Serologic diagnosis of chlamydial and Mycoplasma pneumoniae infections

ARTICLE

Auteur(s) : B de Barbeyrac, F Obeniche, E Ratsima, S Labrouche, C Moraté, H Renaudin, S Pereyre, CM Bébéar, C Bébéar

Laboratoire de bactériologie, Centre national de référence des infections à Chlamydia, Centre hospitalier universitaire, Bordeaux

Article reçu le 12 Avril 2006, accepté le 19 Juin 2006

Les infections à Chlamydiae

Elles évoluent selon un mode aigu, chronique et séquellaire ce qui soulève la question de la persistance de la bactérie. Pour Chlamydia trachomatis, le trachome est la principale cause de cécité dans le monde et l’infection génitale est la principale cause de grossesse ectopique ou d’infertilité tubaire. Pour Chlamydia pneumoniae, l’infection chronique pourrait jouer un rôle dans la maladie athéromateuse ou le déclenchement de la crise d’asthme.

Elles sont souvent asymptomatiques ou peu symptomatiques, exposant le patient aux complications par retard de diagnostic.

La réponse immune n’est pas protectrice. Une même personne peut s’infecter plusieurs fois. La réponse immune à ces infections multiples serait délétère et responsable des dommages tissulaires observées dans la maladie séquellaire.

Ces caractéristiques sont liées au mode de multiplication intracellulaire de ces bactéries et à leur évolution sous trois formes, le corps élémentaire (CE), forme extracellulaire de dissémination de l’infection, le corps réticulé (CR), forme intracellulaire de multiplication et le corps aberrant (CA), forme de persistance responsable de l’infection chronique. Ces trois formes sont antigéniquement distinctes. Le CE est limité par une membrane cytoplasmique et une paroi proche de celle des bactéries à Gram négatif, constituée d’une membrane interne et d’une membrane externe. Cette dernière contient le lipo-poly-saccharide (LPS), porteur d’épitopes spécifiques du genre et responsables des réactions sérologiques croisées non seulement entre espèces du genre mais avec des espèces d’autres genres, et des protéines. Parmi les protéines de structure, la protéine majeure appelée MOMP (major outer membrane protein) ou OMP1 porte les déterminants antigéniques spécifiques d’espèces et de sérovars. Elle est immunodominante chez Chlamydia trachomatis alors qu’elle ne l’est pas chez Chlamydia pneumoniae. Cette protéine est sous forme multimérique dans le CE et sous forme monomérique dans le CR. Des peptides immunodominants ont été identifiés chez C. trachomatis et servent d’antigènes dans les tests sérologiques.

Le CE possède d’autres protéines de structure appelées OMP2 et OMP3, riches en ponts disulfures permettant de maintenir le chromosome sous forme compactée. Ces protéines sont absentes du CR dans lequel le chromosome est sous forme relâchée. Le séquençage du génome a permis de découvrir d’autres protéines de structure appelées, POMP (polymorphic outer membrane protein). Ces protéines sont particulièrement abondantes chez Chlamydia pneumoniae. Elles recouvriraient la MOMP la rendant non immunogène chez Chlamydia pneumoniae et seraient responsables de la variabilité antigénique. Aucune protéine spécifique de Chlamydia pneumoniae n’a encore été identifiée. Ceci explique les difficultés d’interprétation des tests sérologiques qui utilisent encore la bactérie entière comme antigène.

Dans certaines conditions de culture (modifications nutritionnelles, addition d’antibiotiques, présence de cytokines comme l’interféron γ, d’hormones), des altérations dans le cycle de développement peuvent être à l’origine de l’apparition de formes morphologiquement anormales, viables mais non cultivables appelées corps abérrants (CA). Ces CA sont la conséquence d’un retard de maturation des CR et/ou d’une inhibition de la différenciation des CR en CE. Le CA se caractérise par sa grande taille et sa structure antigénique particulière, riche en protéines de stress Chsp60 et dépourvue de MOMP. La présence d’anticorps anti Chsp60 serait un marqueur du passage à la chronicité.

Dans certaines conditions, les CA sont capables in vitro de reprendre leur cycle de maturation et de donner des CE. Ils joueraient un rôle important dans les mécanismes immunopathologiques de l’infection [1].

