ARTICLE
Auteur(s) :, PM Guéye, I Sall, J-M Lessinger, G Férard
Laboratoire de biochimie appliquée, U392 Inserm, Faculté de
pharmacie, Illkirch
Article reçu le 21 Août 2004, accepté le 20 Août 2004
L’haptoglobine (Hp) est une protéine de la phase inflammatoire qui
présente la propriété de fixer l’hémoglobine (Hb) avec une forte
affinité pour former un complexe soluble et stable [1]. À ce titre,
elle est la protéine majeure du plasma pour la capture de
l’hémoglobine libre, ce qui permet de protéger le rein.
L’haptoglobine présente un polymorphisme génétique avec trois
phénotypes majeurs : Hp 1-1, Hp 2-1, et Hp 2-2 [2]. Ces
phénotypes sont tous les trois représentés à des fréquences
significatives dans la population générale [3]. L’interférence
d’une hémolyse marquée (Hb > 1 g/L dans le
plasma) dans les techniques immunonéphélémétriques est connue, que
ce soit en mode point final ou en mode cinétique [4]. Elle a été
récemment documentée de manière spécifique pour la mesure
immunonéphélémétrique en mode cinétique avec l’automate
Immage® (Beckman Coulter) [5], mais avec des
concentrations importantes en hémoglobine puisque comprises entre
4 et 14 g/L.Nous avons voulu savoir si une hémolyse
légère et non décelable à l’œil nu (Hb < 0,3 g/L)
interférait également dans la mesure immunonéphélémétrique de
l’haptoglobine. Pour ceci, nous avons utilisé le fait que la
coagulation sanguine entraîne une faible hémolyse in vitro
[6] ; en pratique, nous avons comparé les concentrations
d’haptoglobine déterminées par immunonéphélémétrie dans les plasmas
et sérums d’une série d’adultes. Les concentrations d’hémoglobine
libre ont par ailleurs été déterminées dans chaque spécimen. De
plus, l’influence du phénotype d’haptoglobine dans l’interférence
de l’hémoglobine a été évaluée puisque des différences dans les
capacités de fixation en hémoglobine par les phénotypes
d’haptoglobine ont été signalées [3, 7]. L’étude a été complétée
par la vérification que les plasmas héparinés peuvent être utilisés
en immunonéphélémétrie cinétique pour la mesure d’haptoglobine.
Matériels et méthodes
Des sérums et des plasmas ont été préparés à partir de prélèvements
sanguins provenant de 27 adultes consentants (12 hommes
et 15 femmes ; âge compris entre 22 et 84 ans).
Quelques caractéristiques de ces sujets sont indiquées dans le
tableau I( Tableau I ). Les
prélèvements sanguins ont été réalisés au pli du coude avec deux
tubes S-Monovette®, l’un sans coagulant et l’autre avec
héparinate de lithium (Sarstedt). Les spécimens sanguins ont été
laissés 30 min à température ambiante avant une centrifugation
à 15 °C pendant 10 min à 1 500 g. La
concentration d’haptoglobine a été déterminée par
immunonéphélémétrie (Immage®, Beckman Coulter) avec les
réactifs du fabricant. De plus, les plasmas de 146 patients
souffrant de diverses pathologies ont été analysés pour connaître
leur phénotype d’haptoglobine. Le phénotypage a été réalisé après
une préincubation des spécimens avec un excès d’hémoglobine humaine
purifiée à partir d’un hémolysat. Une électrophorèse sur gel de
polyacrylamide (à 5 %, à pH 8,4 et 2 h de migration
sous un voltage constant de 200 V) a ensuite été effectuée.
Après la migration, les bandes caractéristiques des phénotypes
d’haptoglobine ont été visualisées grâce à leur pouvoir
peroxydasique en plaçant les gels dans une solution acétique
d’orthodianisidine pendant 2 h. Après incubation, une solution
d’H2O2 à 3 % (v/v) préparée
extemporanément a été ajoutée, ce qui a provoqué l’apparition de
bandes jaune brun dont le nombre et la position sont
caractéristiques des phénotypes d’haptoglobine. L’hémoglobine libre
a été déterminée avec un coffret réactif (Sigma) utilisant la
méthode de Standefer [8] et plus précisément avec la 3,3′,5,5′-
tétraméthylbenzidine, puis mesure de l’absorbance à 520 nm sur
Uvikon 922 (Kontron Inst).
Les comparaisons statistiques entre les résultats obtenus sur
sérums et plasmas ont été réalisées avec le test t apparié de
Student.
