 300 μL d’échantillon de plasma humain [30]. Ce changement d’échelle de l’étape de déplétion nous ferait donc gagner un facteur 25 par rapport à la méthode actuelle.

La deuxième possibilité consiste à modifier l’étape de chromatographie en phase inversée en effectuant une meilleure séparation entre les différentes protéines plasmatiques et l’EPO. Une colonne plus longue et de plus grande capacité de charge sera par ailleurs une nécessité pour prendre en compte le changement d’échelle de l’étape de déplétion.

Enfin, le troisième niveau d’amélioration réside dans le choix d’un instrument de spectrométrie de masse fonctionnant sur le principe d’un triple quadrupôle, permettant de réaliser des analyses en mode Multiple Reaction Monitoring (MRM), pour effectuer l’analyse à haute sensibilité de multiples transitions entre ions précurseurs et ions fragments en mode MS/MS [31]. En effet, une meilleure sensibilité est attendue avec ce mode d’analyse par rapport à celui d’un hybride de type Q-ToF lorsqu’il s’agit de dosage dans un milieu protéique complexe tel que le plasma. De même, une technologie telle que l’Orbitrap® (Thermo Scientific) permettrait d’atteindre une résolution supérieure à celle d’un instrument de type Q-ToF, mais la sensibilité resterait inférieure à celle d’un instrument fonctionnant en mode MRM avec une sélection d’ions précurseurs effectuée par un quadrupôle. Un premier essai de quantification par MRM nous a permis d’obtenir une limite de détection de l’ordre de 50 attomoles de peptide de l’EPO β.

La stratégie d’analyse présentée pour l’EPO, déjà applicable à la quantification absolue dans le plasma de médicaments protéiques dont les concentrations plasmatiques attendues sont supérieures à celles de l’EPO β, pourra alors être appliquée à l’analyse de toute protéine d’intérêt thérapeutique.

Références

1 Bokemeyer C, Aapro MS, Courdi A, Foubert J, Link H, Osterborg A, et al. EORTC guidelines for use of erythropoietic proteins in anaemic patients with cancer. Eur J Cancer 2004 ; 40 : 2201-16.

2 Bokemeyer C, Aapro MS, Courdi A, Foubert J, Link H, Osterborg A, et al. EORTC guidelines for the use of erythropoietic proteins in anaemic patients with cancer : 2006 update. Eur J Cancer 2007 ; 43 : 258-70.

3 Glaspy J, Beguin Y. Anemia management strategies : optimizing treatment using epoetin beta (Neorecormon®). Oncologist 2005 ; 69 : 8-16.

4 Prontazo P, Jassem J, Mayordomo J. Epoetin beta therapy in patients with solid tumors. Crit Rev Oncol Hematol 2006 ; 58 : 46-52.

5 Logiciel Vidal expert 2007.

6 Suzuki Y, Tokuda Y, Fujiwara Y, Minami H, Ohashi Y, Saijo N. Weekly epoetin beta maintains haemoglobin levels and improves quality of life in patients with non-myeloid malignancies receiving chemotherapy. Jpn J Clin Oncol 2008 ; 38 : 214-21.

7 Fujisaka Y, Tamura T, Ohe Y, Kunitoh H, Sekine I, Yamamoto N, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of weekly epoetin beta in lung cancer patients. Jpn J Clin Oncol 2006 ; 36 : 477-82.

8 Tang L, Persky AM, Hochhaus G, Meibohm B. Pharmacokinetic aspects of biotechnology products. J Pharm Sci 2004 ; 93 : 2184-204.

9 Wei X, Grill DS, Heatherington AC, Swanson SJ, Gupta S. Development and validation of a quantitative cell-based bioassay for comparing the pharmacokinetic profiles of two recombinant erythropoietic proteins in serum. J Pharm Biomed Anal 2007 ; 43 : 666-76.

10 Vrolijk JM, Kaul A, Hansen BE, Lohmann V, Haagmans BL, Schalm SW, et al. A replicon bioassay for the measurement of interferons in patients with chronic hepatitis C. J Viral Methods 2003 ; 110 : 201-9.

11 Stanley SMR, Poljak A. Matrix-assisted laser-desorption time-of flight ionisation and high-performance liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectral analyses of two glycosylated recombinant epoetins. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2003 ; 785 : 205-18.