Diagnostic des infections à Chlamydia trachomatis

Recherche directe

La méthode de référence reste l’isolement par culture cellulaire permettant un diagnostic de certitude en 48-72 heures avec une spécificité proche de 100 %. La sensibilité dépend de nombreux paramètres, qualité du prélèvement, du transport, de la culture cellulaire mais également de l’état de la bactérie, cultivable ou non, suivant le stade de la maladie.

Les tests antigéniques (immunofluorescence directe, techniques immunoenzymatiques) constituent une alternative à la culture cellulaire, mais là encore la sensibilité est variable et dépend de la quantité de bactéries et de la forme de la bactérie.

Les tests moléculaires avec ou sans amplification permettent de détecter la bactérie quel que soit son état. La sensibilité des techniques avec amplification autorise leur utilisation sur des prélèvements paucimicrobiens comme les urines ou autres autoprélèvements.

Le diagnostic d’une infection basse se fait donc uniquement par la recherche directe de la bactérie.

Le sérodiagnostic

Il a été proposé d’utiliser les IgA sériques comme marqueur d’infection évolutive sachant que ces Ac sont de courte durée de vie. La réalité semble plus complexe et l’interprétation des IgA reste spéculative. Récemment il a été proposé de rechercher les Ac antiChsp60 spécifiques de Chlamydia trachomatis comme marqueur d’une infection persistante. En effet, la présence de ces Ac est corrélée avec les complications telles qu’une infection pelvienne, une obstruction tubaire, une grossesse ectopique et serait donc le marqueur d’une infection compliquée justifiant un traitement long et non un traitement minute.

Comparaison de trousses Elisa pour le sérodiagnostic de l’infection à Chlamydia trachomatis

Une trousse de détection des Ac antiChsp 60 vient d’être disponible. Des études sont nécessaires pour évaluer la place de ces Ac dans le diagnostic, la décision thérapeutique, voire le suivi du traitement.

Première étude

Dans le cadre de l’infection génitale, les sérums avaient trois origines différentes : 69 sérums « tout venant » venaient des services de maternité et de gynécologie, 40 sérums correspondaient à des suspicions de salpingites (cliniquement et bactériologiquement documentées), 67 sérums provenaient de couples en traitement d’hypofertilité en vue d’une FIV (fécondation in vitro).

Les 120 sérums d’infections respiratoires ont été choisis pour étudier les réactions croisées : 80 sérums « tout venant », 40 sérums documentés, 3 Legionella, 10 Coxiella, et 27 Mycoplasma pneumoniae).

Sur les 176 sérums testés pour la recherche d’IgG ou d’IgA anti Chlamydia trachomatis par les 3 trousses, les résultats sont concordants dans 158 cas (89,7%) pour les IgG et dans 144 cas (81,8%) pour les IgA. Le tableau 1( Tableau 1 ) rassemble les résultats interprétés en faux positifs et faux négatifs selon les critères cliniques et en fonction de la concordance des résultats entre les trousses. Les trousses Savyon et Labsystems donnent des résultats comparables en IgG et IgA et diffèrent de la trousse Medac. Cependant les trousses Savyon et Labsystems détectent des IgA de manière non spécifique. Ceci est peut-être lié au seuil de positivité qui est difficile à déterminer si l’on en juge par la distribution des ratio selon le classement des sérums en vrai et faux positif ( (figure 1) ). Dans la zone des ratios comprise entre 1,5 et 3, on observe une répartition quasi identique des vrai et faux positifs quelle que soit la technique. Mais c’est dans la zone des ratios comprise entre 1,1 et 1,5 que l’on trouve le plus grand nombre de sérums classés faux positifs avec la technique Savyon, zone classée « douteuse » dans la trousse Labsystem.

L’analyse des sérums provenant d’infections respiratoires montre que les réactions croisées avec Chlamydia pneumoniae sont rares. Par contre, des réactions croisées sont observées sur des sérums de patients ayant une infection respiratoire documentée, notamment à Mycoplasma pneumoniae et plus particulièrement sur les IgA (tableau 2)( Tableau 2 ).
Tableau 1 Comparaison de trois trousses pour le sérodiagnostic de Chlamydia trachomatis.

