ARTICLE
Auteur(s) :, L Dortet1, T Nguyen-Khoa1,2, M
Kebede1, J Coulloc’h3, Z Massy2, B
Lacour1
1Laboratoire de biochimie A, Hôpital Necker-Enfants
Malades, Paris
2Inserm U507, Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris
3Laboratoires Nephrotek, Rungis
Article reçu le 16 Juin 2004, accepté le 24 Août 2004
Il existe chez le patient hémodialysé une incidence élevée
d’accidents cardiovasculaires par rapport à la population générale
[1]. De nombreux facteurs de risque cardiovasculaire se développent
avec la progression de l’insuffisance rénale. Les uns sont communs
à la population générale, tels que l’hypertension artérielle, le
sexe masculin, le tabagisme, la sédentarité, le diabète, et les
autres sont propres à l’urémie chronique, tels que l’hypertrophie
ventriculaire gauche, l’hyperparathyroïdie secondaire,
l’hyperhomocystéinémie, l’hyperfibrinémie, et plus particulièrement
la dyslipidémie et le stress oxydant [2, 3]. En effet, l’oxydation
des lipoprotéines de basse densité (LDL) constitue l’événement
principal dans la genèse de l’athérome [4]. Le stress oxydant,
défini par la rupture de l’équilibre entre la production de formes
réactives de l’oxygène (FRO) et la capacité de défense antioxydante
de l’organisme, est particulièrement délétère chez le patient
hémodialysé car il se produit de façon massive et répétée à chaque
séance de dialyse du fait du contact du sang avec les membranes de
dialyse, face à un déficit chronique en système de défense
antioxydante, en particulier du système du glutathion et de la
vitamine C [5]. Les cellules phagocytaires activées au contact de
la membrane de dialyse et des endotoxines bactériennes du dialysat,
génèrent des FRO responsables de l’oxydation des lipides. Pour
évaluer cet effet délétère sur les lipides, nous avons disposé d’un
système désigné Form (free oxygen radical monitor) (CR2000,
Callegari, Parme, Italie) qui mesure de façon simple et rapide, la
génération des hydroperoxydes lipidiques en utilisant une méthode
colorimétrique. Les peroxydes lipidiques (ROOH) circulants se
dégradent rapidement in vivo produisant des radicaux alcooxyls
(RO•) et peroxyls (ROO•) selon
la réaction suivante :La réaction d’un radical,
RO• ou ROO•, avec le
chromogène, la paraphénylènediamine (ANH2), conduit à la
formation d’un complexe coloré rouge selon le schéma
suivant :Le complexe formé est dosé par spectrophotométrie à
505 nm. L’intérêt majeur de ce système est la réalisation
simple du dosage à partir d’une goutte de sang total avec une
réponse en moins de 10 minutes, éliminant ainsi les
difficultés préanalytiques.L’objectif du travail a été d’étudier la
sensibilité du système Form dans l’évaluation du stress oxydant
chez le patient hémodialysé. Pour cela nous avons confronté les
résultats obtenus par le système Form, aux marqueurs classiques du
stress oxydant tels que ceux de l’oxydation lipidique, TBARS
(thiobarbituric acid reacting substances), de l’oxydation
protéique, carbonyles, et des antioxydants tels que la vitamine E
(α-tocophérol) plasmatique et le glutathion érythrocytaire.
