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Du prélèvement au dosage : réflexions sur les problèmes posés par la mesure des glucides non structuraux chez les végétaux li


Cahiers Agricultures. Volume 12, Number 6, 369-86, Novembre-Décembre 2003, Synthèse


Résumé   Summary  

Author(s) : Laurent Gomez, Marie‐Odile Jordan, Stéphane Adamowicz, Hugues Leiser, Loïc Pagès , Unité de recherche des plantes et systèmes de culture horticoles INRA, Domaine de St Paul Site Agroparc 84914 Avignon cedex 9 <Gomezavignon.inra.fr> .

Summary : From sampling to measurement: a few thoughts about non structural carbohydrates analysis in woody plants.The carbon budget of woody plants has recently become a main goal for plant physiologists. Many studies deal with the way it is affected by climate (temperature or CO 2 levels) or culture conditions (fertilization or water availability). Therefore, the needs for the chemical determination of non structural carbohydrates (NSC) in all the plant organs have strongly increased during the last decade. We intend here to assess the existing methods and analytical procedures currently available with regard to the biochemical and size specificities of woody plants and to the diversity of experimental goals and constraints. Non structural carbohydrates are defined as the sum of starch and sugars soluble in the water present in the cell (hereafter SS). They appear to be very sensitive to degradation by heating or enzymatic transformation, and therefore request important precautions throughout the analytical pathway. Each step of the procedure is detailed and evaluated. The preparation of the sample has to be precisely described since parameters such as sample size, sampling hour and duration, delay before refrigeration affect the final results. Sampling induces a stress which modifies the metabolism of the plant. These perturbations can be limited by cooling, or by freezing (sample immersion) in liquid nitrogen. It must be followed by drying, which is the only way of completely stopping the metabolism of the cell and of avoiding the further degradation of the biochemical compounds. Indeed, some enzymes like invertase are active at ‐‐20°C. The most used, and less damaging, method is freeze‐drying as the combination of vacuum and of low temperature avoids irreversible biochemical changes. Conversely, during hot‐drying, NSC composition can be modified by enzymatic catabolism, starch or sucrose hydrolysis and by browning which occurs above 50°C. Thawing increases those risks since the cell walls have previously been broken by freezing. However, freeze‐drying does not perform a complete water extraction, even when the temperature is increased to 40°C at the end of the process. The accuracy of the chemical determinations depends on the fineness of grinding. For good results in starch analysis, particles have to be smaller than 45 µm. Using a ball grinder which allows the temperature to be kept low by immersing the plant material and bowls in liquid nitrogen is a good method. If the sample could not be dried before grinding, special attention must be given to this last point to avoid thawing and subsequent sample degradation. During storage, the plant material is rehumidified. For instance, peach tree powder, stored during 3 months at ‐ 80°C in airtight pillboxes, took in 1% water. Therefore storage duration before analysis should be limited. Soluble sugar determination is rather sophisticated in woody plants since the different organs exhibit highly variable concentrations and matrix effects. The diversity of the existing methods reflects the diversity of the problems which have to be solved during SS extraction. This first step, leading to supernatant (SS)\residue (starch) separation, is achieved through decantation after soaking, rarely after percolation. Complete SS extraction is generally obtained by repeatedly soaking dried aliquots ( 200 mg) in a volume of solvent which varies from 2 to 35 mL. Accurate and reproducible results may be obtained with only 50 mg of dried aliquot. The extraction medium is sometimes pure water, but it often contains alcohol which avoids biochemical contamination and furthurs the solubilisation of oligosides whose molecular weight is lower than 2,000. Alcohol concentration ranges from 40 to 90% (70‐80%, most usual). Extraction methods also differ by temperature (+ 4°C to 100°C), duration (10 min to 20h) and number (2 to 5) of soaking periods. Next, the supernatant is purified, according to the needs of the chemical determination process. Phenols and pigments are usually eliminated either by chloroform extraction, trapping by polyvinylpyrrolidon (PVP) or animal charcoal. Exchanging ion resin is also used, especially when compounds other than sugars are also determined. Several determination methods are available: enzymatic methods are sensitive and adapted to selective sugar determination and do not request a strong purification of the supernatant. Their use is in constant increase due to their automation and miniaturization; liquid and gas chromatography require a previous preparation of the supernatant. In GC, sugars are transformed into volatile components by derivatization. In HPLC, a severe purification of the supernatant is requested since additional compounds could interfere with chromatogram resolution. These constraints are however compensated by the complete and concomitant quantification of each sugar; colorimetric methods usually allow soluble sugars to be globally determined. But their use tends to decrease in spite of their easy use, complete automation and lower costs. The elimination of phenols in the supernatants before colorimetric resolution is essential. The anthrone method which can be used on alcoholic extracts, is the most currently implemented, in spite of the fact that polyols are not accounted for and although its sensibility depends on the nature of the soluble sugar mixture concerned. Starch determination is usually obtained by glucose determination following starch hydrolysis. Generally, it has to be performed on the residues remaining after soluble sugar extraction even if this step is not indispensable. Starch solubilization is preferably done by autoclaving (1 h, 1 bar, 120°C) as it is softer and more respectful of sample structure than a chemical attack (acid or basic) which could release glucose from the cellulose or hemicellulose chains. For depolymerization, the enzymatic method, which is specific to starch, has to be preferred to an acid or an alcalin hydrolysis. Amyloglucosidase, for which well purified extracts are now available, is often used on its own as a depolymerisation enzyme. The resulting glucose can then be quantified by an enzymatic method. Thus, the results are more accurate than those of colorimetric methods, or those of more expensive and time‐consuming chromatographic methods.

Keywords : Methodology\; Analysis techniques\; Vegetal production.

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ARTICLE

Auteur(s) : Laurent Gomez, Marie-Odile Jordan, Stéphane Adamowicz, Hugues Leiser, Loïc Pagès

Unité de recherche des plantes et systèmes de culture horticoles INRA, Domaine de St Paul Site Agroparc 84914 Avignon cedex 9
<Gomez@avignon.inra.fr>

La réalisation de bilans nutritionnels, l’étude des mécanismes de la régulation, de l’absorption, du transport et de l’allocation des assimilats carbonés, ou encore de la gestion des réserves glucidiques, nécessitent le dosage des glucides non structuraux (GNS). Dans le cadre de nos recherches écophysiologiques, nous réalisons ainsi chaque année plus d’un millier de bilans glucidiques. Ces analyses portent sur tout ou partie de la plante à différents stades phénologiques (états de développements de l’arbre caractérisés par l’observation visuelle d’un organe) et concernent plusieurs espèces ligneuses fruitières (pêcher, prunier, tomate, kiwi, goyavier fraisier, caféier, etc.). On distingue d’une part les sucres solubles dans l’eau (SS), présents dans la cellule au niveau du cytoplasme et des vacuoles, dans la sève élaborée, et participant au métabolisme intermédiaire et, d’autre part, les sucres dit de réserve, généralement assimilés à l’amidon chez les ligneux. Bien que couramment pratiqué, leur dosage reste souvent problématique. Nous y voyons deux raisons essentielles :
• Les analyses des GNS concernent l’ensemble des parties ligneuses de la plante. La diversité biochimique, intra- et a fortiori inter-espèces végétales, confère à la structure des échantillons un effet matriciel aléatoire, interférant avec la détermination des sucres. Les chercheurs ont multiplié les méthodologies propres à résoudre ponctuellement leur problématique en considérant notamment la taille, la variabilité phénotypique et la nature des constituants biochimiques des échantillons. Les procédures ainsi élaborées sont généralement longues et complexes. La lourdeur des moyens mis en œuvre impose souvent un compromis entre les attendus scientifiques de l’expérimentation et les disponibilités humaines, techniques ou financières. Ainsi les méthodes de dosage, sont choisies en fonction des objectifs scientifiques mais également des possibilités humaine et matérielle, et de l’histoire scientifique du laboratoire.
• Les sucres sont des composés relativement instables dans un milieu biochimique actif (influences enzymatique et hormonale). La fragilité de l’état glucidique d’un échantillon ligneux génère des contraintes expérimentales destinées à préserver son intégrité.
Par conséquent, la fréquente complexité des méthodes de dosages des GNS chez les ligneux est en grande partie liée à la préparation d’extraits glucidiques et à l’élimination des interférences matricielles sans altérer l’intégrité des sucres. La volonté d’établir un bilan qualitatif et quantitatif des GNS conduit à considérer la procédure expérimentale dans son ensemble, de la collecte des échantillons au dosage, en passant par le broyage et le stockage.
Après une présentation rapide des notions de SS, de sucres de réserves mobilisables à court ou à long terme, nous proposons donc de faire un bilan comparatif, exhaustif, des procédures de dosages des GNS, disponibles chez les ligneux.

Caractérisation des glucides non structuraux

Les sucres constituent à la fois la principale réserve d’énergie et la plus importante source de carbone pour la construction des tissus végétaux. La plante s’assure une disponibilité permanente en constituants de réserve plus ou moins labiles.