Deuxième étude

En conclusion, le nombre de résultats discordants diffère suivant les trousses comparées et est plus élevé sur les IgA que sur les IgG. D’après notre expérience, les trousses testées peuvent être classées dans l’ordre de concordance suivant : Labsystems et Savyon, puis Medac, puis Vircell. La trousse Labsytems semble détecter plus d’IgA anti Chlamydia trachomatis que toutes les autres méthodes. Cependant les seuils de positivité des IgA proposées par les trousses n’apparaissent pas très discriminants.

Signification des profils sérologiques IgG/IgA anti Chlamydia trachomatis

• – IgG+/IgA+ : infection en cours ;
• – IgG+/IgA- : cicatrice sérologique ou guérison ;
• – IgG-/IgA- : pas d’infection ou infection basse.

Le profil IgG-/IgA+ est rare et correspond à des réactions non spécifiques [2]. C’est pourquoi en l’absence d’IgG, il n’est pas utile de chercher des IgA. Nous avons étudié le profil sérologique chez des personnes dont l’infection à Chlamydia trachomatis était documentée par une recherche directe.

Dans une cohorte de femmes consultant au dispensaire de l’Institut Pasteur de la Guadeloupe, il a été effectué en parallèle une recherche de Chlamydia trachomatis dans le col par une technique d’amplification génique (TMA, Gen-Probe) et un sérodiagnostic. La prévalence de l’infection (TMA+) était de 21,7 % et la séroprévalence de 53,7 %. Il s’agissait d’une population à haut risque. Parmi les femmes infectées (TMA+), 16 (23 %) avaient un profil sérologique d’infection cicatriciel (IgG+/IgA-) et parmi les femmes non infectées (TMA-), 60 (24 %) avaient un profil sérologique d’infection en cours (IgG+/IgA+). Dans un quart des cas, le diagnostic d’infection sur le profil sérologique était erroné.

De même, l’analyse des profils sérologiques de 61 patients infectés (PCR+) testés dans notre laboratoire, montre que 13 (20 %) avaient un profil sérologique en faveur d’une infection en cours (IgG+/IgA+), 24 (40 %) en faveur d’une cicatrice (IgG+/IgA-) et 24 (40 %) n’avaient pas d’Ac. L’absence d’IgA n’est donc pas un marqueur de guérison.

Un cas particulier est celui de la LGV dans laquelle les IgG et les IgA sont particulièrement élevées. Si bien qu’un taux très élevé de ces Ac doit être considéré comme présomptif de la maladie et doit faire rechercher la bactérie au niveau rectal s’il s’agit d’un homosexuel, particulièrement à l’heure où sévit en France une épidémie de LGV dans cette population. Seul le typage permet de poser le diagnostic de LGV avec certitude car il existe des rectites à Chlamydia trachomatis de sérovars autres que L, accompagnées de forts taux d’Ac.

Les anticorps antiChsp60

Au cours d’une étude de suivi de 280 prostituées pendant 33 mois, on a observé que la moitié des femmes qui présentaient des Ac antiChsp60 a développé une infection pelvienne contre seulement un quart parmi celles qui n’avaient pas d’Ac antiChsp60 [5].

Au laboratoire, nous avons regardé la distribution des Ac antiChsp60 dans des sérums de patientes dont l’infection à Chlamydia trachomatis était documentée (tableau 3)( Tableau 3 ). Des Ac anti Chsp60 étaient présents en association avec les Ac anti MOMP dans le sérum de 13 patientes sur 14 atteintes de stérilité tubaire, soit dans 93 % des cas. Dans le sérum de 40 patientes infectées (PCR+), des Ac anti Chsp60 ont été détectées dans 13 cas (soit 33 %), associés ou non à des Ac anti MOMP de type IgG ou IgA (tableau 3). Chez les patientes dont la recherche directe était négative, des Ac antiChsp60 étaient détectés dans 9 cas sur 61 (14 %) associés ou non à des Ac antiMOMP de type IgG ou IgA.

Ces résultats montrent que les Ac antiChsp60 :

• – sont présents dans la stérilité tubaire ;
• – sont présents chez les femmes infectées (PCR+) (33 %) plus souvent que chez les femmes non infectées (PCR-) (14 %) ;
• – n’ont pas la même cinétique que les IgA antiMOMP.

Des études supplémentaires sont nécessaires pour évaluer leur intérêt diagnostique associé aux Ac antiMOMP. Leur présence pourrait-elle être une indication de cœlioscopie ? de traitement de longue durée ?

