Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of four antiproteases in human plasma

ARTICLE

Le virus d'immunodéficience humaine (VIH), l'agent responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) possède 3 enzymes principales : la protéase, la transcriptase inverse et l'intégrase. La protéase du VIH est essentielle pour cliver les précurseurs protéiques nécessaires à la maturation du virus. Plusieurs études suggèrent l'intérêt de cette enzyme en tant que cible thérapeutique [19]. Aujourd'hui quatre inhibiteurs de protéases ou antiprotéases sont disponibles :

Indinavir, N-[2(R)-hydroxy-1(S)-indanyl]-5-[[2(S)-tert-butylaminocarbonyl]-4-(3-pyridylmethyl)piperazino]-4(S)-hydroxy-2(R)-phenylmethyl-pentanamide. Crixivan^®

Nelfinavir, N-tert-butyl-2-[2(R)-hydroxy-3(R)-[(3-hydroxy-2-methylbenzoyl)amino]-4-(phenylsulfanyl)butyl]decahydro-(4aS,8aS)-iso-quinoline-3(S)-carboxamide monomethanesulfonate. Viracept^®

Ritonavir, 10-hydroxy-2-methyl-5-(1-methylethyl)-1-[2-(1-methylethyl)-4-thiazolyl]-3,6-dioxo-8,11-bis(phenyl-methyl)-2,4,7,12 teraazatridecan-13-oic-acide,5-thiazolylmethyl ester, [5S-(5R*,8R*,10R*,11R*)]. Norvir^®

Saquinavir, cis-N-butyldecahydro-2-(2(R)-hydroxy-4-phenyl-3(S)-{[N-2-(quinolyl-carbonyl)-L-asparaginyl]amino}butyl)-(4aS,8aS)-isoquinoline-3(S)carboxamide methylsulfonate. Invirase^®, Fortovase^®

Les formules développées des composés sont représentées dans la figure 1.

Ces molécules sont utilisées en association entre elles et avec d'autres antirétroviraux. Les antiprotéases sont des inhibiteurs potentiels des cytochromes P450 (en particulier du CYP3A4/5) [5]. Le ritonavir peut modifier favorablement le profil pharmacocinétique des autres antiprotéases [13], mais peut aussi altérer la pharmacocinétique d'autres médicaments. A l'heure actuelle, de nombreux patients sont traités par tri ou quadrithérapies associant des inhibiteurs de la transcriptase inverse et une ou deux antiprotéases. Deux antiprotéases peuvent être associées pour réduire le métabolisme hépatique de l'une des deux, et augmenter de façon significative la biodisponibilité : ritonavir + saquinavir, nelfinavir + saquinavir. L'intensité et la fréquence des interactions médicamenteuses nécessitent alors d'étudier l'impact cinétique et clinique de telles associations [1].

Une méthode de dosage permettant le dosage simultané du ritonavir et du saquinavir a été publiée [6]. Des méthodes de dosages CLHP individuelles ont été publiées pour l'indinavir [3, 4, 12, 21], le nelfinavir [22], le saquinavir [7, 8, 14] et le ritonavir [9, 15]. Une méthode permettant de déterminer simultanément les concentrations plasmatiques de ces médicaments est utile pour évaluer les interactions pharmacocinétiques et leur niveau de concentration efficace. Deux méthodes simultanées [11, 20] ont déjà été publiées, celle-ci se veut facile d'accès et plus spécifique.

Matériel et méthode

Réactifs et solutions

Les matières premières ont été gracieusement fournies par les laboratoires pharmaceutiques respectifs : le sulfate d'indinavir par Merck Sharp & Dohme-Chibret Lab. (West Point, PA, États-Unis) ; le mésylate de nelfinavir par les laboratoires Agouron (La Jolla, CA, États-Unis) ; le ritonavir par les laboratoires Abbott (Illinois, États-Unis) ; le mésylate de saquinavir par les produits Roche (Neuilly-sur-Seine, France); la 4-aminoquinaldine utilisée comme étalon interne a été obtenue auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, États-Unis).