Notions de sucres de réserve et de sucres solubles

Le terme de réserves est employé par opposition à structure, transport ou métabolisme. L’importance physiologique des réserves est attestée par le fait que leur masse constitue un excellent indicateur de l’état sanitaire et de la vigueur de l’arbre : chez le noyer, la croissance d’un organe donné est quasiment synchrone avec la reconstitution de son stock d’amidon [1].
Seul l’amidon est une forme exclusive de stockage qui répond parfaitement à la définition de réserve. C’est un glucosane (uniquement formé de glucose) rencontré sous forme de grains dont la morphologie varie selon les espèces. Il est constitué en proportion variable d’amylose (chaines linéaires à liaisons α 1-4, PM 150 à 600 Kda) et d’amylopectine (chaînes linéaires liaisons α 1-4 et latérales α 1-6, PM de plusieurs millions). On exclut de ces réserves potentielles les constituants pariétaux dont la remobilisation est controversée : cellulose et hémicellulose pourraient être hydrolysées en hiver pour couvrir des dépenses de respiration [1-3].
Les sucres solubles dans l’eau constituent une source glucidique rapidement métabolisable et couvrent les besoins immédiats de la plante. Ce sont des intermédiaires métaboliques qui sont également une forme de transport et qui peuvent être, dans certains cas, considérés comme une forme de stockage. Ainsi, le saccharose, sucre soluble majoritaire de la plupart des espèces, contribue largement au stockage hivernal en s’accumulant dans les vacuoles. Son accumulation est initiée par une baisse des températures hivernales et contribue à augmenter la résistance au froid [4] : la température de congélation s’abaisse suite à l’augmentation de la pression osmotique sur robinier [5], sur peuplier [6]) donnant au sorbitol un rôle cryoprotecteur des membranes et des protéines cellulaires.
En dépit de leur importance pondérale chez certaines espèces, le rôle des alditols en tant que réserve apparaît négligeable. Les rosacées fruitières notamment, se distinguent par leur haute teneur en sorbitol [7, 8] qui semble être principalement une forme de transport. En effet sa concentration, importante dans les feuilles exportatrices et dans le phloème (environ 50 % des sucres solubles [8-10]), est inférieure à 1 % dans les puits trophiques : bois, racines, fruits et pousses feuillées ([11] sur pêcher, [12] sur abricotier, [13] sur pommier, [14] sur pêcher). Les autres sucres (glucose, fructose et maltose) peuvent être considérés comme des métabolites intermédiaires à durée de vie relativement courte. Chez des arbres jeunes (sans fruit), leur importance pondérale est négligeable, à l’exception du maltose, produit en quantité assez importante par l’hydrolyse des dextranes [15-17] en période préhivernale d’interconversion amidon-saccharose. Ce composé peut, dans ce cas précis, être assimilé à une forme de réserve dans la mesure où sa formation résulte du mécanisme d’interconversion.

Les compartiments de GNS

Chez les végétaux pérennes, les réserves glucidiques peuvent être considérées à plusieurs échelles de temps. Les variations de l’activité photosynthétique au cours du nycthémère génèrent la constitution de réserves à court terme. Etant donné les délais d’acheminement vers les puits trophiques (24 h pour 50 % des assimilats, 5 jours pour la totalité d’entre eux [1]) la majorité du carbone remobilisé dans les 5 jours suivant l’assimilation photosynthétique fait partie de ce « pool ».
Les réserves à long terme permettent de gérer les écarts entre l’offre et la demande propres à chaque stade phénologique. Une accumulation de sucres permet d’assurer la survie de la plante pendant la période où le bilan énergétique est négatif, lorsque les rameaux ne portent pas de feuilles fonctionnelles. Ce stockage démarre très tôt, soit environ 6 semaines après l’apparition des premières feuilles [1].
Kajji évoque également l’existence d’un troisième « pool » de réserves dit de « sécurité ». Composé exclusivement d’amidon âgé de plus d’un an, et inerte en conditions de cultures normales, il serait uniquement mobilisé en cas de stress trophique important.
Il est difficile de quantifier précisément chacun de ces « pools » de réserve car les sites de stockage ne sont ni cloisonnés ni spécifiques (organes, tissus ou organites cellulaires). On peut néanmoins mentionner le cas des chloroplastes dont l’amidon est rapidement mobilisé et, à l’opposé, celui des cernes de bois de plus de 2 ans (tissu) où seraient stockées des réserves dites « de sécurité » [1].
L’existence d’un seuil de réserve carbonée minimal, nécessaire à la survie de l’arbre, en dessous duquel la croissance s’arrête, n’a pas été établie. Néanmoins, nous connaissons chez le pêcher l’importance des glucides de réserve, notamment pour pallier le déficit nutritionnel constaté lors du débourrement (Jordan, non publié).

Préparation de l’échantillon

La préparation des échantillons est réalisée suivant divers protocoles pas toujours justifiés au regard des attendus scientifiques de l’expérimentation chez les ligneux. De plus, elle n’est pas toujours complètement décrite. Les rares études méthodologiques réalisées dès 1973 par Smith [18] et, plus récemment, par Hendrix et Peelen [19] montrent pourtant que le prélèvement, le transport, la conservation et la préparation de l’échantillon affectent le résultat. Nous considérons donc toutes ces étapes comme des points critiques, particulièrement sensibles et devant être maîtrisés.

Prélèvement

Les nombreuses stratégies d’échantillonnage dans l’arbre qui relèvent plus du projet expérimental et du traitement statistique des données, de même que les conditions environnementales du prélèvement (température, hygrométrie, période jour-nuit, etc.), sont habituellement bien décrites et ne seront pas évoquées ici. Cependant, d’autres paramètres influents, sont souvent mal considérés.
Il est essentiel de respecter un horaire de prélèvement précis, notamment lors de répétitions sur des pas de temps courts (jour, semaine). On observe en effet des variations importantes, au cours du nycthémère, du bilan glucidique d’un organe comme les feuilles ou les racines de salade [Adamowicz, non publié]. Rares sont pourtant les auteurs qui mentionnent un horaire de prélèvement, à l’image de Roper, et al. [20] (prélèvement réalisé 2 heures après le lever du soleil) ou Wullschleger, et al. [21] (trois prélèvements sur 24 h).
La masse d’échantillon à traiter est également un paramètre de variabilité. Ainsi, l’échantillonnage d’un arbre entier adulte peut nécessiter une journée et mobiliser une grande diversité de moyens humains et techniques. C’est une variable expérimentale importante que seul peut minimiser un respect strict de la procédure de manipulation de l’échantillon. Il est essentiel de standardiser l’ordre et l’heure de collecte des différents organes afin de minimiser l’impact de ces variables sur la composition biochimique d’échantillons de même nature.
Le prélèvement d’un échantillon s’accompagne d’une phase de stress aux conséquences mal évaluées. Les enzymes, voire les hormones libérées à proximité de la blessure, peuvent occasionner un catabolisme glucidique dont l’incidence est inversement proportionnelle à la masse de l’échantillon. Ce phénomène peut être ralenti par refroidissement du végétal prélevé. L’immersion dans l’azote liquide est la solution la plus performante. La congélation de tous les tissus, même les plus internes du végétal, est instantanée. Elle provoque en outre un éclatement cellulaire qui favorise le séchage et ultérieurement l’homogénéité du broyat ; a contrario, il faut craindre une dégradation rapide après décongélation [18]. L’immersion dans l’azote permet également d’allonger sans risque le temps de prélèvement et de transport au laboratoire. En absence d’azote liquide, la neige carbonique offre un pouvoir refroidissant plus lent. La glacière réfrigérée est encore préférable à la conservation à température ambiante, mais la procédure de rapatriement des échantillons au laboratoire pour y être congelés, doit être rapide. Dans tous les cas, il est souhaitable d’éliminer au moment du broyage, les zones proches des blessures afin d’atténuer l’impact du catabolisme occasionné.
Outre le refroidissement, il existe d’autres façons de fixer l’échantillon après prélèvement : Holligan et Drew [22] proposent, par exemple, d’immerger immédiatement les organes prélevés dans l’éthanol froid 95 % (V/V). Si ce procédé a le mérite d’arrêter le métabolisme cellulaire, il engage l’étape d’extraction des sucres solubles sur du matériel frais non broyé (voir ci-après) et hypothèque des analyses autres que glucidiques (acides aminés libres, par exemple).
Bien qu’avérés, ces risques métaboliques ne suscitent pas toujours les précautions qui s’imposent lors du prélèvement et du transport des échantillons. La lourdeur expérimentale, difficile à assumer et dont les avantages sont mal estimés, en est probablement la raison majeure, mais leur mise en œuvre est également parfois impossible. Ainsi, le travail sur des arbres entiers adultes nécessite souvent des prélèvements volumineux, incompatibles avec une immersion dans l’azote liquide (chez le pêcher [23,24]). Paradoxalement, alors que l’intégrité de l’échantillon est difficilement maintenue, les manipulations susceptibles de le dégrader sont plus nombreuses. Les quantités de biomasse sont telles qu’il est indispensable de ne conserver qu’une fraction représentative de chaque organe, ce qui implique souvent un broyage grossier, dans la neige carbonique, des échantillons frais dès ce stade expérimental.
Cette charge expérimentale liée à la masse végétale prélevée a pour autre conséquence de limiter le nombre de répétitions par traitement (entre 2 pour Kajji [1] et 6 pour Yoshioka et al. [25]), et ce, malgré la variabilité individuelle rencontrée chez les ligneux.
Dans tous les cas, il est important de bien évaluer les moyens disponibles et de convenir des limites à respecter dans l’interprétation des résultats.

Séchage

Destiné à faciliter la conservation et la manipulation d’un échantillon à doser, le séchage permet également de mesurer la teneur en matière sèche (MS), en fonction de laquelle les teneurs en GNS sont habituellement exprimées. Un séchage inapproprié peut affecter l’intégrité biochimique de l’échantillon, à savoir entraîner des modifications irréversibles [19]. Pour les GNS, les risques encourus sont la réaction de Maillard (caramélisation), le catabolisme et l’interconversion. Pour y contrevenir, il faut considérer plusieurs paramètres qui tiennent à la fois de l’échantillon (volume, poids, nature) et des conditions de séchage (principe, température, durée).
Excepté la dessiccation à température ambiante, deux méthodes de séchage se pratiquent au laboratoire : à chaud (étuve ventilée ou non, avec ou sans vide), à froid et sous vide (lyophilisation). Considérée depuis longtemps comme la plus performante (sur la luzerne [18]), la lyophilisation est utilisée de préférence pour sécher les échantillons ligneux (tableau 1). Son emploi n’est pas systématique, probablement par manque d’équipement (coûts d’investissement et d’entretien élevés), du fait de la moindre capacité des lyophilisateurs, voire de la longueur du séchage (3 à 8 jours selon la taille, la densité et la teneur en eau des échantillons).