Matériel et méthodes
Patients et témoins
L’étude a porté sur quatorze patients hémodialysés âgés de
49,2 ± 12,6 ans (moyenne ± DS)
(8 femmes et 6 hommes). Les patients tabagiques,
présentant des troubles hépatiques, immunohématologiques ou
inflammatoires, ont été exclus. La dialyse est réalisée pour ces
patients 3 fois par semaine, avec une membrane de dialyse de
type diacétate de cellulose et un dialysat bicarbonaté de haute
qualité bactériologique. Les patients testés étaient déjà inclus
dans une autre étude en cours pour laquelle ils avaient donné leur
consentement, et ont donné leur accord pour ce dosage
supplémentaire. Douze sujets volontaires sains âgés de
52,6 ± 10,3 ans (6 femmes et 6 hommes) ont
constitué le groupe témoin. Les prélèvements sanguins ont été
réalisés chez les patients hémodialysés au niveau de la fistule
artérioveineuse avant le début de la séance de dialyse, et chez les
témoins au pli du coude. Le sang est prélevé dans des tubes
Vacutainer® contenant de l’héparinate de sodium comme
anticoagulant et dans des tubes sans anticoagulant. Les
échantillons de sang sur héparinate de sodium sont bien
homogénéisés avant qu’une fraction de sang total ne soit prélevée
pour le dosage Form. Ensuite, tous les prélèvements sont rapidement
centrifugés (3 500 trs/min pendant 10 min à
4 °C). Le plasma est fractionné et conservé immédiatement à –
80 °C. Le culot globulaire est lavé 3 fois avec du sérum
physiologique, puis fractionné et conservé à – 80 °C. Les
échantillons de sérum sont fractionnés et conservés à – 80 °C.
Système Form
La présence d’hydroperoxydes lipidiques est mesurée par le test
Form. Immédiatement après le prélèvement, 20 μL de sang total
sont introduits dans un microtube prêt à l’emploi contenant
1 mL d’une solution d’acétate tamponnée à pH 4,8. Après
homogénéisation, tout l’hémolysat est transféré dans une cuvette à
usage unique pour photomètre (10 x 10 mm) contenant le
chromogène, la paraphénylènediamine, sous forme lyophilisée. Après
homogénéisation et centrifugation pendant 1 minute, la cuvette
est introduite dans le photomètre Form, déclenchant automatiquement
à 3 puis à 6 minutes, la lecture de la densité optique à
505 nm. Dans les conditions d’utilisation de la loi de Beer
Lambert, la variation de densité optique entre les deux mesures,
produite par la génération du composé coloré, est proportionnelle à
la concentration d’hydroperoxydes lipidiques dans l’échantillon. Le
système Form rend les résultats exprimés en unités/L, une unité
correspondant à 0,26 mg/L d’H2O2. Les
coefficients de variation intra- et interséries sont inférieurs à
5 %.
Dosage des TBARS
Les TBARS sont mesurés par réaction avec l’acide thiobarbiturique,
à l’aide du coffret Sobioda (Montbonnot, France). Brièvement,
100 μL de plasma sont mélangés avec 750 μL d’acide
thiobarbiturique puis placés au bain-marie à 95 °C pendant une
heure. Le complexe formé est extrait par 3 mL de butyl
acétate, la mesure est réalisée sur la phase organique par
spectrofluorimétrie synchrone avec une différence de longueur
d’onde de 14 nm entre l’excitation et l’émission (RF540,
Shimadzu) [6].
Dosage des carbonyles
Les carbonyles plasmatiques sont dosés par une méthode
spectrophotométrique utilisant la 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH)
[7]. Le plasma est séparé en 2 échantillons. Un sera traité
par une solution de DNPH 10 mM, HCl 2,5 mM, et l’autre
par HCl 2,5 mM. Après une incubation d’une heure à température
ambiante et à l’obscurité, une déprotéinisation est réalisée à
4 °C par de l’acide trichloroacétique à 20 % à –
20 °C pendant 10 minutes. Le précipité récupéré après
centrifugation est lavé une première fois par de l’acide
trichloroacétique à 10 %, puis trois fois avec un mélange
éthanol/éthylacétate (1:1, volume/volume). Il est ensuite
solubilisé à 37 °C pendant 10 minutes dans le
chlorhydrate de guanidine 6 M, pH 2,3. L’absorbance de la
solution est mesurée au spectrophotomètre DU800 (Beckman Coulter,
Villepinte, France) en utilisant pour coefficient d’absorption
molaire des carbonyles à 370 nm
ε = 22 000 M-1cm-1. Les
résultats sont exprimés en nmol/mg de protéine, la concentration
protéique étant déterminée à 280 nm par rapport à une gamme
d’albumine bovine.
