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Improvement of carbohydrate deficient transferrin measurement by capillary zone electrophoresis using immunosubtraction of immunoglobulins and transferrin


Annales de Biologie Clinique. Volume 67, Number 4, 451-5, juillet-aout 2009, pratique quotidienne

DOI : 10.1684/abc.2009.0351

Résumé   Summary  

Author(s) : J Baraud, F Schellenberg, J-C Pagès , Laboratoire de biochimie et biologie moléculaire, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours.

Summary : CDT (Carbohydrate Deficient Transferrin) is considered as the most efficient biomarker of alcohol abuse available for routine use. Among the various methods developed for its measurement, capillary zone electrophoresis (CZE) on the multicapillary analyzer Capillarys2 provides high quality results at high throughput. However, the non CDT specific measurement of protein absorbance at 200 nm may bring abnormal profiles in samples from patients with high polyclonal immunoglobulin level or monoclonal component. We evaluated the automated immunosubtraction procedure developed by the manufacturer in 48 samples with abnormal electrophoretic profiles that potentially could interfere with CZE measurement of CDT. Elimination of the serum immunoglobulins raised the number of interpretable profiles from 19 (40%) to 37 (77%). The immunosubtraction procedure failed in samples with a monoclonal component present at a concentration > 60 g/L and in some samples harbouring a partially degraded C3 fraction. Six samples identified as genetic BC transferrin variants were also included in the study and submitted to an automated transferrin subtraction procedure to ascertain whether the additional peak were actually transferrin glycoforms. After treatment, two samples were classified as homozygote C for transferrin due to the persistence of one of the supposed transferrin peak. In conclusion, immunoglobulin and transferrin subtraction allow a better CDT measurement in most samples with interfering monoclonal components and avoid misclassification of suspected transferrin BC or CD variants.

Keywords : CDT, transferrin, capillary electrophoresis, alcohol

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ARTICLE

Auteur(s) : J Baraud, F Schellenberg, J-C Pagès

Laboratoire de biochimie et biologie moléculaire, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours

Article reçu le 31 Mars 2009, accepté le 5 Juin 2009

La transferrine est une bêta-glycoprotéine présentant plusieurs niveaux d’hétérogénéité structurale. Les variations peuvent affecter la chaîne peptidique, les chaînes oligosaccharidiques fixées sur les asparagines 413 et 611 qui peuvent être bi-, tri-, ou tétra-antennées, et enfin le nombre d’ions ferriques transportés (de 0 à 2). Le nombre d’acides sialiques terminaux des chaînes oligosaccharidiques détermine des glycoformes. Les principales formes présentes dans le plasma portent de 2 à 5 acides sialiques terminaux.

Stibler a montré que les glycoformes désialylées (disialotransferrine [DiST] et asialotransferrine [AST]) de la transferrine étaient anormalement élevées chez les patients alcooliques chroniques [1]. Cette observation a permis une définition de la CDT (carbohydrate deficient transferrin) qui correspond à la somme de la DiST et de l’AST. Le résultat s’exprime en pourcentage de CDT par rapport à la transferrine totale. La CDT s’est avérée être le marqueur sanguin le plus spécifique de la consommation alcoolique chronique [2] parmi ceux qui sont utilisables en pratique quotidienne. La valeur diagnostique de ce paramètre est nettement plus élevée que celle des marqueurs antérieurement utilisés, GGT (gammaglutamyl transférase) ou VGM (volume globulaire moyen). Le dosage de la CDT est utilisé dans le diagnostic d’alcoolisme chronique, le suivi de sevrage dans le cadre thérapeutique et dans un contexte médico-légal, commission de permis de conduire par exemple.

Le dosage de la CDT est effectué le plus souvent par des méthodes chromatographiques (HPLC) ou électrophorétiques (électrophorèse capillaire). Dans ce dernier cas, les glycoformes sont séparées par une migration à pH alcalin sous une tension élevée (7-9 kV), et détectées par la mesure de l’absorbance de la liaison peptidique à 200 nm. Une application existe pour l’appareil d’électrophorèse capillaire Capillarys™ (Sebia, Evry, France), présentant de bonnes performances analytiques [3] et une cadence élevée intéressante pour un laboratoire de routine.