Tableau 1Principales procédures de préparation des échantillons ligneux et d’analyse des sucres solubles.
Table 1. Main procedures for sample preparation and soluble sugar measurement in ligneous plants.
Traitement des échantillons Extraction des SS
Réf. Année Plante Organe Séchage * Broyage + PE Solvant Durée, T° Purification Dosage
[35] 1993 cotonnier feuille lyoph Disques tissus E 15 à 30 min charbon enzymes
[64] 1991 pêcher feuille 500 mg congelés broyés dans N liq 20 mL MCW (6 :3 :1) puis 8 mL W 2 h enzymes (kits)
[21] 1992 peuplier, chêne blanc feuille morceaux frais E80 % charbon enzymes
[121] 1998 peuplier tige feuille, racine 48 h, 70 °C 50 mg broyés 5 mL tampon acétate 0,1 M 40 min enzymes
[122] 1985 pommier tige, feuille, racine lyoph 200 mg broyés (40 mesh) 5 mL E80 % bouillant 5 min résine enzymes
[27] 1985 poirier bourgeon 5 j, 50 °C 50 mg broyés moulins 5 mL M62,5 % agitation, 1 nuit, T° ambiante a. perchlorique charbon enzymes
[12] 1985 abricotier feuille MCWF (12 :5 :2 :1)  – 25 °C résine CPG
[123] 1987 pêcher écorce, phloème lyoph 100 mg broyés 4 mL a. perchlorique 1,2 M 30 min, 0 °C CPG
[124] 1999 pêcher tige, fruit lyoph 100 mg (tiges) 75 mg (fruit) M80 % CPG
[25] 1988 pommier bois, écorce, racine broyés dans E80 % E80 % bouillant 15 min, 80 °C CPG
[66] 1973 prunier feuille, tige, racine lyoph 100 mg broyés (40 mesh) E80 %-E50 %-E80 % résine CPG
[19] 1987 cotonnier feuille Feuilles broyées dans E E bouillant (1) + hexane (3) 30 min résine + C18 ou charbon CLHP ou enzymes
[125] 1987 épicéa bois 24 h, 60 °C broyage, 5 min E80 % (1,5mL/h) CLHP
[69] 1985 Eunonimus japonica feuille lyoph 50 mg broyés au mortier MCW (percolation) résine CLHP
[4] 1999 framboisier tige, bourgeon lyoph 10 mg broyés 4 mL E80 % 40 min CLHP
[53] 2002 pêcher feuille, écorce, bois, racine lyoph broyage (< 45 µm) MCW (5 :5 :3) agitation, 20 min, 4 °C C18 CLHP
[54] 1993 pin aiguille, tige, racine lyoph 500 mg broyés 30 mL W + résines agitation, 1 h, T° ambiante résine CLHP
[50] 1996 pin racine 35 à 150 mg frais 0,5 mL E80 % 30 min, 80 °C résine CLHP
[47] 1973 pommier branche, tronc, racine 10 à 20 g de morceaux frais broyés dans M M80 % ébullition puis 4-6 h CP + 14C
[44] 1979 pommier feuille, tige, racine non morceaux frais broyés dans M80 M80 % CM
[75] 1964 hêtre racine E80 % bouillant sous reflux 30 min hydroxyde de Ba résine anthrone Cu++ 
[29] 1979 pécanier feuille, tige, tronc, racine, écorce, bois 10 min, 100 °C + 1 nuit, 70 °C broyés (60 mesh) E80 % puis E60 % anthrone
[126] 1982 abricotier tige 500 mg broyés E80 % 20 min Anthrone Cu++ 
[127] 1988 ailante glanduleux tige, bourgeon 2 g frais broyés dans E80 % E bouillant anthrone
[28] 1996 pêcher feuille, tige, racine lyoph 100 mg broyés (< 40 µm) 4 mL MCW (12 :5 :3) 30 min, T° ambiante PVP anthrone
[128] 1997 pêcher feuille Disques feuille frais (1 g) E80 % (SS) ou 5mL W 4 °C (sorbitol + saccharose) anthrone CLHP
[52] 1977 pêcher feuille, bourgeon, lyoph 250 mg broyés 25 mL H3BO3 0,1M pH8 Acétate de Na Oxalate de K orcinol
[45] 1986 conifères aiguille, tige, racine E80 % résine phénols CM + 14C
[129] 1990 pêcher tige 90 °C 3 g du mélange (100 g sec broyés + 100 mLW) 40mL E95 % puis E60 % 10 min, 60 °C phénols
[120] 1970 pêcher bourgeon de fruit lyoph 200 mg broyés (< 60 mesh) 0,2 % a. benzoïque ferricyanure
[3] 1981 pêcher tige, racine, écorce, bois lyoph 500 mg broyés E80 % T° ambiante ferricyanure
[99] 1981 peuplier tige lyoph 50 mg broyés (40 mesh) 3 mL MC (1 :2) puis 3 mL MC (2 :1) + sol CaCl2 résine DNSA, CM
[56] 1993 conifère aiguille, tige, racine 100 °C 1 h puis 70 °C broyage (< 5 mm) 35 mL W 48 h, 55 °C, agitation dialyse PAHBAH
[78] 1977 Bryophyllum feuille frais broyé dans M80 % M80 % 20 min, ébullition résine 13C par spectrométrie
[63] 1979 peuplier feuille 3 à 50 mg broyés 2 mL MCW (12 :5 :3) résine 14C
Classement selon la méthode de dosage des sucres.
Travaux sélectionnés parmi 55 articles recensés, non redondants quant aux auteurs, matériel végétal et méthodologie.
* séchage par défaut à l’étuve sauf quand lyophilisation précisée (lyoph).
Purif : purification ; T : température ; N : azote ; lyoph : lyophilisation ; congel : congélation ; E : éthanol ; M : méthanol ; C : chloroforme ; W : eau ; F : acide formique ; CPG : chromatographie phase gazeuse ; CLHP : chromatographie liquide haute performance ; CP : chromatographie sur papier ; CM : chromatographie sur couche mince ; PAHBAH : acide p-hydroxybenzoïque hydrazine ; DNSA : acide dinitrosalicylique ; PVP : polyvinylpirrolidone.

Le séchage à l’étuve d’échantillons congelés (cf. infra, le paragraphe Stockage) démarre par une phase de décongélation et par la reprise potentielle d’une activité métabolique propice à la transformation significative de certains sucres. Si la congélation est le meilleur moyen de préserver l’intégrité d’un échantillon frais, le dégel est le moyen le plus sûr de la perdre, comme en témoignent nos données expérimentales (figure 1). Un dégel de quelques heures au-dessus de 0 °C provoque la quasi-disparition du saccharose et l’augmentation du glucose et fructose. Selon Hendrix et Peelen [19] une altération de la composition en SS serait effective après seulement 15 minutes de dégel et d’autant plus importante que la teneur en saccharose des végétaux (coton, melon) est basse. La rupture de la structure cellulaire et la mise en contact des solutés des différents compartiments cellulaires (invertase et saccharose vacuolaires, entre autres), provoquées par l’enchaînement congélation-décongélation, expliquent la rapidité et l’importance du catabolisme. Ce phénomène peut être favorisé par la rupture des parois cellulaires lors de l’immersion des échantillons prélevés dans l’azote liquide, ce qui n’est donc pas souhaitable dans l’hypothèse d’un séchage à l’étuve.
La ventilation de l’étuve et l’étalement « monocouche » des échantillons facilitent le séchage et évitent des phénomènes d’échauffement particulièrement redoutés avec des lots de feuilles. Une étude expérimentale classique sur plante entière, génère une grande diversité d’échantillons qui doit être prise en compte. L’étuvage d’échantillons de même nature devrait permettre d’optimiser ces conditions de séchage. La multiplication incidente des procédures explique cependant que cette démarche ne soit pas adoptée dans la pratique.
Les conditions de séchage sont très variables : les échantillons destinés à l’analyse des sucres peuvent être soumis plusieurs heures à des températures égales ou supérieures à 80 °C (48 h chez le prunier [26]). Néanmoins, le risque de caraméliser des sucres incite en général à travailler à des températures plus basses, voisines de 60-65 °C pendant 72 h et plus (tableau 1). La durée d’étuvage peut s’allonger pour des températures encore plus basses : Blunden et Wilson [27] préconisent 5 jours à 50 °C, pour sécher des graines de patience, de ronce et d’ortie. Sécher à ces températures évite la caramélisation mais reste propice aux métabolismes enzymatiques, également favorisés par la présence prolongée de l’eau. Travailler à 65-70 °C sous vide en présence d’un dessicant (P2O5) semble un bon compromis, même si on ne peut éviter des conditions défavorables en début de séchage, lorsque l’échantillon frais est introduit dans l’étuve. La crainte d’une disparition de sucres simples par catabolisme oxydatif [18] ou d’une simple interconversion des SS (i.e. transformation d’un sucre en un autre par voie enzymatique) conduit à n’exploiter que la somme totale des SS [28]. Une évaluation globale des teneurs en GNS serait même préférable dans la mesure où Smith [18] note la disparition de l’amidon de luzerne lors d’un séchage à l’étuve. L’hydrolyse de l’amidon serait d’autant plus élevée que la température d’étuvage est basse (de 0 % pour un séchage à 100 °C à 50 % à 25 °C). Selon Smith (1969) cité par Worley [29], un premier séchage d’échantillons ligneux de 90 min à 100 °C suivi d’un second à 70 °C pendant une nuit limiterait les pertes en CHO à ce qu’elles sont lors d’une lyophilisation.
La lyophilisation, éventuellement après broyage à froid de matériel frais volumineux [28], paraît être la meilleure technique de séchage. Elle garantit, a priori, l’intégrité des glucides et s’avère le passage idéal entre l’étape de stockage d’un échantillon frais, biochimiquement très instable, et le stockage à l’état déshydraté inerte. L’immersion préalable des échantillons dans l’azote liquide limite les risques de dégel et entraîne la rupture des parois cellulaires, ce qui facilite l’extraction des molécules d’eau lors de la lyophilisation et augmente la porosité du matériel végétal [30]. Une autre solution pratique consiste à ne lyophiliser qu’une partie de l’échantillon, constituée au hasard [23], ce qui pose cependant des problèmes de représentativité quand on sait que le dépôt de sucre n’est pas uniforme dans un organe donné.
La durée nécessaire au séchage est variable selon les organes (2 jours pour des feuilles, 6 pour du bois) et généralement supérieure à ce qu’elle serait à l’étuve. La lyophilisation ne permet pas une déshydratation aussi complète que le passage à l’étuve, et ce malgré une remontée en température à 40 °C usuellement pratiquée en fin de séchage.
D’après nos mesures, des échantillons de tomate conservent, après lyophilisation, une humidité résiduelle qui disparaît progressivement à l’étuve lorsque la température augmente (figure 2). C’est particulièrement vrai avec les tiges et pétioles pour lesquelles on mesure une erreur relative de 6,1 % de la MS mesurée à la sortie du lyophilisateur (valeur de référence mesurée à 105 °C).
Il est nécessaire de limiter cette présence résiduelle d’eau qui contribue probablement au métabolisme glucidique observé à l’issue du stockage d’échantillons lyophilisés (dans des broyats de feuilles de blé [18], et chez le pommier [31]).
Le calcul de la MS est nécessaire afin d’exprimer les teneurs en GNS en fonction de la matière fraîche. Pour les échantillons ligneux, il est habituellement réalisé sur une aliquote, par étuvage à 103 °C pendant 48 h [32], et ce, malgré les pertes éventuelles de matière organique évoquées précédemment. Pour des échantillons tel que les fruits, riches en GNS, 72 h à 96 h d’étuve à 70 °C nous semblent préférables, l’emploi d’une étuve sous vide permettant cependant de baisser la durée de ce séchage à 6 h.
Dans la mesure où l’on doit lyophiliser intégralement un échantillon, sa teneur en MS peut être établie comme suit :
– pesée de l’échantillon avant et après lyophilisation pour déterminer sa biomasse apparente (MSa) ;
– mesure de son humidité résiduelle (Hr) sur une aliquote (24 h, 103 °C). La biomasse sèche s’obtient en appliquant la formule suivante :