Les gammes d'étalonnage sont préparées en diluant la quantité nécessaire de solutions filles méthanoliques de chaque composé dans du plasma humain vierge. Les gammes de concentration ont été définies en fonction des concentrations plasmatiques attendues : de 0,05 à 10 mug/ml pour l'indinavir et le nelfinavir, de 0,005 à 1 mug/ml pour le saquinavir et de 0,5 à 20 mug/ml pour le ritonavir.

L'acétonitrile (Lichrosolv, Merck, Darmstadt, Allemagne), et le ter-butyl-méthyl-éther (TBME) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) sont de qualité chromatographique. Le méthanol (Uvasol, Merck, Darmstadt, Allemagne) est de qualité spectroscopique.

L'hydrogénophosphate de sodium (Na₂HPO₄) (Merck, Darmstadt, Allemagne), l'acide orthophosphorique 85 % (H₃PO₄) (Merck, Darmstadt, Allemagne), et l'hydroxyde de sodium (Normapur, Prolabo, France) sont de qualité analytique.

Système chromatographique

Le système CLHP comprend deux pompes 114 M (Beckman, Berkeley, CA, États-Unis) à débit fixé à 1,0 ml/min, un injecteur automatique Wisp712 (Waters, Milford, MA, États-Unis), un système de commutation de vanne EPS 130 (Eurosas, Le Blanc-Mesnil, France), deux détecteurs spectrophotométriques lambda max modèle 481 et 480 (Waters, Milford, MA, États-Unis). L'ensemble est connecté à un système Gold 2 de traitement des données (Beckman, Berkeley, CA, États-Unis). Une première colonne hypersil-phényl (100 x 4,6 mm, diamètre 5 mum, Merck) est connectée au commutateur de vanne vers la colonne analytique, colonne inertsil-phényl (250 x 4,6 mm, diamètre 5 mum, Waters), thermostatées à 37 °C dans un four Croco-cil (Cil Cluzeau Info Labo, Sainte-Foy-la-Grande, France).

Conditions chromatographiques

La phase mobile est composée d'un tampon phosphate Na₂HPO₄ à 0,03 M (dont le pH est ajusté à 7,5 par H₃PO₄) filtrée à travers un filtre 0,22 mum Durapor GVWP (Millipore, Bedford, MA, États-Unis) et d'acétronitrile (45/55 ; v/v), puis dégazée aux ultrasons.

Le volume d'injection est de 100 mul.

Le spectre moléculaire de chaque molécule, obtenu dans les conditions chromatographiques par un détecteur barrette de diode UV (Spectra Focus, Thermo Separation Products, Fremont, CA, États-Unis) montre leurs maxima d'absorbance dans l'ultra-violet (figure 2). Bien que toutes les molécules absorbent à 210 nm, le coefficient d'extinction de l'éluant étant élevé à cette longueur d'onde, le rapport signal/bruit est significativement plus faible. La longueur d'onde choisie pour le ritonavir et le saquinavir est donc 240 nm, et 261 nm pour le nelfinavir et l'indinavir.

Programmation du commutateur de vanne

Les temps auxquels la commutation doit intervenir sont déterminés à chaque série. Pendant l'injection de l'échantillon, le système est en position 1, et l'éluant sortant de cette colonne est dirigé vers la poubelle. La commutation vers la position 2 est programmée entre t₁ et t₂ de telle sorte que l'éluant soit dirigé vers la colonne analytique. Au temps t₂, la commutation revient en position 1 et la fraction collectée dans la colonne 2 est chromatographiée (figure 3).

Pour cela, le système est en position 1 et la colonne 1 est connectée directement aux détecteurs. Un échantillon « injection directe » est préparé à partir de 10 mul de chaque solution mère diluée dans de la phase mobile. 100 mul de cet échantillon sont injectés dans le système modifié. Le temps t₁ (environ 2 minutes) correspond au début de l'élution du premier composé (indinavir) et le temps t₂ (environ 6 minutes) correspond à la fin de l'élution du dernier composé (nelfinavir). Lorsque les temps ont été déterminés, le système est reconnecté selon la figure 3. Les temps sont programmés pour que le système soit en position 1 au début de l'analyse, passe en position 2 entre t₁ et t₂, et revienne en position 1 à t₂.