Toutefois, cette technique peut être affectée par une ligne de base irrégulière qui rend impossible une quantification correcte de la CDT. En effet, la mesure d’absorbance prend en compte toutes les protéines migrant, comme les glycoformes de transferrine, dans la zone des bêtaglobulines (bloc bêta gamma chez le cirrhotique, dysglobulinémies monoclonales à chaînes entières ou à chaînes légères libres) : elle n’est donc pas une mesure spécifique de la CDT. De plus, dans un nombre limité de situations, l’existence d’un pic de même amplitude que le pic de tétrasialotransferrine (TeST) conduit à considérer à tort que l’échantillon provient d’un sujet hétérozygote BC ou CD. Dans ces cas, la variation génétique n’est pas confirmée par une mesure utilisant la méthode proposée comme méthode de référence [4].

L’immunopurification des échantillons a été proposée comme méthode de choix pour éliminer les interférences aboutissant à des profils anormaux ou à des lignes de base affectées de dérives importantes [5]. A cet effet, la société Sebia a mis au point un antisérum tétravalent anti-immunoglobulines (chaînes α, γ, κ, λ) et un antisérum anti-transferrine. L’application de ces deux solutions précède la migration, le traitement est effectué automatiquement par l’analyseur Capillarys2™.

Le présent travail avait pour but d’évaluer l’intérêt de l’immunosoustraction des immunoglobulines (Ig soustraction) ou de la transferrine (Trf soustraction) dans la technique de dosage de la CDT par électrophorèse capillaire sur un appareil Capillarys2™ (Sebia).

Matériels et méthodes

Echantillons

Dans le laboratoire de biochimie et biologie moléculaire de l’hôpital Trousseau CHRU de Tours, nous avons recueilli les sérums de patients porteurs d’anomalies sur le protéinogramme (perturbation dans les bêta et gammaglobulines) et/ou d’augmentation des chaînes légères libres monoclonales. Les sérums provenaient de bilans biologiques prescrits par les services cliniques, et pour cette étude nous avons utilisé la fraction non utilisée (« fond » de tube). Cinquante-quatre échantillons ont été inclus dans cette étude, appartenant à 2 groupes différents. Le premier groupe comprenait 48 patients avec une anomalie qualitative ou quantitative des immunoglobulines (22 pics monoclonaux en zone bêta, 8 pics monoclonaux en zone gamma, 14 hypergammaglobulinémies importantes [dont 9 blocs bêta-gamma], 4 patients avec des chaînes légères libres monoclonales > 1 g/L). Le second groupe était constitué de 6 patients classés comme variants génétiques BC de la transferrine par le dosage de la CDT sur Capillarys™. Les échantillons étaient conservés à - 20 °C jusqu’à leur utilisation.

Technique

L’électrophorèse capillaire a été réalisée pour tous les échantillons sur un appareil multicapillaire d’analyse de routine des protéines, le Capillarys2™ (Sebia). Les réactifs provenaient du kit commercial Capillarys CDT incluant la solution tampon (pH 8,8), la solution de rinçage, le diluant et les consommables plastiques. La technique est totalement automatisée que ce soit en méthode standard ou en méthode avec soustraction. La version du programme de l’automate utilisée durant cette étude était la révision 6.1.2 du programme du Capillarys.

Quel que soit le résultat de la mesure de la CDT, les 48 premiers échantillons constituant le premier groupe ont tous été soumis à une électrophorèse après Ig soustraction. Dans cette configuration, le dosage utilise un sérum tétravalent composé d’immunoglobulines de lapin dirigées contre les chaînes α, γ, κ, et λ, fourni par la société Sebia. Techniquement, le sérum du patient est injecté dans le capillaire après saturation en fer, l’antisérum est injecté secondairement. Ce dernier migre plus vite que l’échantillon, le rejoint, se lie aux immunoglobulines et chaînes légères libres, et les entraîne en dehors de la zone de migration de la transferrine. Lors de la mesure d’absorbance le sérum apparaît dépourvu d’immunoglobulines et de chaînes légères libres.

