ARTICLE
Auteur(s) :, B
Onraed, B Hennache
Laboratoire de biochimie, Hôpital cardiologique, Lille
Article reçu le 10 Mai 2004, accepté le 22 Février 2005
De nombreuses équipes ont travaillé ces dernières années sur
l’intérêt de la CRP ultrasensible (CRPus) dans les maladies
cardiovasculaires, l’inflammation étant un mécanisme clé du
processus pathologique de l’athérosclérose. La relation entre le
taux de CRP ultrasensible chez le patient et le risque
cardiovasculaire potentiel a été démontrée dans plusieurs études
aux États-Unis et en Europe [1-3]. Plusieurs publications récentes
sont venues tempérer l’engouement pour l’utilisation de la CRP dans
le domaine prédictif [4-7]. Quoiqu’il en soit, son usage quotidien
nous dira si la CRPus mérite les espoirs qu’elle suscite. En
pratique, l’utilisation de ce marqueur prédictif de risque
nécessite de disposer au laboratoire d’une technique de dosage
particulièrement performante, tant au niveau de la précision que de
la sensibilité des dosages.Ce travail présente une comparaison de
la méthode de dosage de la CRP ultrasensible Orion Diagnostic
commercialisée par Fumouze et adaptée à l’Hitachi 911 par rapport à
la méthode Dade Behring sur BN II.
Matériel et méthodes
Échantillons
Les échantillons proviennent de bilans biologiques prescrits par
les services cliniques et n’ont pas fait l’objet de prélèvements de
tubes supplémentaires. Cent trente-quatre échantillons sériques ont
été recueillis, centrifugés 10 minutes à 3 500 tours/min et
conservés à + 4 °C ou à – 20 °C avant d’être analysés
selon les deux méthodes, Dade Behring (BNII) et Fumouze (Hitachi
911). Le contrôle Ultrasensitive CRP control Fumouze (réf. 2700) a
été utilisé dans chaque série de dosages. La valeur cible est de 3
mg/L.
Réactif Fumouze Orion sur automate Hitachi 911
Le coffret Ultrasensitive CRP Orion Diagnostica (réf. 2403),
commercialisé par le laboratoire Fumouze Division Diagnostics
(110-114, rue Victor Hugo - 92300 - Levallois Perret), permet le
dosage dans le sérum ou le plasma (anticoagulant : héparine ou
EDTA) de faibles concentrations de protéine C-réactive (CRP) par
méthode immuno- turbidimétrique utilisant un latex sensibilisé. Le
coffret contient le réactif CRP Ultra 1 x 4 mL lyophilisé, le
tampon, le calibrant. Sa conservation est de 1 an à + 2° – + 8 °C.
Une fois reconstitué, le réactif est stable 8 semaines. Le
calibrant est standardisé d’après l’IFCC CRM 470 [8]. La gamme de
calibration est réalisée en 6 points. Une calibration bimensuelle
est recommandée. Le domaine de mesure indiqué dans le livret
d’instructions du fabricant Orion Diagnostica s’étend de 0,25 à 10
mg/L. Une adaptation est disponible sur l’automate Hitachi 911
Roche Diagnostics.
La fiche technique signale que « toutes circonstances
risquant de modifier la turbidité d’un échantillon de sang ou de
plasma peuvent entraîner des résultats erronés » et que
« aucune interférence n’a été constatée pour des
concentrations d’hémoglobine, de triglycérides et de bilirubine
respectivement inférieures à 5 g/L, 10 mmol/L et 400
micromol/L ».
Réactif Behring sur automate BN II
Le coffret CardioPhase hs CRP (code OQIY) permet le dosage dans le
sérum ou le plasma (anticoagulant : héparine ou EDTA) de la
CRP par immunonéphélémétrie sensibilisée avec des particules, à
l’aide des systèmes Behring Néphélémètres, en particulier le BN II.