Stabilité des solutions

Les solutions mères à 1 mg/ml sont préparées par dissolution de 20 mg de l'équivalent base de chaque composé dans 20 ml de méthanol, et sont conservées à ­ 20 °C.

Les solutions filles sont préparées par dilutions successives de la solution mère dans le méthanol.

L'influence des cycles de congélation/décongélation a été testée sur des échantillons plasmatiques à des concentrations faibles, moyennes, et fortes, ainsi que la conservation à ­ 20 °C pendant un mois.

Certains analogues nucléosidiques comme le ganciclovir [2] ne sont pas stables plus de 15 minutes à température ambiante en milieu plasmatique. La stabilité des antiprotéases a été testée à partir d'échantillons plasmatiques (3 aliquots de 3 niveaux de concentrations différentes), dont une série a été centrifugée immédiatement à 2 000 g pendant 15 minutes à + 4 °C, la seconde série a été centrifugée après 2 heures et la dernière après 24 heures à température ambiante. Les échantillons ont été conservés à ­ 20 °C et chromatographiés selon le protocole décrit.

L'inactivation virale à 56 °C pendant 30 minutes est une méthode largement utilisée [18]. Pour tester l'inactivation virale, des échantillons à trois niveaux de concentrations ont été placés au bain-marie à 60 °C pendant 30 minutes.

Procédure d'extraction

Dans des tubes siliconés de 15 ml (Venoject, Terumo, Liège, Belgique), 1 ml de plasma provenant de prélèvements sur héparinate de lithium, et d'échantillons plasmatiques surchargés (gamme et contrôles) (tableau I), contenant 100 mul d'étalon interne à 10 mug/ml, sont alcalinisés par 50 mul d'hydroxyde de sodium 1 M.

Les plasmas sont extraits par 7 ml de TBME. Les tubes sont bouchés, puis agités horizontalement pendant 20 minutes. Ils sont ensuite centrifugés à 3 000 g pendant 10 minutes. Les tubes sont placés dans un bain de carboglace et d'acétone afin de congeler la phase aqueuse. La phase organique est transvasée dans des tubes propres et évaporée sous flux d'azote, dans un bain-marie à 37 °C. Le résidu est repris par 250 mul de phase mobile.

Exactitude, reproductibilité, répétabilité

L'exactitude définit l'erreur sur les concentrations calculées par rapport aux concentrations théoriques. Les études de répétabilité et de reproductibilité ont été effectuées sur trois niveaux de concentrations, en six exemplaires sur une même journée (répétabilité) et une fois sur six journées différentes (reproductibilité).

Linéarité, rendements d'extraction et limite de quantification

La linéarité a été étudiée jusqu'au point de gamme le plus fort (tableau I). Les rendements d'extraction sont déterminés en comparant les hauteurs de pics d'échantillons extraits (3 aliquots à 3 niveaux de concentrations différents) aux hauteurs d'échantillons contenant la même quantité de médicament injectée directement. La limite de quantification est définie comme étant la concentration pour laquelle le coefficient de variation et l'exactitude sont inférieurs à 20 %.

Interférences

Les molécules des traitements concomitants le plus souvent prescrits aux patients VIH ont été chromatographiées dans ces mêmes conditions. Chaque molécule a été mise en solution dans la phase mobile à la concentration de 50 mug/ml et dissoute dans du plasma humain vierge, extraite puis injectée. Les temps de rétention ont été comparés à ceux des antiprotéases dans les mêmes conditions chromatographiques (tableau II).

Résultats

Séparation et résolution

Les chromatogrammes obtenus à partir d'échantillons plasmatiques vierges, surchargés ou de patient recevant 2 antiprotéases sont reportés dans les figures 4, 5 et 6. Les cinq pics sont bien séparés sans interférence des composés endogènes.