Dosage de l’α-tocophérol
Le dosage de l’α-tocophérol est réalisé par chromatographie liquide
haute performance (CLHP) avec détection UV à 292 nm. Après
déprotéinisation de 200 μL de plasma additionné de 30 µL
d’étalon interne, l’acétate de tocophérol, par 170 μL
d’éthanol, la vitamine E est extraite par 500 μL d’heptane. La
phase organique est évaporée sous un courant d’azote et l’extrait
sec est repris par 100 μL de méthanol. Ensuite 20 μL
d’échantillon sont injectés dans le système de séparation utilisant
une colonne Satisfaction® RP18AB (250 x
4,6 mm, 5 μm, CIL Cluzeau, Puteaux, France) et comme
phase mobile le méthanol délivré à un débit de 2 mL/min. Dans
ces conditions le temps de rétention de l’α-tocophérol est de
7,7 minutes et celui de l’étalon interne, l’acétate
d’α-tocophérol de 9,5 minutes.
Dosage du glutathion érythrocytaire
Les formes réduite (GSH) et oxydée (GSSG) du glutathion
intraérythrocytaire sont dosées simultanément par technique CLHP
avec détection coulométrique. Après déprotéinisation par l’acide
métaphosphorique à 5 %, la séparation s’effectue sur une colonne
Uptisphère® (ODB, 250 x 4,6 mm, 5 μm,
Interchim, Montluçon, France), en utilisant comme phase mobile un
tampon de phosphate de sodium 10 mM, pH 2,7, contenant
2 % de méthanol, à un débit de 1 mL/min. Les cellules
potentiométriques du détecteur Coulochem 5100A (Eurosep, France)
sont réglées à E1 = 400 mV et
E2 = 800 mV. Les temps de rétention du
GSH, du GSSG, et de la N-acétylcystéine utilisée comme étalon
interne sont respectivement de 6 min, 15 min et
12 min. Le potentiel redox intracellulaire est mesuré par le
rapport des concentrations de GSSG et de GSH intraérythrocytaires.
La concentration de GSSG est exprimée en équivalent GSH
(1 mole de GSSG correspondant à 2 moles d’équivalent
GSH).
Analyse statistique
Le test U de Mann Whitney a été utilisé pour l’analyse statistique.
Une différence significative est notée pour p < 0,05.
Résultats
Système Form : calibrage et dosages
Le calibrage a été réalisé à l’aide d’une gamme
d’H2O2 (( figure 1 )). Après
modification de la programmation du facteur de calibrage k sur le
système, les résultats observés étaient comparables aux valeurs
calculées à partir des différentes concentrations
d’H2O2 utilisées (tableau I( Tableau I )). Les résultats obtenus avec le
sérum de contrôle (Ref AD-12028,lot A1100.2, exp. 12-2004, valeur
cible Form = 390 unités/L) ont permis de valider
l’utilisation du facteur k à 14 pour les dosages ultérieurs
(tableau II( Tableau II )).
En ce qui concerne la stabilité et la conservation du sérum de
contrôle, il a été noté une augmentation significative des valeurs
obtenues après 10 semaines de conservation à – 80 °C
(tableau II).
Les dosages Form ont été réalisés chez patients hémodialysés et
chez les sujets sains en utilisant un facteur k égal à 14. Aucune
différence significative n’a pu être observée entre les deux
groupes (455 ± 94 unités/L chez les patients
hémodialysés contre 435 ± 100 unités/L chez les
sujets témoins (tableau III( Tableau III )).
Pour évaluer la réponse du système Form à la production in vitro
d’H2O2, nous avons stimulé la production
d’H2O2 par l’introduction de
lipopolysaccharides (LPS, Sigma Aldrich, 167 mg/L) dans un
échantillon de sang total d’un volontaire sain. Les dosages Form
ont été réalisés avant l’introduction de LPS
(Form = 437 unités/L), après 5 minutes
d’incubation avec le LPS (Form = 202 unités/L), puis
après 15 minutes d’incubation avec le LPS
(Form = 219 unités/L) et enfin après 30 minutes
d’incubation avec le LPS (Form = 206 unités/L). Aucune
relation n’a pu être montrée entre les résultats obtenus avec le
système Form et la production d’H2O2.