(Dade Behring S.A. 19-29, rue du capitaine Guynemer 92081 – Paris
La Défense). Le réactif est prêt à l’emploi. Une fois le flacon
ouvert, le réactif est stable 4 semaines à + 2° – + 8 °C. Un
réactif supplémentaire, le N Réactif complémentaire/précipitation
Dade Behring (code OUMU), est nécessaire pour le dosage de la CRP.
Il s’agit d’une solution de tampon phosphate additionnée de
chlorure de sodium et de Thesit®, stable 4 semaines
à une température de + 2° – + 8 °C. Le calibrant est standardisé
par rapport au matériau de référence IFCC CRM 470 [8]. Le coffret
peut être utilisé à la fois pour les dosages de CRP dans le cadre
de l’inflammation et les dosages de CRP ultrasensible (CRPus) comme
marqueur prédictif de pathologies cardiovasculaires. Ceci est un
avantage en terme d’organisation. Selon le cas, les dilutions de
départ sur BNII sont différentes : 1/400 pour le dosage de
CRP, marqueur d’inflammation et 1/20 pour le dosage de la CRPus,
marqueur prédictif de pathologies cardiovasculaires. La courbe
d’étalonnage est valable 4 semaines. Le domaine de mesure de
la CRPus s’étend de 0,175 à 10 mg/L. Pour des valeurs supérieures
au seuil maximum, il est nécessaire d’effectuer une nouvelle
dilution pour obtenir une quantification.
La fiche technique signale que « les échantillons troubles
ou lipémiques qui ne peuvent pas être clarifiés par centrifugation
doivent être éliminés du test et que « aucune influence due à
la présence de bilirubine, hémoglobine et triglycérides n’a été
constatée jusqu’aux concentrations respectives de 600 mg/L, 10 g/L
et 16 g/L ».
Analyses des résultats
Le logiciel de statistiques « Method validator », écrit
par Marquis [9], a été utilisé pour la comparaison des résultats
obtenus par les deux méthodes.
Résultats
Étude comparative
La droite de régression et le diagramme des différences
correspondant aux 134 couples de valeurs sont présentés sur la (
figure 1 ). La
droite de régression a pour équation : y = 0,850 x + 0,1516.
Le coefficient de corrélation r est de 0,982. Un infléchissement de
la droite est observé sur le diagramme des différences à partir
d’un seuil de CPRus BNII de 6 mg/L (( figure 1B )). En
restreignant la population étudiée aux valeurs inférieures à ce
seuil, la droite de régression a pour équation: y = 0,975 x – 0,083
et le coefficient de corrélation r est de 0,978 (( figure 2 )).
Différents seuils d’interprétation, variant entre 3 et 5,4 mg/L,
ont été proposés selon les équipes de travail [2, 10-12]. En
retenant la valeur seuil de 3 mg/L proposée dans la fiche technique
CRP Dade Behring, les deux méthodes concordent pour 96 % des
couples de valeurs.
Quatre échantillons dont les valeurs BNII se situent entre 10 et
15 mg/L ont été également étudiés. Les couples de valeurs BNII CRP
/ CRPus Fumouze sont respectivement : 11,10 et 8,30 mg/L, 12,1
et 8,23 mg/L, 13,2 et 9,14 mg/L, 14,5 et 9,57 mg/L soit une
déviation par rapport à la cible qui varie de 25 à 32%. Pour ces
échantillons, les valeurs fournies par la méthode Fumouze restent
incluses dans le domaine de mesure de la CRPus défini par le
fabricant (inférieures à 10 mg/L). Par contre, les valeurs obtenues
sur BNII pour ces échantillons dépassent la limite supérieure de
mesure de la CRPus et ont nécessité un dosage classique. Dans les
valeurs les plus hautes de la courbe de calibration, il existe donc
un écart important entre les deux méthodes.
Un échantillon dont la concentration en CRP s’élevait à 517 mg/L
sur BNII a également été testé par la méthode Fumouze sur Hitachi
911 et a fourni le résultat de « 13,02 mg/L limite
Haute » ce qui exclut la validité du dosage.