Les temps de rétention sont d'environ 7,8 minutes pour l'indinavir, 8,3 minutes pour la 4-aminoquinaldine, 13,6 minutes pour le ritonavir, 15,1 minutes pour le saquinavir et 20,7 minutes pour le nelfinavir.

Cinq cent échantillons peuvent être analysés sur la même colonne sans perte de résolution.

Spécificité

Les composés élués dont les temps de rétention sont proches de l'un des composants sont reportés dans le tableau II. L'amprénavir peut être chromatographié dans ces conditions, son temps de rétention est de 8,9 minutes, et son rendement d'extraction de plus de 90 %. L'efavirenz et la névirapine ne sont pas chromatographiées dans ces conditions ; elles n'interfèrent pas avec les antiprotéases.

Exactitude, reproductibilité, répétabilité

Les coefficients de corrélation (r) des droites de régression des courbes de calibration sont supérieurs à 0,998 pour tous les composés. La méthode est reproductible et répétable pour des niveaux de concentration bas, moyen et fort comme le montrent les coefficients de variation (CV) du tableau III.

Linéarité, rendements d'extraction et limite de quantification

Les courbes de calibration sont linéaires de 0,05 à 10 mug/ml pour l'indinavir et le nelfinavir, de 0,5 à 20 mug/ml pour le ritonavir et de 0,005 à 1 mug/ml pour le saquinavir.

Les rendements d'extraction sont tous supérieurs à 85 %. La limite de quantification est de 0,05 mug/ml pour l'indinavir et le nelfinavir ; 0,5 mug/ml pour le ritonavir ; et de 0,005 mug/ml pour le saquinavir.

Stabilité

Les solutions mères sont stables au moins 6 mois à ­ 20 °C. Les solutions filles conservées à + 4 °C sont stables au moins un mois.

Les échantillons surchargés ne montrent aucune diminution de la concentration en antiprotéases due aux cycles de congélation/décongelation, et sont parfaitement conservés à ­ 20 °C pendant un mois.

Le traitement d'inactivation virale ne dégrade pas significativement l'indinavir, le nelfinavir, le ritonavir, et le saquinavir.

Discussion

Des méthodes de dosages ont été publiées pour établir les profils pharmacocinétiques de chaque antiprotéase séparément.

Woolf et al. proposent une méthode pour le dosage de l'indinavir utilisant aussi un commutateur de vanne. Cette méthode utilise une colonne cyanée et une colonne C18, suivie d'une détection à 210 nm. Elle est validée pour une gamme de concentrations allant de 5 à 500 ng/ml [21]. Wu et al. proposent une méthode pour le dosage du nelfinavir utilisant une colonne C18 et une détection à 210 nm. La limite de quantification de cette méthode est de 0,05 mug/ml et n'utilise que 250 mul d'échantillon plasmatique [22]. Les longueurs d'onde maximales pour l'indinavir et le nelfinavir sont respectivement 210 et 220 nm. Ces longueurs d'onde sont relativement peu spécifiques pour la détection, et le rapport signal-bruit peut être amélioré en utilisant 261 nm comme longueur d'onde de détection (8,2 vs 2,4). Ce sont donc les longueurs d'onde du second maximum d'absorption qui ont été choisies.

La quantification du saquinavir par spectrométrie de masse a été décrite par Knebel et al. [14]. Hoetelmans et al. [8] proposent une détection UV à 239 nm, après extraction du saquinavir à partir de 0,6 ml d'échantillon sur colonne chromatographique C2 échangeuse d'ion. Cette méthode a été validée pour des concentrations allant de 2,5 à 4 000 ng/ml. La spectrométrie de masse est difficile à utiliser ; et une détection UV à 240 nm est tout à fait adaptée pour détecter des concentrations de saquinavir supérieures à 5 ng/ml. Hoetelmans et al. [9] ont mis au point une méthode de dosage du ritonavir par chromatographie liquide échangeuse d'ions couplée à une détection UV à 239 nm, utilisant une prise d'essai de 100 mul. Une simple précipitation par l'acétonitrile permet de quantifier des concentrations allant de 0,05 à 50 mug/ml. Marsh et al. [15] proposent une méthode en phase inverse sur colonne C18, après extraction liquide-liquide, suivie d'une détection UV à 205 nm. Cette méthode est validée pour des concentrations de 0,01 à 15 mug/ml. La seule méthode quantifiant simultanément 2 antiprotéases (ritonavir et saquinavir) a été mise au point par Frappier et al. [6]. Cette méthode nécessite 600 mul de plasma et une extraction préalable solide-liquide sur colonne C18.