MS = MSa (% MF)/(100-Hr (%  Msa)) × 100.

Le calcul de l’humidité résiduelle est de toute façon nécessaire avant chaque dosage. Dans l’hypothèse où la masse d’échantillon est trop faible, un facteur de correction moyen propre à chaque tissu (écorce, bois, racine) peut être appliqué. Dans le cas d’échantillons de salade, l’erreur relative moyenne pour les MS établie après lyophilisation est de 2,15 % pour des limbes, de 3,7 % pour les racines et enfin de 6,1 % pour les tiges et pétioles (figure 2).

Broyage

C’est une étape fastidieuse, mais de première importance. Hautement répétitive, sa réalisation doit être minutieuse et non dénaturante, pour permettre l’obtention d’une poudre végétale (PV) homogène dont dépendent la précision et la justesse des analyses. On utilise essentiellement des broyeurs à couteaux et des broyeurs à billes, ces derniers permettant, selon nous, une meilleure adaptabilité des conditions de broyage (capacité et nature des bols, nombre de billes, vitesse, durée, réfrigération) à la nature ligneuse de l’échantillon et aux analyses glucidiques programmées.
Il est rare, car plus difficile, de broyer correctement du matériel frais [33, 34]. C’est une procédure à risque compte tenu de la fragilité d’un matériel riche en eau (décongélation) et de la difficulté d’homogénéisation et de récupération intégrale du broyat. Elle permet néanmoins de s’affranchir des contraintes liées au séchage et au stockage de grands volumes de matériel végétal. Son choix est souvent dicté par des contraintes expérimentales, liées à la taille et à la nature des organes prélevés (pré-broyage de bois [28], limbe de feuille [35], pulpe de fruit [36]) ou encore à la spécificité des dosages (risques de dénaturation par chauffage).
Le broyage concerne généralement des végétaux secs. La granulométrie de la PV conditionne la représentativité de la prise d’essai (PE) d’échantillon pour analyses, et l’efficacité de l’extraction des GNS. Nos données expérimentales (figure 3) montrent que, dans la mesure où la prise d’essai (PE) est suffisante (50 mg), le broyage fin (taille des particules < 50 µm) améliore le recouvrement de l’amidon dans une racine primaire de pêcher. En absence de broyage, jusqu’à 50 % de l’amidon présent n’est pas libéré par autoclavage et échappe ainsi au dosage. Cette inaccessibilité de l’amidon est particulièrement évidente lorsqu’on travaille sur un seul morceau de racine de 100 mg. Les SS, en revanche, sont correctement mis en solution après un broyage grossier.
Pendant le broyage, il doit y avoir conservation des caractéristiques chimiques de l’échantillon sans perte (sucres, protéines, etc.) ni enrichissement (contamination par un autre échantillon, hydratation). Le risque principal est le brunissement (lié au catabolisme des sucres réducteurs) par échauffement de la poudre végétale (PV), dû aux forces de frottement. Il est d’autant plus élevé que la vitesse et/ou la durée du broyage est grande et la réfrigération insuffisante. L’emploi de neige carbonique et surtout d’azote liquide pour refroidir les échantillons et les bols de broyage est intéressant, bien qu’il induise parfois une rétraction thermique des masses métalliques gênant les montages et démontages du broyeur.
Le broyage à froid doit être privilégié pour assurer l’intégrité glucidique d’échantillons ligneux dont la durée de broyage est souvent supérieure à 3 minutes. Pour optimiser cette durée, le choix du matériel (modèle de broyeur, taille des bols, nombre de billes, etc.) doit être effectué en fonction du volume, de la densité et de la dureté des échantillons. Certains appareils permettent en outre d’adapter la vitesse de broyage.

Stockage

Il concerne des échantillons frais ou secs, broyés ou non. Ses conditions sont d’autant plus importantes que la présence d’eau favorise l’activité cellulaire et que la composition glucidique est sensible à la température de stockage. Sauter [17] constate que l’amidon se dégrade rapidement au voisinage de 0 °C et change peu à 5 et 10 °C tandis que la teneur en saccharose augmente quand la température baisse. Une conservation à température négative (– 20 °C) est préférable car certains enzymes comme l’invertase sont actifs à 0 °C [37]. L’interconversion des sucres peut cependant se produire quelle que soit la température de stockage [18, 19]. Smith souligne l’existence d’une variation importante des concentrations en glucose, saccharose et fructose au cours du temps (12 mois) dans des broyats de feuilles de blé lyophilisées, conservés en flacons scellés à température ambiante [18]. Ces concentrations peuvent doubler en 6 mois pour le fructose. Comme Abusrewil, et al. [31] chez le pommier, il mentionne une baisse de l’amidon (– 25 %) après stockage, compensée par une élévation concomitante de la teneur en sucres solubles, la quantité totale des GNS n’étant pas modifiée de plus de 5 %. Selon Brown et Summers, le métabolisme glucidique se poursuit en dessous de – 20 °C : 8 % du saccharose présent dans du jus de melon serait hydrolysé en fructose et glucose après 37 jours à – 30 °C [38]. Quelles que soient les températures de stockage, il est en effet très difficile de limiter la réhydratation de PV fortement hydrophiles. Comme Gurakan, et al. [32] sur des extraits secs de champignons, nous constatons en sortie d’étuve une réhydratation immédiate de PV, rarement supérieure à 2 % et se stabilisant rapidement (figure 4). Même si c’est surtout un phénomène précoce après séchage, la reprise d’humidité se poursuit lors du stockage. Gary et Vandame [non publié] notent que des échantillons secs de tomates conservés un an à température ambiante en flacons plastiques scellés, reprennent entre 4 et 6 % d’humidité pour les feuilles et tiges et jusqu’à 11 % pour les fruits. De notre côté, nous observons que des PV lyophilisées de différents organes de pêchers, conservées 3 mois en flacons plastiques scellés à – 80 °C, reprennent en moyenne 1 % d’humidité (figure 4). Même si la réhydratation des échantillons paraît inévitable, ce phénomène semble d’autant plus lent que la température de stockage est basse.
Pour un stockage prolongé (plusieurs mois), la congélation à – 80 °C est un moyen efficace de freiner le métabolisme glucidique. Toutefois, compte tenu de l’incapacité à stabiliser durablement la composition glucidique, il est souhaitable de réaliser les dosages glucidiques à court ou moyen terme et de limiter, si possible, les prélèvements répétés d’aliquotes, synonymes de contamination potentielle et de phases « congélation-décongélation » qui nuisent à l’intégrité biochimique d’une PV.

Fractionnement et purification des glucides non structuraux

Sans être exhaustifs, les tableaux 1 et 2 donnent des exemples d’application de techniques de fractionnement, de purification et de dosage des GNS chez les ligneux. Ne sont pas répertoriés les nombreux travaux sur les céréales et les grains (cf. pour exemple, les travaux en France des équipes de Mercier [39-41] et Cerning-Beroard [42, 43]), qui ont pu inspirer les procédures utilisées pour les ligneux. Si le choix d’un dosage individuel ou global des GNS est lié aux objectifs expérimentaux, les possibilités analytiques et plus particulièrement la préparation des extraits glucidiques peuvent limiter le nombre d’analyses. Cette préparation s’avère en général plus longue et plus complexe qu’elle ne l’est pour les fourrages et les céréales, sous l’effet combiné d’une concentration en GNS très variable et souvent très faible (0 à 50 % de la MS selon les organes), et d’une grande diversité biochimique des échantillons ligneux (effet matrice). Comme nous allons le voir, elle consiste le plus souvent à fractionner, puis à purifier, les GNS.
Plutôt que de décrire chaque technique de dosage disponible et les procédures de fractionnement et de purification associées, nous avons préféré faire une présentation chronologique de ces étapes, plus claire et moins redondante. Les différentes options expérimentales possibles, compte tenu des objectifs et des contraintes seront schématisées en conclusion (figure 5).