Les échantillons classés comme variants génétiques de la transferrine constituant le second groupe ont été analysés après transferrine soustraction. Le sérum anti-transferrine est composé d’immunoglobulines de mammifère anti-transferrine. Le principe est le même que pour le sérum tétravalent. Le profil obtenu correspondra dans ce cas aux protéines qui persisteront dans la zone théorique de la transferrine.

Interprétation

Nous avons défini des critères d’interprétation pour le dosage de CDT sans ou avec immunosoustraction : individualisation des différentes isoformes de la transferrine, ligne de base la plus horizontale et stable possible et une densité optique maximale suffisante (DO > 0,050). Pour la soustraction de la transferrine, la disparition de tous les pics permet d’affirmer qu’ils étaient constitués de transferrine. Dans ce cas, l’échantillon traité provenait effectivement d’un sujet hétérozygote BC ou CD. La persistance d’un pic permet d’éliminer cette hypothèse, elle ne permet pas pour autant de rendre un résultat de CDT.

Résultats et discussion

Parmi les 48 échantillons analysés, 28 présentaient à l’électrophorèse capillaire une irrégularité de la ligne de base ou un pic plus ou moins important pouvant masquer les glycoformes de transferrine (figure 1). Cependant, un résultat acceptable était observé dans 19 cas, quand le pic observé était en dehors de la zone de la transferrine ou quand l’altération de la ligne de base n’empêchait pas une intégration acceptable des glycoformes de transferrine.

L’Ig soustraction a conduit à une amélioration partielle ou complète des tracés dans 39 cas (tableau 1). Le nombre de tracés permettant une intégration acceptable des glycoformes de transferrine est ainsi passé de 19 à 38 (37 en ne considérant pas un supposé variant génétique amélioré par l’Ig soustraction). Nous avons vérifié que les résultats obtenus avant et après Ig soustraction pour les 19 échantillons initialement quantifiés étaient identiques ou non significativement différents. Le tableau 1 indique pour chaque groupe d’anomalies le nombre de résultats fiables obtenus avant (n = 19) et après (n = 38) Ig soustraction. L’efficacité de l’immunosoustraction était très bonne pour les sérums présentant un pic dans la zone des bêtaglobulines, le nombre de résultats interprétables passant de 7 à 19 pour 22 échantillons. L’Ig soustraction s’est montrée moins efficace dans les échantillons présentant un bloc bêta-gamma ou une augmentation importante des gammaglobulines, avec un gain de 2 résultats sur 14 échantillons traités. Parmi les échantillons pour lesquels l’immunosoustraction n’avait pas permis d’aboutir à un résultat, deux présentaient une absence de séparation entre la trisialo- et la disialotransferrine connue sous le nom de ditribridge et rencontrée dans les atteintes hépatiques [6]. Ce groupe d’échantillons reste difficile, la méthode CLHP ne donnant un résultat que pour 7 échantillons des 13 (dans un cas, le volume d’échantillon était insuffisant pour l’analyse en CLHP).

L’Ig soustraction a échoué dans 2 situations de pic dans les gammaglobulines dont la concentration de la protéine monoclonale était supérieure à 60 g/L. Il est possible que le titre des anticorps utilisés ne permette pas l’épuration d’Ig monoclonale à de telles concentrations. Dans plusieurs autres cas, les altérations de la ligne de base dans la zone de la pentasialotransferrine n’ont pas été améliorées par le traitement. Il est possible qu’une augmentation du C3 ait contribué à cette anomalie.

Parmi les échantillons présentant un pic monoclonal, 4 comportaient une IgM (chaîne lourde μ). Malgré l’absence d’anticorps anti-μ, le traitement de ces 4 échantillons a été efficace, ce qui montre que les IgM peuvent être extraites par leur seule chaîne légère.