Linéarité et précision
La linéarité des deux méthodes a été étudiée selon les
recommandations de la SFBC [13] sur 6 dilutions préparées à partir
d’un pool bas et d’un pool haut dans les proportions
suivantes : pool haut dilué à 75 %, 50 %, 30 %,
20 %, 10 % et 5 % dans le pool bas. Les dilutions
ont été dosées chacune trois fois durant trois jours consécutifs
sur Hitachi 911 et BNII. Les résultats (moyennes, CV et déviations
par rapport aux valeurs cibles) sont présentés dans le tableau 1(
Tableau 1 ). Les courbes de régression
établies à partir des valeurs obtenues pour chaque dilution en
fonction des valeurs cibles sont présentées sur la ( figure 3 ). Elles ont pour
équation y = 1,19 x – 0,257, r = 0,998 pour la linéarité de la
méthode Fumouze et y = 0,998 x – 0,306, r = 0,991 pour celle de la
méthode BNII.
Tableau 1 Linéarité et précision.
|
Dade-Behring
|
Fumouze Orion
|
|
Pool
|
Moyenne
|
CV
|
Cible
|
Déviation
|
Pool
|
Moyenne
|
(CV)
|
Cible
|
Déviation
|
|
(mg/L)
|
(%)
|
(mg/L)
|
(%)
|
(mg/L)
|
(%)
|
(mg/L)
|
(%)
|
|
1
|
|
|
13,0
|
|
1
|
|
|
9,38
|
|
|
2
|
9,34
|
2,7
|
9,82
|
- 4,9
|
2
|
8,15
|
1,27
|
7,18
|
13,5
|
|
3
|
5,90
|
5,6
|
6,64
|
- 11,1
|
3
|
5,92
|
1,18
|
4,94
|
19,8
|
|
4
|
3,37
|
5,3
|
4,10
|
- 17,8
|
4
|
3,32
|
0,99
|
3,17
|
4,7
|
|
5
|
2,80
|
3,9
|
2,83
|
- 1,0
|
5
|
2,55
|
2,90
|
2,28
|
11,8
|
|
6
|
1,44
|
4,7
|
1,56
|
- 7,6
|
6
|
1,33
|
4,33
|
1,40
|
- 5,0
|
|
7
|
0,90
|
3,5
|
0,91
|
- 1,0
|
7
|
0,89
|
7,84
|
0,95
|
- 6,3
|
|
8
|
|
|
0,29
|
|
8
|
|
|
0,51
|
|
Répétabilité et reproductibilité
Pour l’étude de répétabilité, deux couples d’échantillons sériques
présentant chacun un taux bas et un taux élevé de CRPus ont été
dosés à dix reprises dans une même série, l’un par la méthode
Fumouze et l’autre par la méthode Dade Behring.
Pour l’étude de reproductibilité, deux autres couples
d’échantillons présentant chacun un taux bas et un taux élevé de
CRPus ont été dosés 10 jours consécutifs, l’un par la méthode
Fumouze, l’autre par la méthode Dade Behring. L’ensemble des
résultats de la méthode Fumouze sont présentés dans le tableau 2(
Tableau 2 ), et ceux de la méthode Dade
Behring dans le tableau 3( Tableau 3
).
Tableau 2 Répétabilité et reproductibilité de la
méthode CRPus Fumouze Orion.
|
Répétabilité (n = 10)
|
Reproductibilité (n = 10)
|
|
Taux bas
|
Taux haut
|
Taux bas
|
Taux haut
|
|
Moyenne (mg/L)
|
0,786
|
7,09
|
1,118
|
8,377
|
|
Écart-type
|
0,064
|
0,117
|
0,104
|
0,137
|
|
CV (%)
|
8,14
|
1,65
|
9,30
|
1,63
|
Tableau 3 Répétabilité et reproductibilité de la
méthode CRPus Dade Behring.