Hugen et al. [11] ont mis au point une méthode dosant aussi ces quatre antiprotéases ; cette méthode diffère de celle décrite par le choix de la longueur d'onde qui est moins spécifique à 215 nm. Van Heeswijk et al. [20] ont publié une méthode dosant simultanément les cinq antiprotéases, cette méthode utilise une extraction solide-liquide dont les rendements sont inférieurs aux nôtres.

Une colonne phényl permet d'améliorer la résolution des pics. De plus la 4-aminoquinaldine, choisie comme étalon interne, n'est chromatographiée que sur ce type de colonne.

Le principe de la commutation de vanne améliore nettement la spécificité et évite les pics tardifs susceptibles d'interférer.

La procédure d'extraction par le MTBE, à pH alcalin, convient à ces cinq molécules très lipophiles et offre un rendement d'extraction supérieur à 85 %. En utilisant des colonnes C2, Van Heeswijk et al. [20] obtiennent des rendements allant de 70 à 94 % ; de même sur colonnes C18, Poirier et al. [17] rapportent un rendement d'extraction pour l'indinavir ne dépassant pas 66 %.

L'effet du pH et de la molarité de la phase mobile sur les temps de rétention a été étudié pour optimiser les conditions chromatographiques. Un pH alcalin offre une meilleure résolution avec des temps de rétention plus longs, et la force ionique influence principalement le temps de rétention de la 4-aminoquinaldine.

L'intérêt d'une telle méthode de dosage réside dans le suivi thérapeutique d'association d'antiprotéases. En effet, les associations d'inhibiteurs de protéases sont de plus en plus utilisées, en particulier pour des raisons pharmacocinétiques. Les inhibiteurs de protéases sont tous des inhibiteurs des cytochromes (CYP3A4) de puissance différente. L'inhibiteur le plus puissant (ritonavir) est utilisé pour augmenter la biodisponibilité du saquinavir [10]. De même le nelfinavir, bien que moins puissant, est aussi utilisé comme inhibiteur métabolique du saquinavir [16].

Les concentrations plasmatiques de patients du Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière recevant des antiprotéases en association, sont récapitulées dans le tableau IV.

Ce tableau résume les concentrations plasmatiques des inhibiteurs de protéases avant la prise et au temps où la concentration est maximale (Tmax) après la prise. Ces données permettent un suivi thérapeutique de l'interaction médicamenteuse entre deux inhibiteurs de protéases. La mesure des concentrations résiduelles permet de suivre partiellement l'observance et d'estimer l'efficacité en rapport avec les données immunologiques et virologiques. La mesure des concentrations au pic permet d'évaluer une malabsorption digestive.

Les résultats confirment que la potentialisation des concentrations plasmatiques de saquinavir par inhibition métabolique est plus importante avec le ritonavir. La variabilité interindividuelle de cette association est très importante. Lorsque les posologies du ritonavir sont faibles, l'écart entre les concentrations de saquinavir résiduelles et au pic est diminué ; on observe en outre une augmentation globale des concentrations comparativement aux concentrations moyennes de saquinavir administré seul (pour une posologie de 600 mg x 3/j de saquinavir, la concentration maximale est de 0,24 mug/ml).

Cette analyse permet de vérifier l'intérêt des associations d'antiprotéases et de suivre l'évolution des concentrations plasmatiques.

CONCLUSION

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