Six échantillons étaient classés comme variants BC de la transferrine lors de l’analyse initiale. Le logiciel du Capillarys™ aboutit à cette conclusion lorsque 2 pics importants et contigus sont détectés dans la zone de la tétrasialotransferrine. L’Ig soustraction n’a pas modifié le profil de ces échantillons, bien que l’un n’ait plus été classé comme variant après le traitement. Cinq de ces échantillons ont été soumis à une soustraction de la transferrine. Parmi ceux-ci, deux présentaient 2 pics dans la zone de la pentasialotransferrine ; ces pics demeuraient identiques après Ig soustraction ou soustraction de la transferrine, signifiant qu’ils n’étaient pas constitués d’immunoglobulines ni de transferrine. De plus, l’analyse de ces échantillons en HPLC a confirmé que ces 2 sérums étaient homozygotes C et non des variants BC. Un des deux avait été quantifié par le système, fournissant un résultat ne pouvant être considéré comme fiable. Pour les trois autres échantillons, la disparition de tous les pics a confirmé qu’il s’agissait effectivement de variants BC de la transferrine.

Tableau 1 Efficacité de la soustraction des immunoglobulines ou de la transferrine selon le type d’anomalie des immunoglobulines ou la détection d’un variant génétique dans le dosage de la CDT par électrophorèse capillaire. Les deux patients classés à tort comme variants génétiques par le Capillarys n’ont pas été inclus dans ce tableau.

Nombre

Nombre de résultats

Avant Ig soustraction

Après Ig soustraction

Fraction monoclonale dans les bêtaglobulines

22

7 (0,32)

19 (0,86)

Fraction monoclonale dans les gammaglobulines

8

3 (0,38)

6 (0,75)

Hypergammaglobulinémie

14

7 (0,50)

9 (0,64)

Chaîne légère libre monoclonale

4

2 (0,50)

3 (0,75)

Variant génétique

4

0 (0,00)

1 (0,17)

Total

52

19 (0,35)

38 (0,70)

Conclusion

L’immunosoustraction des immunoglobulines permet de diviser par 2 le nombre de cas où une protéine monoclonale empêche la mesure de la CDT en électrophorèse capillaire, aboutissant à un résultat interprétable plus de 8 fois sur 10. L’automatisation de cette procédure sur Capillarys™ permet son utilisation en pratique courante pour les échantillons présentant une altération de la ligne de base ou un profil anormal. Elle ne permet cependant pas de statuer sur les échantillons considérés comme variants génétiques par l’analyseur. L’existence d’un variant devra être confirmée par une immunosoustraction de la transferrine ou par la ré-analyse de l’échantillon par une technique CLHP.

Remerciements

Les auteurs remercient la société SEBIA pour le prêt de l’appareil et la fourniture des réactifs utilsés dans cette étude.

Références

1 Stibler H. Carbohydrate-deficient transferrin in serum : a new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed. Clin Chem 1991 ; 37 : 2029-37.

2 Arndt T. Carbohydrate-deficient transferrin as a marker of chronic alcohol abuse : a critical review of preanalysis, analysis, and interpretation. Clin Chem 2001 ; 47 : 13-7.

3 Bortolotti F, De Paoli G, Pascali JP, Tagliaro F. Fully automated analysis of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) by using a multicapillary electrophoresis system. Clin Chim Acta 2007 ; 380 : 4-7.

4 Helander A, Husa A, Jeppsson JO. Improved HPLC method for carbohydrate-deficient transferrin in serum. Clin Chem 2003 ; 49 : 1881-90.

5 Lanz C, Falmagne JB, de l’Escaille F, Marti U, Thormann W. Determination of carbohydrate-deficient transferrin in human serum with capillary zone electrophoresis. Sample preparation strategies for the removal of interferences caused by increased levels of immunoglobulins. J Chromatogr A 2008 ; 1206 : 33-40.

6 Arndt T, van der Meijden BB, Wielders JP. Atypical serum transferrin isoform distribution in liver cirrhosis studied by HPLC, capillary electrophoresis and transferrin genotyping. Clin Chim Acta 2008 ; 394 : 42-6.


 

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