|
Répétabilité (n = 10)
|
Reproductibilité (n = 10)
|
|
Taux bas
|
Taux haut
|
Taux bas
|
Taux haut
|
|
Moyenne (mg/L)
|
0,754
|
7,144
|
1,401
|
6,700
|
|
Écart-type
|
0,020
|
0,139
|
0,102
|
0,253
|
|
CV (%)
|
2,65
|
1,94
|
7,28
|
3,77
|
Discussion
L’étude comparative montre une excellente corrélation pour les
valeurs inférieures à 6 mg/L. Au-delà de ce seuil, la corrélation
est moins bonne comme le montrent le net infléchissement de la
courbe de régression et des écarts de plus en plus importants par
rapport aux valeurs BNII. Au-delà de 6 mg/L, les valeurs de la
méthode Fumouze apparaissent sous-estimées par rapport à celles du
BNII. La limite supérieure du domaine de mesure fixée à 10 mg/L
devrait être ramenée à 6 mg/L de façon à conserver une bonne
corrélation par rapport à la méthode BNII. Par ailleurs, il faut
insister sur la vigilance indispensable dans les cas de CRP
supérieures à la limite haute du domaine de mesure et pour
lesquelles l’Hitachi 911 fournit néanmoins un chiffre. Bien que
signalé « limite haute », le résultat peut être très
largement sous-estimé et des erreurs sont possibles si un contrôle
strict des valeurs fournies par l’appareillage n’est pas mis en
place. Nos résultats diffèrent relativement de ceux de Hamwi et al.
[14] qui obtenaient pour la méthode Orion utilisée sur 101 sérums
dosés sur Modular-P une droite de régression de pente 0,72. Ils
constataient un écart par rapport à la méthode Dade-Behring détecté
dès le seuil de 2,5 mg/L, ce que nous ne constatons qu’à partir du
seuil de 6 mg/L.
Les essais de linéarité de la méthode Fumouze montrent des
déviations par rapport aux valeurs cibles variant de – 6,3 % à
19,8 % passant d’un écart positif à un écart négatif. Ceci
n’est pas retrouvé pour la méthode Dade-Behring pour laquelle les
déviations varient de –1,0 à – 17,8 % sans inversion. La
droite de régression obtenue pour la linéarité de la méthode
Dade-Behring est parallèle à la droite théorique (y = 0,998 x –
0,306) alors que celle obtenue pour Fumouze s’en écarte (y = 1,19 x
– 0,257). Cet écart, plus important vers les valeurs hautes de la
droite de régression, pourrait s’expliquer par la sous-estimation
de la concentration du pool haut par la méthode Fumouze et confirme
la nécessité d’en restreindre le domaine de mesure.
Les tests de répétabilité et de reproductibilité des deux tests
sont satisfaisants. Cependant, la répétabilité de la méthode Dade
Behring est meilleure pour l’échantillon de valeur faible en CRPus
(CV Behring : 2,65 %, CV Fumouze : 8,14 %).
Pour l’échantillon de valeur élevée, les coefficients de variation
sont équivalents et inférieurs à 2 % pour les deux
méthodes.
La reproductibilité pour l’échantillon de valeur basse en CRPus
est également meilleure pour la méthode Dade Behring (CV :
7,28 %) par rapport à la méthode Fumouze dont le coefficient
de variation (9,30 %) reste cependant inférieur à
10 %.
Quant aux valeurs élevées, la reproductibilité est cette fois
meilleure pour la méthode Fumouze (CV : 1,63 %) par
rapport à la méthode Dade Behring (CV : 3,77 %). Les CV
obtenus pour la méthode Dade-Behring sont comparables à ceux
décrits par Rothkrantz-Kos et al. [15]. Ces résultats sont
confirmés par l’étude globale de précision effectuée dans le cadre
de l’essai de linéarité. Elle montre en effet des coefficients de
variation inférieurs pour la méthode Fumouze (de 0,99 à
4,33 %) par rapport à la méthode BNII (de 2,7 à 5,6 %),
sauf pour la valeur la plus faible des pools (CV Fumouze :
7,84 %, CV BNII : 3,5 %).