12 Findlay JW, Smith WC, Lee JW, Nordblom GD, Das I, DeSilva BS, et al. Validation of immunoassays for bioanalysis : a pharmaceutical industry perspective. J Pharm Biomed Anal 2000 ; 21 : 1249-73.

13 Guan F, Uboh CE, Soma LR, Birks E, Chen J, You Y, et al. Differentiation and identification of recombinant human erythropoietin and darbepoietin alfa in equine plasma by LC-MS/MS for doping control. Anal Chem 2008 ; 80 : 3811-7.

14 Beullens M, Delanghe JR, Bollen M. False-positive detection of recombinant human erythropoetin in urine following strenuous physical exercise. Blood 2006 ; 107 : 4711-3.

15 Yang Z, Hayes M, Fang X, Daley MP, Ettenberg S, Tse FL. LC-MS/MS approach for quantification of therapeutic proteins in plasma using a protein internal standard and 2D-solid-phase extraction cleanup. Anal Chem 2007 ; 79 : 9294-301.

16 Assedat B, Sagan S, Chassaing G, Bolbach G, Burlina F. Quantification of the efficiency of cargo delivery by peptidic and pseudo-peptidic Trojan carriers using Maldi-TOF mass spectrometry. Biochim Biophys Acta 2006 ; 1758 : 375-83.

17 Dubois M, Fenaille F, Clement G, Lechmann M, Tabet JC, Ezan E, et al. Immunopurification and mass spectrometric quantification of the active form of a chimeric therapeutic antibody in human serum. Anal Chem 2008 ; 80(5) : 1737-45.

18 http ://www.sigmaaldrich.com/Area of Interest/Life Science/Proteomics and protein Expr/Protein analysis/Mass spectrometry/Protein AQUA/Protein AQUA Strategy.html consulté le 05/06/2008.

19 Heudi O, Barteau S, Zimmer D, Schmidt J, Bill K, Lehmann N, et al. Towards absolute quantification of therapeutic monoclonal antibody in serum by LC-MS/MS using isotope-labeled antibody standard and protein cleavage isotope dilution mass spectrometry. Anal Chem 2008 ; 80 : 4200-7.

20 Havlis J, Shevchenko A. Absolute quantification of proteins in solutions and in polyacrylamide gels by mass spectrometry. Anal Chem 2004 ; 76 : 3029-36.

21 Wu WW, Wang G, Baek SJ, Shen RF. Comparative study of three proteomic quantitative methods, DIGE, cICAT, and iTRAQ, using 2D Gel- or LC-Maldi TOF/TOF. J Proteome Res 2006 ; 5 : 651-8.

22 Marvin LF, Roberts MA, Fay LB. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clin Chim Acta 2003 ; 337 : 11-21.

23 Peters EC, Horn DM, Tully DC, Brock A. A novel multifunctional labeling reagent for enhanced protein characterization with mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2001 ; 15 : 2387-92.

24 Qiu H, Wang Y. Quantitative analysis of surface plasma membrane proteins of primary and metastatic melanoma cells. J Proteome Res 2008 ; 7 : 1904-15.

25 Kebarle P. A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry. J Mass Spectrom 2000 ; 35 : 804-17.

26 http ://www.expasy.org/cgi-bin/peptide-mass.pl/EPO_HUMAN entry name P01588. consulté le 20/06/2006.

27 Colgrave ML, Jones A, Craik DJ. Peptide quantification by matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry : investigations of the cyclotide kalata B1 in biological fluids. J Chromatogr A 2005 ; 1091 : 187-93.

28 Belghazi M, Bathany K, Hountondji C, Grandier-Vazeille X, Manon S, Schmitter JM. Analysis of protein sequences and protein complexes by Maldi mass spectrometry. Proteomics 2001 ; 1 : 946-54.

29 Koomen JM, Zhao H, Li D, Nasser W, Hawke DH, Abbruzzese JL, et al. Diagnostic protein discovery using liquid chromatography/mass spectrometry for proteolytic peptide targeting. Rapid Commun Mass Spectrom 2005 ; 19 : 1624-36.

30 http ://www.chem.agilent.com consulté le 09/06/2008.

31 Janecki DJ, Bemis KG, Tegeler TJ, Sanghani PC, Zhai L, Hurley TD, et al. Multiple reactions monitoring method for absolute quantification of the human liver alcohol dehydrogenase ADH1C1 isoenzyme. Anal Biochem 2007 ; 369 : 18-26.


 

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