Extraction des sucres solubles

Principe

L’extraction des SS est généralement obtenue par macération répétée dans un solvant, d’une PE réduite (< 200 mg) d’échantillon. La qualité d’une extraction s’estime sur sa capacité de séparation et de maintien de l’intégrité des fractions, en évitant la perte ou l’interconversion des sucres. Les caractéristiques de l’échantillon analysé (structure, composition biochimique, granulométrie, PE) contribuent à diversifier les procédures utilisées.

Échantillon

Le travail sur produit frais non broyé [44, 45] fait l’hypothèse, d’une part, que la PE est représentative de l’échantillon prélevé et, d’autre part, que l’extraction des sucres solubles d’un ligneux non broyé est complète, ce qui n’est pas souvent le cas. Aussi, la grande majorité des auteurs préfèrent-ils travailler sur du matériel sec et broyé (tableau 1). Cinquante à 100 mg d’échantillon constituent des PE convenables. À l’extrême, on rencontre des procédés de macération de quantité importante de tissus (jusqu’à 30 g) [33, 46, 47] et des extractions sur des PE très faibles, inférieure à 10 mg [17, 48-50]. Même si les volumes de solvants employés paraissent adaptés à ces PE, le rapport PE/VS (avec PE en g sec et VS la somme des volumes de solvants aqueux en mL) reste très variable d’une étude à l’autre (à titre d’exemples : 0,133.10–2 pour MacRae [51], 0,714·10–2 pour Roper, et al. [20], 1·10–2 pour Lasheen et Chaplin [52]). Sa valeur peut traduire une extraction insuffisante (rapport trop grand), une perte de végétal (PE trop faible), une dilution trop importante et un traitement difficile d’extraits trop volumineux (rapport trop petit). Selon nos observations, un rapport PE/VS voisin de 0,5·10–2 permet l’extraction complète et homogène des SS au bout de 20 min de contact, sous agitation permanente, seule une aliquote représentative de l’extrait VS étant ensuite conservée pour le dosage des SS [53].

Solvants

Les mélanges alcool-eau sont des solvants à choisir en fonction du PM des oligosides à extraire [41]. Ainsi, l’éthanol bouillant à 80 °, le plus utilisé chez les céréales, permet d’extraire 98 % des oligosides de PM inférieur à 2 000, soit un degré de polymérisation de 1 à 12 hexoses (chaînes courtes à l’exception des dextranes), sans altérer les polyosides (amidon, constituants pariétaux) du résidu. L’eau est le solvant utilisé le plus simple pour extraire les SS à partir d’une PV sèche [54-56] ou d’un échantillon frais [17, 57]. Généralement pratiquée à chaud l’extraction peut durer de quelques minutes [58] à plusieurs heures [56] et s’avérer tout aussi efficace que l’extraction à l’aide d’un mélange de solvant [59]. L’eau est cependant moins employée qu’une solution alcoolique qui a l’avantage de bloquer en partie l’activité métabolique (même si certains enzymes comme l’invertase restent fonctionnels en milieu hydro-alcoolique) et de favoriser la conservation de l’échantillon (tableau 1). Chez les ligneux, la littérature fait état d’une grande diversité d’utilisation des solutions alcooliques, selon des finalités parfois contradictoires : Yoshioka, et al. [25] extraient les SS dans l’éthanol bouillant à 80 % pendant 15 min avant dosage de l’amidon résiduel, alors que Claire, et al. [60] utilisent des conditions pratiquement analogues (méthanol bouillant à 40 % pendant 15 min) pour extraire l’amidon résiduel après extraction des SS (méthanol à 40 % pendant 20 h à 4 °C). Par ailleurs, l’emploi préférentiel de solutions alcooliques à 70-80 % peut paraître injustifiée dans la mesure où une solution de méthanol 50 % permet une extraction complète et rapide des SS [53].
Les extractions en milieu non alcoolique sont rares : on peut citer l’emploi d’une solution d’acide borique 0,1M à pH 8 par Lasheen et Chaplin [52] ou encore l’extraction en milieu non aqueux (tétrachlorure de carbone et heptanes) de Gerhard et Held [61] pour qui l’absence d’eau prévient les risques d’interconversion enzymatiques des sucres. Enfin, dans l’optique d’un dosage global des GNS, on peut réaliser une extraction en milieu acide [18], mais le risque d’hydrolyse des constituants pariétaux existe.
Les procédures d’extraction chez les ligneux sont souvent rendues complexes par une purification concomitante des extraits pour éliminer des composés indésirables (tanins, pigments, etc.) [19, 53, 62], et/ou pour préparer d’autres analyses (constitution d’extraits protéiques et lipidiques) [63]. Le cas le plus fréquent est l’utilisation d’un mélange chloroforme, eau et méthanol [12, 63-65]. Nous avons récemment confirmé, pour différents organes de pêcher (travaux non publiés sur abricotier, tomate, kiwi, manguier, goyavier et caféier), l’efficacité de cette extraction et son adaptation à l’analyse chromatographique [53], et enzymatique [non publié]. Dans l’état actuel des connaissances, compte tenu de la grande diversité matricielle des végétaux ligneux et des contraintes liées aux différentes techniques de dosage disponibles, la proposition d’une méthode d’extraction universelle des sucres solubles coïnciderait assurément avec ce type d’extraction complexe, associant plusieurs solvants.

Autres variables expérimentales

Il existe un consensus sur la nécessité de répéter l’extraction afin d’épuiser totalement le résidu de ses SS. Le nombre de lavages peut varier de deux à cinq selon les organes étudiés [35]. MacRae [51] considère que la majorité des sucres solubles sont extraits après deux bains ; cependant, comme d’autres [38, 66], il pratique trois extractions par sécurité. La durée très variable des trempages (10 min jusqu’à 5 h et plus pour Hansen et Grauslund [47] ou Yamada, et al. [33], et même 20 h pour Claire, et al. [60]), soumis ou non à une agitation, contribue aussi à multiplier les procédures.
Les conditions d’extraction peuvent favoriser certains métabolismes pénalisants pour l’analyse des sucres. En s’oxydant en quinones, les tanins libèrent par exemple des dérivés glucidiques courts [67] qui faussent l’estimation globale des GNS. L’ajout d’anti-oxydant au mélange d’extraction permet d’éviter ce métabolisme.

Purification des sucres solubles

La purification des extraits complète, le plus souvent, une procédure d’extraction déjà sélective. Son rôle est d’optimiser les conditions de l’analyse en éliminant des sources d’inférences au dosage des SS, associées à la matrice végétale ou à un solvant. En cela, elle dépend directement des techniques de dosage et de leur spécificité, les options enzymatiques paraissant les moins exigeantes. La plupart des procédures intègrent cependant l’élimination des phénols qui, avec les pigments et les protéines, sont les composés les plus indésirables.
En 1949, Bevenue [68] est le premier à souligner la nécessité de clarifier les extraits et préconise l’emploi du charbon d’origine animale qui, contrairement au charbon végétal, n’absorbe pas les SS (taux de recouvrement du saccharose variable de 47 à 87 %). Ce traitement améliore le taux de recouvrement des SS des tissus riches en phénols [19]. Comme le PVP [69] ou encore l’acétate de plomb et l’oxalate de potassium [52], le charbon permet en effet l’élimination de composés phénoliques, solubles en milieu alcool-eau et capables en se complexant avec les oses de perturber leur dosage [27, 70]. Ainsi, les tanins, souvent présents en quantités très importantes chez les ligneux, sont des composés polyphénoliques complexes pouvant s’associer au glucose et aux alditols [71]. Cette propriété complexante peut d’ailleurs être exploitée pour doser les sucres totaux dans les échantillons débarrassés de leurs phénols d’origine [70].
La présence importante de protéines est susceptible de fausser les mesures d’absorbance lors d’un dosage colorimétrique des SS [41]. Leur élimination est obtenue par dialyse [56], par précipitation au froid (dans l’acétone), ou par défécation selon différentes façons : précipitation par le tétrachlorure de carbone [72], par acide perchlorique [27], par l’agent Carrez [73] ou encore, selon la méthode de Somogyi [74], par le sulfate de zinc associé à l’hydroxyde de barium [75] ou à la soude [51].
Lipides et pigments peuvent être également éliminés à l’aide de chloroforme [53, 62-64] ou d’hexane [19] lors de l’étape d’extraction des SS, ou par chromatographie sur résine (tableau 1). Cette technique reste lourde et onéreuse, malgré la commercialisation de filtres spécifiques. Les résines échangeuses d’ions de type Dowex sont souvent employées pour fractionner l’ensemble des solutés organiques (SS, acides aminés, acides organiques, lipides) en prévision d’une analyse détaillée [66, 76-78].
Bien que plusieurs dosages soient praticables en milieu hydro-alcoolique (dosage à l’anthrone, dosage enzymatique du glucose, etc.), les solvants d’extraction (alcool, chloroforme) sont le plus souvent éliminés par évaporation sous vide [53] ou sous flux d’azote [19], et le résidu est resolubilisé dans l’eau. Il n’y a pas de données bibliographiques concernant une éventuelle interconversion des sucres lors de cette manipulation pratiquée à température ambiante.
La nécessité de purifier les extraits peut se discuter. Cependant, d’une façon générale, l’élimination des phénols et des solvants d’extraction, voire des chaînes apolaires (passage sur pré-colonne C18) dans le cas d’une analyse par CLHP [19, 53], nous paraît souhaitable pour le dosage des SS chez les ligneux (meilleure résolution des chromatogrammes).