En conclusion, le sérodiagnostic dirigé contre la MOMP de Chlamydia trachomatis a un intérêt limité à certaines circonstances cliniques [6]. Il doit être réservé :

• – au diagnostic des infections hautes ;
• – à l’évaluation de la dissémination d’une infection basse certifiée par la positivité d’un échantillon de la sphère génitale basse ;
• – au diagnostic étiologique d’une ulcération génitale évoquant une LGV ;
• – au bilan d’hypofertilité du couple dans lequel l’absence d’Ac exclut l’hypothèse tubaire comme cause de l’infertilité [7] ;
• – au diagnostic d’une arthrite réactionnelle ou d’un syndrome de Reiter.

Diagnostic des infections à Chlamydia pneumoniae

Le sérodiagnostic

En primo-infection, les IgM atteignent un pic à 30 jours après le début de la maladie puis se négativent en 2 ou 3 mois. Les IgG montent lentement au cours du premier mois, atteignent un pic à 60 jours, restent en plateau et persistent longtemps [9]. En réinfection, les IgM n’apparaissent pas, les IgG augmentent après 2 semaines.

Ainsi, le diagnostic d’infection à Chlamydia pneumoniae est toujours rétrospectif et nécessite un suivi de la cinétique des Ac sur 2 sérums, l’un précoce, l’autre tardif 2 mois plus tard et non 15 jours comme il est recommandé le plus souvent.

Toutes les techniques utilisent la bactérie entière plus ou moins délipidée. Deux types de méthodes sont utilisées : la micro-immuno-fluorescence (MIF) et l’Elisa. Il existe une bonne concordance entre Elisa et MIF [10] :

• – la MIF utilise des CE formolés des 3 espèces (Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae et Chlamydia psittaci). Cette technique présente plusieurs inconvénients tels qu’un manque de standardisation dans la préparation des Ag, une lecture subjective et la difficulté de préciser l’espèce en cause en raison de communautés antigéniques entre les 3 espèces. D’autre part, des variations significatives interlaboratoires ont été observées dans une étude multicentrique où le pourcentage de concordance entre les titres d’IgG s’étendait de 54 % à 92 % et pour les IgM de 50 % à 95 % [11, 12] ;
• – les tests Elisa permettent la distinction des isotypes IgG, IgM et IgA. Il est difficile de déterminer le seuil de positivité. Les trousses commercialisées donnent des valeurs seuils souvent trop faibles compte tenu de la séroprévalence élevée dans la population.

Les critères d’infection à Chlamydia pneumoniae

Une recherche directe positive ne signe pas obligatoirement une infection aiguë, car il peut s’agir d’un portage ou de la persistance de la bactérie après une infection.

Le diagnostic d’infection aiguë nécessite 2 sérums et sera posé sur une séroconversion ou une augmentation de titre d’au moins deux dilutions. En MIF, le seuil d’IgG ≥ 1/512 sur un seul sérum a été proposé mais 20 % de sujets sains peuvent avoir des titres aussi élevés. Par ailleurs, la séroprévalence IgG est élevée dans la population générale : les Ac apparaissent dès l’âge de 5 ans, augmentent durant l’adolescence, puis la prévalence continue de croître pendant le reste de la vie jusqu’à atteindre 80 % chez la personne âgée. Enfin, les Ac persistent parfois à un titre élevé longtemps après traitement (pendant plusieurs mois, voire plusieurs années) et la sérologie ne permet pas de suivre l’évolution de la maladie.

La raison de la persistance des Ac après traitement n’est pas claire. Plusieurs hypothèses ont été émises [14] :

• – l’échec thérapeutique à la suite d’un traitement antibiotique insuffisant ou inapproprié. L’infection passe à la latence (sans symptôme clinique) ou la chronicité (avec un risque accru de complications) ;
• – la persistance d’antigènes dans les cellules dendritiques maintenant la stimulation des cellules B productrices d’Ac ;
• – le développement d’une maladie auto-immune ne nécessitant pas la persistance d’Ag microbiens.

Les différentes études de corrélation entre résultats de PCR et de sérologie notent l’absence de concordance et posent la question de la définition microbiologique de l’infection. Seule la présence simultanée de la bactérie mise en évidence par PCR et d’Ac à un titre significatif permet de poser le diagnostic d’infection aiguë avec une forte probabilité.