Tableau I Calibrage du système Form avec une
solution de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à
différentes concentrations.
|
H2O2 (mmol/L)
|
Form (unités/L) k = 14
|
Form (unités/L) k = 10
|
|
0,0
|
48
|
0
|
|
1,66
|
250
|
217
|
|
2,49
|
346
|
325
|
|
3,32
|
437
|
434
|
|
4,15
|
538
|
542
|
|
4,57
|
516
|
597
|
|
4,98
|
612
|
651
|
|
6,64
|
742
|
868
|
Tableau II Valeurs du contrôle du système Form
(Ref AD-12028, lot A1100.2, exp. 12-2004, valeur cible
Form = 390 unités/L).
|
Date
|
État
|
Form k = 10
|
Form k = 14
|
|
03/06/03
|
Fraîchement reconstitué
|
306 et 310
|
391
|
|
13/06/03
|
Conservation
|
|
394
|
|
10 jours à – 80 °C
|
|
|
|
28/08/03
|
Conservation
|
|
525
|
|
10 semaines à – 80 °C
|
|
|
|
28/08/03
|
Fraîchement reconstitué
|
328
|
408
|
Tableau III Détermination des principaux marqueurs
du stress oxydant chez les témoins et les patients hémodialysés
(moyenne ± DS).
|
Témoins N = 12
|
Hémodialysés N = 14
|
|
Form (unités/L)
|
435 ± 100
|
455 ± 94
|
|
TBARS (μmol/L)
|
1,96 ± 0,32
|
4,18 ± 1,13***
|
|
Carbonyles (nmol/mg prot)
|
0,76 ± 0,10
|
1,10 ± 0,29**
|
|
α-tocophérol (μmol/L)
|
32,0 ± 4,5
|
32,1 ± 6,3
|
|
GSH érythrocytaire (nmol/g Hb)
|
5,27 ± 1,27
|
4,06 ± 1,53
|
|
Rapport GSSG/GSH (eq GSH)
|
0,12 ± 0,06
|
0,59 ± 0,58*
|
Relation entre les résultats du système Form et les marqueurs
circulants du stress oxydant
Le stress oxydant existant chez le patient dialysé est identifiable
par l’augmentation significative des concentrations plasmatiques
des marqueurs de la peroxydation lipidique (ie TBARS) et de
l’oxydation des protéines (ie carbonyles), ainsi que par
l’augmentation significative du rapport GSSG/GSH érythrocytaire par
rapport aux témoins (tableau III). Concernant la concentration
plasmatique d’α-tocophérol, aucune différence significative n’a été
observée entre les patients hémodialysés et les témoins. Aucune
relation n’a pu être observée entre les valeurs du système Form et
les dosages de TBARS (( figure 2 )), ni avec le
rapport intraérythrocytaire GSSG/GSH (( figure 3 )). En revanche,
il existe une corrélation significative entre les concentrations
plasmatiques de TBARS et le rapport intraérythrocytaire GSSG/GSH
(r = 0,46, p < 0,05).
Discussion
Il nous a paru intéressant de tester le système Form pour la mesure
des hydroperoxydes lipidiques circulants en utilisant une méthode
rapide et simple. Ce test présente une meilleure reproductibilité
par rapport à un système comparable diacron reactive oxygen
metabolites (D-ROM, Diacron, Grosseto, Italie) [8] par
l’utilisation du chromogène sous forme lyophilisée, plus stable que
la forme soluble. Le test Form, portant la certification CE, a déjà
été utilisé dans le cadre des maladies respiratoires et a montré
qu’il existe une augmentation significative des valeurs Form chez
les patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive
par rapport aux sujets sains et aux sujets tabagiques sans atteinte
pulmonaire (Verduri, communication personnelle, 2002).