Solubilisation et hydrolyse de l’amidon

L’amidon est généralement extrait du résidu ligneux pour être dosé. Il est possible de le mesurer directement par gravimétrie, polarimétrie ou colorimétrie, bien que la précision de ces méthodes ne soit pas satisfaisante pour les échantillons ligneux : en effet, le pouvoir rotatoire n’est correctement mesurable que sur des échantillons concentrés en amidon (grains, tubercules) et certaines méthodes d’hydrolyse utilisées, notamment en milieu acide, ont la propriété de le modifier [79]. La réaction colorée de l’amidon, ou plus exactement de sa composante « amylose », avec une solution I2-KI (formation d’un complexe polyiodine bleu foncé) est parfois utilisée pour estimer la concentration relative en amidon du fruit [80]. La méthode classiquement employée pour mesurer précisément l’amidon des ligneux consiste à doser la quantité de glucose libéré par hydrolyse de l’amidon dispersé. Dispersion et hydrolyse de l’amidon sont étroitement liées et peuvent ne constituer qu’une seule étape dans certains cas d’attaque acide ou basique. La dispersion demeure indispensable avant une hydrolyse enzymatique, même si elle n’est pas toujours mentionnée dans la procédure expérimentale [81].

Dispersion

Que les granules d’amidon soient libres (sève cellulaire des racines riches en eau et des tubercules) ou liés à d’autres composants (graine, feuilles, bois), l’amidon est inclus dans une masse insoluble dans l’eau, composée pour l’essentiel de protéines et de polyosides [82]. En cassant cette structure cellulaire et en rompant les liens avec cette matrice environnante, l’amidon libéré devient accessible aux substances hydrolysantes. C’est le but de la dispersion que l’on peut décomposer en 2 phases : a) la gélatinisation qui s’apparente au gonflement du granule d’amidon obtenu par l’hydratation du polymère à l’aide, par exemple, d’eau bouillante ou d’alcool chaud [83] ; b) l’hydrolyse en petits morceaux d’amylose ou d’amylopectine [84].
Depuis la mise en évidence par Fluckinger au XIXe siècle, de la dissolution de l’amidon par le chlorure de calcium, les procédures d’extraction se sont diversifiées selon le matériel végétal traité. La technique peut être aussi simple qu’une extraction dans l’eau bouillante pendant 3 min [66], mais les procédures sont généralement plus complexes afin d’optimiser l’extraction et de prévenir les interférences lors du dosage. Suite aux travaux de Ewers [85], des substances corrosives, acides ou basiques, sont utilisées pour la dispersion de l’amidon. Elles constituent près de 50 % des conditions de dispersion chez les ligneux (tableau 2) : sont surtout utilisés les acides perchlorique (HClO3) et chlorhydrique (HCl), puis la potasse (KOH) et enfin le diméthylsulfoxyde (DMSO) seul ou associé à HCl. Pour la plupart, ces attaques chimiques ont été initialement élaborées pour doser l’amidon résistant de certaines céréales et légumineuses (proportion importante d’amylose), avant d’être utilisées chez les ligneux, où la structure de l’échantillon et sa préparation (séchage, broyage) influencent leur efficacité. Comparativement aux grains de céréales, les teneurs en amidon sont en effet plus faibles chez les ligneux où l’amidon est réparti de manière très hétérogène selon les tissus, au sein d’une structure cellulo-ligneuse souvent importante (bois). Il est nécessaire de trouver une adéquation entre nature et présentation de l’échantillon, molarité de l’acide ou de la base, durée et température de la réaction. Cette recherche explique la diversité des conditions expérimentales à l’image d’une durée de réaction variant de 30 min à 24 h. La concentration des solutions utilisées est importante, tant pour l’intégrité des glucides pariétaux que pour la bonne réalisation de l’étape suivante (hydrolyse de l’amidon). Une attaque chimique trop forte peut hydrolyser des constituants pariétaux comme la pectine [86] et libérer des glucides de structure. Cela explique l’usage préférentiel de solutions acides ou basiques à une normalité inférieure à 1 (tableau 1), même si des concentrations plus élevées sont parfois utilisées : Lerman, et al. [57] solubilisent l’amidon de feuilles de Briophillum après extraction des solubles à l’aide d’une solution de soude à 17,5 % tandis que l’acide perchlorique peut s’employer à des concentrations supérieures à 30 % [87]. Par ailleurs, des conditions de dispersion efficaces, en particulier le pH, s’avèrent souvent incompatibles avec une hydrolyse enzymatique optimale de l’amidon et nécessitent une correction (retour à un pH voisin de 4,6). À noter qu’une concentration trop élevée de DMSO inhibe partiellement l’action de l’amyloglucosidase [88].

Tableau 2Principales procédures de dosage de l’amidon chez les végétaux ligneux.
Table 2. Main procedure for starch measurement in ligneous plants.



Réf. Année Plante Organe Empesage ou dispersion Hydrolyse Dosage du glucose
[35] 1993 cotonnier feuille 1 mL potasse 0,1M, bouillant,1 h amylase + AMG HK + G6PDH + INT
[90]] 2003 pêcher feuille, écorce, bois, racine autoclave, 120 °C, 2 bar 1 h ou KOH 4M AMG HK + G6PDH
[121] 1988 peuplier feuille, tige, racine amylase HK + G6PDH
[130]] 1998 peuplier bois 5 mL HCl 1N, 60 °C,1 h AMG HK + G6PDH
[21] 1992 peuplier, chêne blanc feuille 1 mL potasse 0,2M bouillante, 1 h amylase, 85 °C, 30 min + AMG HK + G6PDH + INT
[54] 1993 pin aiguilles, tige, racine a. chlorhydrique - DMSO 60 °C, 30 min AMG HK + G6PDH
[131] 1999 pin tige 1,5 mL a. chlorhydrique 30 mM puis potasse 30 mM (retour pH 4,6) AMG, 55 °C, 1 h HK + G6PDH
[122] 1985 pommier feuille, tige, racine 3 mL potasse 0,2N, bouillante, 30 min AMG + glucohydrolase,

55 °C,1 h
HK + G6PDH
[20] 1988 cerisier feuille, tige, racine tampon acétate de sodium bouillant,1 h AMG, 55 °C, 16 h GOD
[4] 1999 framboisier tige, bourgeon 1 mL tampon acétate, bouillant, 15 min AMG, 55 °C, 20 h GOD-POD
[60] 1988 ipomoea purpura tige méthanol 40 % bouillant 10-15 min sous reflux (× 2) AMG GODPOD
[132] 1990 mandarinier, manguier, feuille, tige, tronc, racine amylase + AMG, 60 °C, 1 nuit GOD
[64] 1991 pêcher feuille potasse 0,2N bouillante, 30 min AMG, 45 °C, 4 à 6 h enzyme (kit Boehringer)
[26] 1975 prunier, pêcher feuille, écorce W, bouillante, 3 min AMG, 18 h CPG
[124] 1999 pêcher tige, fruit 10 mL W, 100 °C, 1 h AMG, 55 °C, 48 h CPG
[133] 1992 pêcher feuille W, bouillante, 135 °C 1 h (gélatinisation) AMG CLHP
[134] 2001 Glyricidia sepium tige 18 mL NaOH 0,5M AMG CLHP
[126] 1982 Abricotier tige a. perchlorique froid anthrone
[127] 1988 ailante glanduleux tige, bourgeon W bouillante, 30 min (5 fois) a. perchlorique 35 % anthrone
[125] 1987 épicéa bois percolation d’acide perchlorique 35 % anthrone
[135] 1966 pêcher Feuille, tige, tronc a. perchlorique 4,8N, 100 °C, 24 h anthrone
[128] 1997 pêcher feuille ébullition AMG, 2 h anthrone
[33] 1994 pommier pomme a. perchlorique 4,6N a perchlorique 0,56N, bouillant, 2 h anthrone
[45] 1986 conifère aiguille, tige, racine Diastase, 43 °C, 24 h phénols
[99] 1980 peuplier tige clarase + diazyme o-toluidine
[58] 1985 pêcher feuille, tige, racine takadiastase ferricyanure
[56] 1993 conifère aiguille, tige, racine 15 mL W, bouillante, 2 min AMG, 55 °C, 48 h, agitation PAHBAH
[119] 1995 rosier feuille, bourgeon, fleur, tige, racine autoclave, 130 °C, 2 bar, 1 h AMG, 55 °C, 2 h PAHBAH
[66] 1973 prunier feuille, tige, racine W, bouillante, 3 min AMG a.phénolsulfurique
[5] 1953 robinier écorce a perchlorique 4,7N iodine
[25] 1988 pommier bois, écorce, racine a. perchlorique 30 %, 25°C Précipitation par solution

de I2-KI puis HCl
Photométrie
[47] 1973 pommier racine, tronc, branche a. sulfurique 1N, bouillant, 7 h 14C
[63] 1979 peuplier feuile W, bouillante, 30 min Clarase ou diazyme 14C
[77] 1988 peuplier feuille a. chlorhydrique 20 % 13C
Classement selon la méthode de dosage du glucose.
Travaux sélectionnés parmi 45 articles recensés, non redondants quant aux auteurs, matériel végétal et méthodologie.
W : eau ; DMSO : diméthylsulfoxide ; AMG : amyloglucosidase ; HK : hexokinase ; G6PDH : glucose 6P-déshydrogénase ; GOD : glucose oxydase ; POD : peroxydase ; IK : iodure de potassium ; PAHBAH : acide p-hydroxybenzoïque hydrazine ; INT : iodonitrotétrazolium.

Près du tiers des dispersions sont réalisées dans des conditions plus douces, à chaud avec de l’eau, voire un tampon acétate (tableau 2). Comme pour les attaques chimiques, ces conditions sont très variables, eu égard à la durée de la réaction (quelques min à 2 h). L’autoclavage (1 h à 120 °C et 2 bars), initialement proposé par Thivend, et al. [89] pour doser l’amidon en milieux complexe (céréales et légumineuses), constitue le moyen le plus élaboré et le plus fiable pour réaliser ce mode de dispersion. Cette technique enchaîne une phase d’ébullition à 100 °C permettant l’éclatement des grains d’amidon, puis une phase sous pression (2 bars) favorisant la libération et la mise en solution de ce polysaccharide de réserve. La comparaison avec une hydrolyse par KOH [90] nous a permis de confirmer son efficacité (précision, justesse) à disperser l’amidon de PV ligneuses. Réalisée en milieu aqueux, elle permet en outre un réajustement au pH optimal de l’hydrolyse enzymatique de l’amidon, plus aisé qu’il ne l’est après une attaque chimique. Cependant, la nature de l’échantillon et l’accessibilité de l’amidon parfois encapsulé dans un réseau protéique serré, peuvent limiter les performances de l’autoclavage et justifier le choix d’une attaque plus corrosive [88]. La préparation de l’échantillon (cf. supra, le paragraphe Broyage) a une grande influence sur l’efficacité de cette phase de dispersion en favorisant l’accessibilité et la libération de l’amidon stocké.