Conclusion
Ces essais montrent que la méthode de dosage de la CRPus
commercialisée par Fumouze donne des résultats très acceptables
lors de son adaptation sur Hitachi 911, si l’on respecte un domaine
de mesure limité à 6 mg/L. Cette condition étant respectée, les
résultats de répétabilité, de reproductibilité ainsi que la
comparaison par rapport à une méthode néphélémétrique sont
satisfaisants. La prescription de ce marqueur est en augmentation
et cette application devrait intéresser les laboratoires souhaitant
en réaliser le dosage, sans toutefois disposer d’un automate
spécialisé dans le dosage des protéines spécifiques par
néphélémétrie.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Catherine Obeuf et Catherine
Ribot, techniciennes du laboratoire de biochimie, pour leur
participation active à cette étude, ainsi que la société Fumouze
pour la fourniture de leur réactif.
Références
1 Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and
atherosclerosis. Circulation 2002 ; 105 : 1135-45.
2 Ridker PM. Clinical application of C-reactive protein for
cardiovascular disease detection and prevention. Circulation
2003 ; 107 : 363-9.
3 Ridker PM, Cusham M, Stampfer MJ. Plasma
concentration of C-reactive protein and risk of developing
peripheral vascular disease. Circulation 1998 ; 97 :
425-8.
4 Levinson SS, Miller JJ, Elin RJ. Poor
predictive value of High-sensitivity C-reactive protein indicates
need for reassessment. Clin Chem 2004 ; 50 : 1733-4.
5 Danesh J, Wheeler JG, Gideon M, et al.
C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in
the prediction of coronary heart disease. N Engl J Med 2004 ;
350 : 1387-97.
6 Koenig W. C-reactive protein and cardiovascular
risk : has the time come for screening the general
population ? Clin Chem 2001 ; 47 : 9-10.
7 Mosca L. C-reactive protein – to screen or not to
screen ? N Engl J Med 2002 ; 347 : 1615-7.
8 Bienvenu J, Later R, Pontet F. Le matériau de
référence (CRM 470) pour les protéines sériques : préparation,
caractéristiques et conditions d’utilisation. Ann Biol Clin
1995 ; 53 : 499-505.
9 Marquis P. Comparaisons de méthodes analytiques. Ann Biol
Clin 1999 ; 57 : 737-8.
10 Wilkins J, Gallimore R, Moore EG,
Pepys MB. Rapid automated high sensitivity enzyme immunoassay
of C-reactive protein. Clin Chem 1998 ; 44 : 1358-61.
11 Roberts WL, Moulton L, Law TC, et al.
Evaluation of nine automated High-sensitivity C-reactive protein
methods : implications for clinical and epidemiological
applications. Part 2. Clin Chem 2001 ; 47 : 418-25.
12 Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW,
et al. Markers of inflammation and cardiovascular
disease : application to clinical and public health
practice : a statement for healthcare professionals from the
centers for disease control and prevention and the American Heart
Association. Circulation 2003 ; 107 : 499-511.
13 Vassault A, Azzedine MC, Bailly M, et al.
Commission SFBC « Validation de techniques ». Ann Biol
Clin 1986 ; 44 : 686-745.
14 Hamwi A, Vukovich T, Wagner O, et al.
Evaluation of turbidimetric High-sensitivity C-reactive protein
assays for cardiovascular risk estimation. Clin Chem 2001 ;
47 : 2044-6.
15 Rothkrantz-Kos, Bekers O, Gubbels A, Drent M,
Schmitz M, Van Dieijen-Visser P. Evaluation of two new
high-sensitivity methods for C-reactive protein. Ann Clin Biochem
2003 ; 40 : 398-405.
|
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