Les laboratoires Callegari proposent d’utiliser le test Form
avec un facteur de calibrage k = 10. En fonction des
résultats obtenus avec le sérum de contrôle ou une solution
calibrée de H2O2, le facteur k peut être
modifié, une variation d’une unité de k correspondant à une
variation de 5 % des valeurs de Form. Ainsi, nous avons
utilisé un facteur de calibrage k = 14 et nos
résultats des sérums de contrôle et de la gamme
d’H2O2 ont été validés. Les valeurs Form
obtenues chez les témoins sont plus fortes par rapport aux valeurs
usuelles indiquées par le fournisseur entre 230 et
310 unités/L. Cela peut s’expliquer par l’augmentation de la
valeur du facteur k à 14.
Nos patients hémodialysés présentent, à l’évidence, un stress
oxydant caractérisé par une augmentation significative des TBARS
plasmatiques et des carbonyles ainsi que par une augmentation
significative du rapport GSSG/GSH intraérythrocytaire. Ces
résultats sont en accord avec les données de la littérature [9-11].
Cependant les résultats obtenus avec le système Form ne montrent
pas ce statut oxydant chez les patients hémodialysés par rapport
aux témoins.
Il est possible que la présence de fortes concentrations
plasmatiques de toxines urémiques et/ou de produits d’oxydation
divers tels que les produits d’oxydation avancée des protéines
(AOPP) interférent sur le test Form. En effet, nous avons
précédemment montré l’influence des AOPP sur un test comparable
utilisant une détection en chimioluminescence, le Total peroxyl
radical trapping antioxidant potential [12] dans le cadre de
l’urémie chronique et de l’hémodialyse. Il ressort de notre étude
que l’utilisation du test Form dans le cadre particulier de
l’urémie chronique, n’apporte pas d’information sur le niveau du
stress oxydant de ces malades.
Références
1 Locatelli F, Marcelli D, Conte F, et al.
Cardiovascular disease in chronic renal failure : the
challenge continues. Nephrol Dial Transplant 2000 ; 15(Suppl.
5) : 69-80.
2 Chiarello PG, Vannucchi MT, Vannucchi H.
Hyperhomocysteinemia and oxidative stress during dialysis
treatment. Ren Fail 2003 ; 25 : 203-13.
3 Nishizawa Y, Shoji T, Kawagishi T,
Morii H. Atherosclerosis in uremia : possible roles of
hyperparathyroidism and intermediate density lipoprotein
accumulation. Kidney Int 1997 ; 62 : S90-S92.
4 Maggi E, Bellazzi R, Falaschi F, et al.
Enhanced LDL oxidation in uremic patients : an additional
mechanism for accelerated atherosclerosis ? Kidney Int
1994 ; 45 : 876-83.
5 Nguyen-Khoa T, Massy ZA, De Bandt JP,
et al. Oxidative stress and haemodialysis : role of
inflammation and duration of dialysis treatment. Nephrol Dial
Transplant 2001 ; 16 : 335-40.
6 Conti M, Morand PC, Levillain P,
Lemonnier A. Improved fluorometric determination of
malonadehyde. Clin Chem 1991 ; 37 : 1273-5.
7 Levine RL, Williams JA, Stadtman ER,
Shacter E. Carbonyl assays for determination of oxidatively
modified proteins. Methods Enzymol 1994 ; 233 :
346-57.
8 Iamele L, Fiocchi R, Vernocchi A. Evaluation of
an automated spectrophotometric assay for reactive oxygen
metabolites in serum. Clin Chem Lab Med 2002 ; 40 :
673-6.
9 Paul JL, Sall ND, Soni T, et al. Lipid
peroxidation abnormalities in hemodialyzed patients. Nephron
1993 ; 64 : 106-9.
10 Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D,
Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl groups as
biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta 2003 ;
329 : 23-38.
11 Ceballos-Picot I, Witko-Sarsat V,
Merad-Boudia M, et al. Glutathione antioxidant system as
a marker of oxidative stress in chronic renal failure. Free Radic
Biol Med 1996 ; 21 : 845-53.
12 Nguyen-Khoa T, Massy ZA, Witko-Sarsat V,
et al. Critical evaluation of plasma and LDL oxidant-trapping
potential in hemodialysis patients. Kidney Int 1999 ;
56 : 747-53.
|
Printable version