Hydrolyse

La nature de l’amidon se caractérise en particulier par la proportion d’amylose (chaînes linéaires) et d’amylopectine (chaînes ramifiées). Cette caractéristique structurale conditionne l’efficacité de l’hydrolyse, l’amidon étant d’autant plus résistant qu’il est riche en amylose.
La dégradation de l’amidon dispersé s’effectue classiquement par voie enzymatique ou chimique. De par sa spécificité, la voie enzymatique est préférable à une attaque chimique, capable d’une hydrolyse partielle des glucides pariétaux [19, 91] à l’origine d’une surestimation de la teneur en amidon [55]. En outre, l’efficacité d’une attaque chimique varie selon la nature de l’amidon [79]. Le taux de recouvrement de l’amidon après une hydrolyse acide serait d’autant plus faible que le chaînon d’amidon est long : 91,7 % pour un taux de polymérisation de 6 contre 90 % s’il est supérieur à 24. La dégradation partielle par l’acide du glucose libéré est également envisageable pour expliquer une sous-estimation de la teneur en amidon.
L’utilisation d’enzymes, d’une spécificité bien établie [92], paraît moins problématique et plus fiable. Des critiques portent néanmoins sur la qualité des extraits enzymatiques commercialisés [18, 93-96] ou sur la contamination glucidique par le biais des supports de ces enzymes [97]. Malgré tout, Rose, et al. [84] considèrent négligeable la surestimation de l’amidon imputable à l’emploi d’enzymes non purifiés. Contrairement à Denison, et al. [96], Hendrix [35] ne retrouve pas, dans plusieurs préparations d’amyloglucosidase, d’activité cellulolytique importante. Il note toutefois que ces enzymes possèdent une légère activité glucanase et la capacité d’hydrolyser la cellobiose. Pour minimiser ces dégradations, Hendrix recommande de limiter le temps d’exposition aux enzymes, ce qui est en contradiction avec d’autres procédures (tableau 2). Une purification préalable de l’enzyme autorise une conception plus libre et plus sûre de cette étape d’hydrolyse [51].
Alors que la température réactionnelle est assez constante (voisine des 55 °C requis pour une activité optimale de l’enzyme), la durée d’hydrolyse est très variable (de 1 à 48 h). La préparation de l’échantillon, la technique d’extraction de l’amidon, le type d’amidon et la quantité d’unités enzymatiques employée peuvent expliquer cette diversité. Chez le pêcher, nos conditions expérimentales (50 mg PV autoclavé, 30 UI d’amyloglucosidase en solution, pH 4,6, agitation permanente à 56 °C) garantissent, en moins de 2 h, une hydrolyse complète de l’amidon dispersé [90].
Outre l’amyloglucosidase, d’autres enzymes sont employés, tels que la diastase de malt [45, 98], la diazyme 325 et la clarase [99, 100]) ou encore la takadiastase [58, 101, 102], dont la préparation commerciale s’avère être un mélange d’enzymes comprenant l’α-amylase et la maltase [79]. L’α-amylase est également utilisée seule [31, 103, 104]), bien qu’elle n’attaque que les liaisons 1-6 présentes dans l’amylopectine. Cela conduit à la formation de dextrines et par conséquent à sous-estimer la teneur en amidon [55]. De plus, elle possède une activité β-glucanase pénalisante [94], car susceptible de libérer du glucose. L’action de l’α-amylase pourrait être optimisée par la gélatinisation préalable de l’amidon [105].
Le plus souvent employée seule, l’amyloglucosidase peut néanmoins être associée à un autre enzyme. L’utilité de cette association, destinée à optimiser les performances de l’amyloglucosidase, est controversée. L’ajout d’α-amylase semble améliorer le taux de récupération de l’amidon pur [55] et augmente la teneur en amidon mesurée dans les racines [106]. Cependant, cet effet positif pourrait être temporaire et disparaître avec l’allongement du temps de la réaction enzymatique, comme nous le constatons chez des échantillons de pécher tant aériens que racinaires, après 2 heures d’activité enzymatique [données non publiées]. Ces observations corroborent celles d’Hendrix sur des feuilles de cotonnier [35] qui montre que l’ajout d’un second enzyme n’a pour seul intérêt que de raccourcir la durée de la procédure expérimentale.

Dosage des sucres

Au-delà de la nécessaire adéquation avec les objectifs expérimentaux, plusieurs contraintes telles que le budget, l’équipement et la compétence humaine du laboratoire, guident le choix d’une technique de dosage des sucres. Nos statistiques portent sur 55 (dosage des sucres solubles) et 45 articles scientifiques (dosage de l’amidon), non redondants quant aux auteurs, matériel végétal et méthodologie. Une partie représentative de ces articles, pour la plupart cités dans le texte, constitue les tableaux 1 et 2. Il apparaît que les SS des ligneux sont majoritairement dosés par chromatographie (50 % des études répertoriées) et par colorimétrie ou volumétrie (34 %). Les techniques colorimétriques, plus faciles à mettre en œuvre, sont préférées pour réaliser la détermination globale des sucres alors que les options enzymatiques et chromatographiques, plus contraignantes dans leur réalisation, offrent des bilans détaillés. La proportion étonnamment faible des dosages enzymatiques (11 %) peut s’expliquer par l’absence d’automatisation et par une analyse individuelle des sucres, longue et coûteuse. Ils sont cependant privilégiés (33 % des cas), comme les dosages colorimétriques (48 %), pour l’analyse du glucose après hydrolyse de l’amidon, alors que le dosage d’un sucre seul ne justifie pas une analyse chromatographique (12 % des études, cependant).
Certaines études sont difficiles à répertorier dans la mesure où elles combinent plusieurs techniques pour les différents fractions glucidiques analysées. À titre d’exemple, Lewis et Harvey [75] utilisent d’abord la chromatographie sur papier et l’hydrolyse enzymatique des disaccharides pour identifier les SS, puis le dosage à l’anthrone et la réduction du Cu++  pour quantifier respectivement les SS totaux et les sucres réducteurs.
Cet inventaire fait également apparaître la possibilité de quantifier les GNS par mesure isotopique du carbone (13C et 14C), après fractionnement des composants organiques sur résines [63, 66, 77], et montre surtout l’utilisation de techniques de mesures dans le proche infrarouge (SPIR) [107]. Cette technologie non destructive du végétal repose sur l’absorption différentielle des longueurs d’onde dans le proche infrarouge selon les constituants de la matière. Le développement pour les ligneux de cette technologie, depuis longtemps utilisée pour les céréales et les fourrages [108, 109] offre des perspectives dans le domaine de l’analyse biochimique de matériel végétal vivant. L’analyse d’un spectre recueilli à la surface d’une pêche permet déjà une estimation acceptable de ses teneurs en SS [110]. Cependant, la grande diversité matricielle observée entre organes ou tissus d’un même végétal ligneux, constitue actuellement un obstacle majeur à l’utilisation généralisée de la méthode SPIR, l’analyse s’effectuant par rapport à une gamme d’au moins 50 échantillons d’origine botanique identique. En outre, il est encore impossible d’effectuer une mesure non destructrice au niveau d’un tissus non superficiel (bois de tronc, par exemple).

Dosages enzymatiques

Ce sont à la fois les dosages les plus sensibles et les plus spécifiques [27, 35, 111, 112]. Une première étape enzymatique à l’aide d’invertase, isomérase et autres déshydrogénases [112] permet généralement de transformer les sucres en glucose, la forme glucidique la plus analysée. La glucose 6-phosphate déshydrogénase (estérification du sucre) associée à l’hexokinase est statistiquement la méthode enzymatique la plus courante pour doser le glucose, en particulier dans le cadre du dosage indirect de l’amidon des ligneux (tableau 2). La réaction enzymatique s’accompagne de la formation de NADH dont la production, mesurée à 340 nm, est proportionnelle à la quantité de sucre présent [112]. Le dosage à la glucose oxydase asociée à une peroxydase (méthode GODPOD) est la seconde option enzymatique pour doser le glucose [113]. Cette fois-ci, l’eau oxygénée produite par l’oxydation du glucose réagit avec un donneur d’hydrogène en donnant une coloration verte (mesurée à 560 nm), proportionnelle à la quantité de glucose présent.
La purification des extraits glucidiques ne permet pas l’élimination d’une absorbance, d’importance aléatoire, imputable à la matrice végétale soluble. Cette interférence au dosage doit être prise en compte par la réalisation de blancs, à savoir des mesures d’absorbance effectuées avant l’ajout d’enzyme [90].
Contrairement à la chromatographie, le dosage enzymatique ne révèle que les sucres recherchés, ce qui peut constituer un inconvénient majeur lorsque le profil glucidique est mal établi ou variable selon les conditions expérimentales. Si ce n’est pas le cas, et dans l’hypothèse où les enzymes sont commercialement disponibles, la principale contrainte analytique réside dans la nécessité de doser successivement les différents sucres. Les déterminations réalisées sur un même extrait, après ajouts successifs d’enzymes, restent délicates malgré des efforts de simplification [27]. L’utilisation d’automates (auto-analyseur ou lecteur de microplaques) [35, 114] ouvre cependant de nouvelles perspectives avec des rendements très performants du fait de la miniaturisation des méthodes (économie de réactifs). Enfin, en l’absence d’équipement, la disponibilité de kit d’analyses facilite la mise en œuvre de dosages bien que le coût en soit souvent élevé.