Les infections à Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae tient la première place parmi les infections respiratoires aiguës et notamment les pneumopathies atypiques résistantes aux β-lactamines de l’enfant et de l’adulte jeune. Dans la majorité des cas, les infections à Mycoplasma pneumoniae se traduisent par de simples trachéobronchites pour lesquelles le diagnostic étiologique n’est souvent pas porté. Dans sa forme la plus caractéristique, l’infection est caractérisée par un tableau de pneumopathie atypique primitive, d’installation souvent progressive avec toux sèche, signes ORL, syndrome fébrile. La symptomatologie respiratoire ne permet pas de différencier une infection à Mycoplasma pneumoniae d’une infection à d’autres micro-organismes responsables de pneumopathies atypiques. L’association à des signes extra-respiratoires, cutanées, articulaires, neurologiques, péricardiques est plus évocatrice [16].

Mycoplasma pneumoniae colonise de manière diffuse l’épithélium respiratoire grâce à des protéines de type adhésine dont une majeure appelée P1.

Diagnostic direct de l’infection à Mycoplasma pneumoniae

L’examen direct n’est pas adapté car les mycoplasmes sont très polymorphes. Dépourvus de paroi, les mycoplasmes ne sont pas colorables au Gram. La méthode la plus intéressante est l’amplification génique par PCR. Différents systèmes ont été mis au point et les amorces choisies dans le gène de l’adhésine P1 donnent des résultats sensibles et spécifiques. Cette technique est rapide et sensible et très utile au diagnostic précoce de l’infection.

La culture, lente et difficile, nécessite des milieux complexes, rendus sélectifs par addition de β-lactamines ou de polymyxine. Ces milieux spécifiques ne sont pas commercialisés. On peut utiliser le milieu de Hayflick modifié renfermant 20 % de sérum de poulain ou le milieu SP-4 renfermant du sérum de veau fœtal ; les milieux liquides contiennent du glucose et du rouge de phénol. La détection en milieu liquide se fait en 10 à 21 jours d’après le virage d’indicateurs colorés, traduisant une acidification du milieu glucosé.

Sur milieu gélosé spécifique, Mycoplasma pneumoniae donne des colonies microscopiques. N’appartenant pas à la flore commensale, son identification dans un prélèvement respiratoire est un élément significatif.

Sérodiagnostic de l’infection à Mycoplasma pneumoniae

Comparaison de trousses Elisa pour le sérodiagnostic de l’infection à Mycoplasma pneumoniae

• – cas certain (PCR+) ou probable (PCR- ou non faite) les sérums ayant un titre élevé d’ IgG (FC’ ≥ 1/64 ou +++ en Elisa) et IgM positives ;
• – cas possible, des sérums ayant un taux élevé d’IgG sans IgM ;
• – cicatrice sérologique, des sérums ayant un taux bas d’IgG sans IgM.

L’ensemble des résultats est montré dans les tableaux 4 et 5( Tableau 4 )( Tableau 5 ).

Dans les cas certains ou probables, chez l’adulte, des titres ≥ 1/64 en FC’ sont observés dans 8/9 cas alors que des titres en IgG+++ ou ++ ne sont observés que dans 4 cas avec Medac, 5 cas avec Vircell et 7 cas avec Immunowell. Chez l’enfant, des titres ≥ 1/64 en FC’ sont observés dans 18/24 cas, alors que des titres IgG+++ ou ++ sont observés dans 15 cas avec Medac, 9 cas avec Vircell et 19 cas avec Immunowell. Chez l’adulte, les IgM sont détectées dans tous les cas par Medac et Immunowell, 8/9 cas par BioRad et seulement 5/9 cas par Vircell. Chez l’enfant, les IgM sont détectés dans 22/24 cas par Medac, 15 cas par Vircell et 20 cas par Immunowell et BioRad. La présence d’IgM dans ces sérums précoces explique le nombre élevé de sérums ayant un titre ≥ 1/64 en FC’ et négatifs ou faiblement positif en Elisa IgG.