Analyses chromatographiques

Après que les premières analyses chromatographique des glucides chez les ligneux ont été réalisées sur papier ou sur couche mince dans les années 1960 [75, 115], l’emploi des techniques hautement résolutives que sont la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et la chromatographie liquide haute performance (CLHP) est devenu fréquent depuis une vingtaine d’années (tableau 1). La CPG est une méthode très sensible qui nécessite cependant la dérivation des sucres (dérivés silylés ou acétate d’alditols) pour les rendre volatils et l’emploi d’un étalon interne pour évaluer et corriger les pertes en sucres occasionnées par cette préparation. Après une phase séparatrice sur colonne, les sucres sont détectés de façon non spécifique en fonction de leur caractéristique physico-chimique, le plus souvent par réfractométrie (CLHP) ou ionisation de flamme après dérivation (CPG). L’ampérométrie pulsée, la spectrométrie de masse (après marquage isotopique) et la fluorimétrie sont des techniques de détection également utilisées.
La séparation des sucres par CLHP est fonction de leur affinité avec la phase stationnaire. Il existe plusieurs mécanismes de séparation comme la formation de liaisons hydrogènes avec les groupements silanols d’une silice vierge, la rétention sur gel de silice greffée amine, ou encore la séparation de complexes borate - sucres anioniques sur résine échangeuse d’anions. Cependant la méthode la plus performante utilise des résines échangeuses de cations comme celle de la colonne Sugar Pack de Waters [53]. La séparation s’effectue selon un mécanisme complexe faisant intervenir l’échange d’ions et l’exclusion sur tamis moléculaire (séparation des composés selon l’encombrement stérique, les grosses molécules étant éluées en premier). L’identification des sucres s’effectue sur leur temps d’élution (délais d’apparition au niveau du détecteur après injection), par similitude avec l’élution d’un sucre étalon. Une erreur d’identification, ou pour le moins d’estimation, de la concentration d’un sucre est cependant possible par superposition totale ou partielle de plusieurs pics d’élution (deux sucres peuvent avoir le même temps d’élution). La détermination complète et concomitante de la composition glucidique d’un mélange demeure néanmoins l’attrait essentiel de méthodes par ailleurs moins sensibles et moins spécifiques qu’une méthode enzymatique.
Quel que soit le milieu (liquide ou gazeux) la préparation des extraits est lourde, même si une purification en ligne est possible à l’aide de pré-colonnes. En CPG, la dérivation des sucres pour les transformer en composés volatils est nécessaire, alors qu’en CLHP une purification insuffisante ou inappropriée affecte la résolution des chromatogrammes et la durée de vie des colonnes. Boersig et Negm [69] évoquent l’interconversion des sucres au cours d’une phase de purification complexe lorsque la quantité de résine utilisée est trop importante, le flux d’élution trop lent ou encore que le pH de la phase éluente est trop bas. La diversité des échantillons ligneux explique en partie l’efficacité aléatoire d’une préparation [19]. En complément d’une purification élaborée des extraits (élimination des lipides par le chloroforme, des phénols par PVP, des chaînes apolaires par colonne C18), l’utilisation d’un standard interne (maltotriose) garantit une mesure fiable de la composition glucidique d’un échantillon ligneux par CLHP [53].

Analyses colorimétriques

Les techniques colorimétriques sont aujourd’hui moins utilisées du fait de leur moindre spécificité (quantification précise du glucose impossible selon Haissig et Dickson [100]), de leur faible précision (mauvaise reproductibilité nécessitant, de fait, la réalisation d’une gamme étalon à chaque série de dosage [41]) et des améliorations dont ont bénéficié les méthodes alternatives, notamment pour l’obtention d’un bilan glucidique détaillé. Cependant, leur facilité de mise en œuvre, leur complète automatisation et leur faible coût font qu’elles demeurent compétitives pour le dosage indirect de l’amidon ou pour une quantification globale des réserves glucidiques, particulièrement lorsque des interconversions entre sucres ne peuvent être évitées lors des étapes préparatoires. Quoique rarement utilisé, le dosage colorimétrique individuel des SS est néanmoins possible, comme le proposent Lasheen et Chaplin [52], après séparation des sucres sur résine (dosage à l’orcinol sulfurique). La combinaison de plusieurs méthodes colorimétriques permet également d’établir un bilan glucidique détaillé [62].

Il existe deux grandes familles de techniques colorimétriques permettant la mesure des sucres totaux ou des sucres réducteurs. Toutes nécessitent une purification des extraits glucidiques plus ou moins poussée selon leur spécificité. La mesure des sucres totaux (2/3 des dosages colorimétriques chez les ligneux) repose sur la capacité des SS, à se complexer en milieu sulfurique, avec un composé (anthrone, o-toluidine, phénols tels que l’orcinol) pour former un chromophore absorbant dans le visible. L’absorbance est proportionnelle à la quantité de SS présent. Ce dosage n’intègre pas les alditols comme le sorbitol ou l’inositol dont la prise en compte nécessiterait une oxydation préalable. Que ce soit pour le dosage colorimétrique des sucres totaux (tableau 1) ou celui du glucose provenant de l’hydrolyse de l’amidon (tableau 2), la méthode à l’anthrone est la plus courante chez les ligneux. Cette méthode présente l’avantage d’être utilisable sur des extraits éthanoliques [116]. Selon la température réactionnelle, il est possible de mesurer séparément le glucose (95 °C) et le fructose (25 °C) [117]. Cependant, sa sensibilité varie selon la nature des sucres et l’expression des résultats en équivalents glucose (i.e. par comparaison à une gamme glucose) s’avère imparfaite [118]. Plus précise que la méthode à l’anthrone, la méthode à l’orcinol sulfurique [52] affiche néanmoins une faible spécificité à 420 nm qui nécessite l’élimination préalable des protides [41]. La réaction colorée des aldo-hexoses avec l’o-toluidine en milieu acide [72] peut être employée pour mesurer le glucose après hydrolyse de l’amidon [99].
La mesure des sucres réducteurs repose sur leur capacité à s’oxyder au niveau de leur fonction aldéhyde (aldose comme le glucose) ou cétonique (cétose comme le fructose) : ils peuvent réduire des formes cationiques (Cu++, bleu de tétrazolium, etc.) et les rendre absorbantes dans le visible, ou réactionnelles avec un composé devenant lui-même coloré (absorbance proportionnelle à la quantité de sucres réducteurs en solution).
La réduction de l’acide dinitrosalicylique (DNSA) et celle de l’hydrazyde de l’acide parahydroxybenzoïque (PABAH) en milieu alcalin [56, 99, 119] sont moins utilisées chez les ligneux que la réduction d’un ion métallique [3, 5, 58, 120]. En l’occurrence, les auteurs préfèrent la réduction du ferricyanure en ferrocyanure (méthode FCN), à celle de l’ion métallique Cu++ (sel cuivrique) en 2 Cu+, plutôt utilisée pour l’analyse des fourrages et des céréales [41]. La spécificité de la méthode FCN est affectée par la présence de substances colorées comme les pigments. Leur élimination (cf. supra, le paragraphe Purification) ou la prise en compte de l’absorbance qui leur est imputable, comme le suggère Hoogenboom [34], est nécessaire.
Le dosage des sucres réducteurs ne concerne pas les polyalcools comme le sorbitol ou l’inositol, ni les diholosides non-réducteurs comme le saccharose. Le dosage de ce dernier nécessite au préalable une hydrolyse enzymatique (invertase) ou chimique (acide chlorhydrique) [34, 62] alors que celui des polyalcools implique l’oxydation d’une fonction alcool.
La présence importante d’alditols chez les ligneux fruitiers comme le pêcher, justifie leur analyse par voie enzymatique [28] ou éventuellement chromatographique.

Conclusion et perspectives

Objectifs scientifiques et contraintes expérimentales doivent justifier le choix d’une procédure parmi les options offertes aux expérimentateurs pour l’analyses des GNS chez les ligneux (figure 5). Il apparaît nettement que l’objectif analytique conditionne l’obtention et la conservation d’une PV tandis que le niveau de purification des extraits dépend de la technique de dosage retenue. A priori, le choix des solvants d’extraction des SS comme le moyen de dispersion et d’hydrolyse de l’amidon ne conditionne pas la réalisation d’une analyse qualitative des GNS. Néanmoins, au terme de cette étude bibliographique, les cellules sur fond vert traduisent nos préférences pour l’obtention d’un bilan détaillé des GNS. En accord avec cette sélection, nos travaux méthodologiques [53, 90] ont permis d’établir, étape par étape, la fiabilité d’une procédure utilisant les options analytiques les plus performantes pour réaliser ce type de bilan (figure 6). Originale par son étape d’extraction des SS à partir d’une PV lyophilisée, elle associe les performances de l’analyse chromatographique pour le dosage des SS (analyse exhaustive d’une mélange glucidique) à celles du dosage enzymatique du glucose libéré après dispersion par autoclavage et hydrolyse enzymatique de l’amidon (sensibilité et spécificité). La validation en cours d’une méthode de dosage des GNS par voie enzymatique sur « microplaque » devrait prochainement nous permettre non seulement de proposer une étape de purification simplifiée (moins exigeante que pour un dosage chromatographique) mais également de valider une méthode miniaturisée (PE de quelques mg d’échantillon), mieux adaptée à des expérimentations générant de nombreux échantillons de petites tailles.
Dans les années à venir, le développement méthodologique des techniques SPIR pourrait nous permettre d’établir la composition en sucres des différentes parties ligneuses de l’arbre par l’analyse de mesures spectrales effectuées au verger (travaux en cours). Un tel progrès aurait des conséquences évidentes sur l’analyse biochimique, mais également sur la conduite expérimentale du fait de l’aspect non destructif des mesures n

Remerciements

Les auteurs remercient Gilles Vercambre pour son assistance scientifique, Doriane Bancel, Josiane Hostalery, Safia Médiène et Emilie Rubio pour leur assistance technique

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