Nous notons de possibles faux positifs en IgM par les méthodes Vircell (2 cas parmi les sérums adultes classés en cicatrice), BioRad (3 cas parmi les sérums adultes classés indeterminés), Medac (2 cas parmi les serum enfants classés indeterminés) et Immunowell (1 cas parmi les sérums enfants classés indeterminés).

En conclusion, pour la détection des IgM, les trousses peuvent être classées, dans notre étude, de la manière suivante, Medac > Immunowell> BioRad > Vircell. Les plus sensibles permettent un diagnostic précoce. Mais le plus souvent, ces IgM ne seront pas accompagnées d’IgG ce qui ne facilite pas l’interprétation sur un seul sérum.

Dans l’objectif de fixer un seuil signicatif d’IgG par les méthodes Elisa, nous avons comparé les titres en FC’ et les titres en Elisa pour chacune des trois techniques. Les résultats sont schématisés dans la ( figure 2 ). Quel que soit la technique, les sérums dont le titre est ≥ 1/64 se répartissent dans toutes les catégories de réponse Elisa, de - à +++. Cependant, avec les trousses Immunowell et Medac, les résultats +++ ne regroupent que des sérums titrés ≥ 1/32, ce qui n’est pas le cas avec la trousse Vircell.

Dans une étude récente [18], les auteurs ont comparé 12 trousses commercialisées et la réaction de FC’ pour le sérodiagnostic de l’infection à Mycoplasma pneumoniae. Ils concluent que toutes les trousses ne sont pas équivalentes et que la trousse Labsystems présente les meilleures performances en termes de sensibilité et spécificité.
Tableau 4 Nombre de sérums par résultats obtenus avec les différentes techniques en fonction de l’interprétation des cas d’infection à Mycoplasma pneumoniae.

Tableau 5 Classification en croix des IgG.

Interprétation du sérodiagnostic

Il est recommandé de rechercher les IgM et les IgG sur le premier sérum d’une personne suspecte d’infection et de détecter les IgG sur le deuxième sérum collecté 2 semaines plus tard. L’infection aiguë est confirmée par la présence d’IgM, ou en absence d’IgM par une augmentation significative du titre des IgG x 4 ou en l’absence d’un 2^e sérum par un taux élevé d’Ac évalué au 1/64 en FC’. En général, on n’observe pas de persistance prolongée des Ac à un seuil significatif, et les taux résiduels sont faibles, voire non détectables, du moins en FC’.

Au CHU de Bordeaux, nous avons analysé les dossiers de 42 cas d’infections à Mycoplasma pneumoniae dont 32 avaient moins de 18 ans (75 %). Les symptômes cliniques étaient surtout représentés par de la fièvre et de la toux (respectivement 92 et 84 %). Les signes radiologiques évoquaient une pneumonie lobaire dans 46 % des cas. Les signes extra-respiratoires étaient présents dans 71 % des cas.

La recherche directe a été faite sur 27 prélèvements, 12 étaient positifs par culture (sensibilité 44 %) et 19 par PCR (sensibilité 70 %). Sur les 33 sérums testés, 29 étaient positifs en IgM (sensibilité 88 %).

En conclusion, pour Mycoplasma pneumoniae, les critères de diagnostic sont bien définis :

• – une recherche directe positive permet de poser le diagnostic d’infection, le portage sain étant exceptionnel ;
• – le sérodiagnostic permet le diagnostic précoce chez l’enfant sur la présence d’IgM. Chez l’adulte, un titre élevé d’IgG (FC’ ≥ 1/64) sur un seul sérum est présomptif. Mais chez l’adulte, en raison de la faible sensibilité des IgM et la difficulté d’obtenir un 2^e sérum, la recherche directe par PCR reste le moyen le plus sûr de faire le diagnostic.

Conclusion

Pour Chlamydia trachomatis, on dispose de méthodes d’amplification sensibles et spécifiques qui doivent être privilégiées pour le dépistage et le diagnostic d’une infection basse. Le sérodiagnostic est une aide au diagnostic d’infection haute ou disséminée.

Le diagnostic d’une pneumopathie atypique passe toujours par la sérologie. Ce sérodiagnostic est d’interprétation difficile pour Chlamydia pneumoniae en raison de la non spécificité des trousses disponibles et de la séroprévalence élevée. Il est par contre très informatif pour Mycoplasma pneumoniae et permet le diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant.

Remerciements

Références

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