Tableau I Concentrations sériques et plasmatiques
d’hémoglobine libre et d’haptoglobine chez 27 adultes.
|
Âge
|
Sexe
|
Phénotype
|
Se-Hp
|
Pl-Hp
|
Se-Hb
|
Pl-Hb
|
|
1
|
31
|
F
|
Hp 1-1
|
1,17
|
1,18
|
0,050
|
0,030
|
|
2
|
84
|
M
|
Hp 1-1
|
1,53
|
1,68
|
0,033
|
0,013
|
|
3
|
30
|
F
|
Hp 1-1
|
2,84
|
2,95
|
0,084
|
0,008
|
|
4
|
27
|
F
|
Hp 1-1
|
0,91
|
0,97
|
0,088
|
0,021
|
|
5
|
51
|
F
|
Hp 2-1
|
1,32
|
1,38
|
0,048
|
0,007
|
|
6
|
74
|
M
|
Hp 2-1
|
1,48
|
1,49
|
0,055
|
0,006
|
|
7
|
64
|
M
|
Hp 2-1
|
1,13
|
1,19
|
0,090
|
0,045
|
|
8
|
66
|
M
|
Hp 2-1
|
2,30
|
2,43
|
0,109
|
0,038
|
|
9
|
42
|
M
|
Hp 2-1
|
2,91
|
3,08
|
0,128
|
0,014
|
|
10
|
65
|
M
|
Hp 2-1
|
0,75
|
0,86
|
0,099
|
0,018
|
|
11
|
71
|
M
|
Hp 2-1
|
1,21
|
1,53
|
0,174
|
0,011
|
|
12
|
22
|
M
|
Hp 2-1
|
0,73
|
0,82
|
0,077
|
0,006
|
|
13
|
38
|
F
|
Hp 2-1
|
1,60
|
1,58
|
0,022
|
0,001
|
|
14
|
65
|
M
|
Hp 2-1
|
1,70
|
1,71
|
0,027
|
0,022
|
|
15
|
72
|
F
|
Hp 2-1
|
1,75
|
1,85
|
0,055
|
0,016
|
|
16
|
56
|
F
|
Hp 2-1
|
1,11
|
0,99
|
0,040
|
0,026
|
|
17
|
34
|
F
|
Hp 2-1
|
1,22
|
1,29
|
0,090
|
0,042
|
|
18
|
48
|
F
|
Hp 2-1
|
1,37
|
1,43
|
0,059
|
0,008
|
|
19
|
57
|
F
|
Hp 2-1
|
1,70
|
1,76
|
0,048
|
0,017
|
|
20
|
71
|
F
|
Hp 2-2
|
1,72
|
1,91
|
0,060
|
0,023
|
|
21
|
83
|
F
|
Hp 2-2
|
1,44
|
1,41
|
0,034
|
0,004
|
|
22
|
32
|
M
|
Hp 2-2
|
0,53
|
0,57
|
0,053
|
0,014
|
|
23
|
43
|
F
|
Hp 2-2
|
1,07
|
1,08
|
0,084
|
0,015
|
|
24
|
40
|
M
|
Hp 2-2
|
1,61
|
1,66
|
0,088
|
0,022
|
|
25
|
68
|
F
|
Hp 2-2
|
1,75
|
1,74
|
0,062
|
0,012
|
|
26
|
32
|
M
|
Hp 2-2
|
1,70
|
1,71
|
0,046
|
0,017
|
|
27
|
77
|
F
|
Hp 2-2
|
0,66
|
0,68
|
0,063
|
0,018
|
|
Moyenne
|
54
|
|
|
1,46
|
1,52
|
0,069
|
0,017
|
|
Ecart-type
|
16
|
|
|
0,52
|
0,54
|
0,033
|
0,015
|
|
|
|
|
p < 0,005
|
p < 0,01
|
Résultats
Effet de la coagulation sur la mesure d’haptoglobine et sur la
concentration d’hémoglobine libre
Les prélèvements sériques et plasmatiques des 27 adultes ne
présentaient pas d’hémolyse visible à la suite d’une inspection
visuelle. Les résultats d’haptoglobine obtenus par
immunonéphélémétrie et regroupés dans le tableau I indiquent que
les concentrations sériques d’haptoglobine sont constamment
inférieures à celles des plasmas correspondants
(p < 0,005). Des différences systématiques et
significatives (p < 0,01) sont aussi observées pour
les concentrations sériques et plasmatiques d’hémoglobine (tableau
I). Les concentrations moyennes d’hémoglobine libre sont quatre
fois plus faibles dans le plasma que dans le sérum. Cette
différence systématique est toutefois affectée d’une variabilité
interindividuelle considérable puisque les concentrations sériques
rapportées aux concentrations plasmatiques sont comprises entre
1,2 et 16.
Effet d’une surcharge en hémoglobine sur la mesure
d’haptoglobine
Nous avons testé l’effet de l’hémoglobine sur la mesure
d’haptoglobine réalisée en immunonéphélémétrie. Pour ceci, un
spécimen sérique de chacun des trois phénotypes d’haptoglobine a
été surchargé en hémoglobine. Les résultats sont représentés sur la
( figure 1 ) en
prenant en compte la concentration totale d’hémoglobine retrouvée,
c’est-à-dire la somme de la concentration déjà présente en
hémoglobine libre et celle ajoutée lors de la surcharge. Ils
montrent que pour des concentrations d’hémoglobine comprises entre
0 et 1 g/L, on observe dans nos conditions une
décroissance linéaire de l’haptoglobine mesurée en
immunonéphélémétrie. On note que cette décroissance concerne déjà
la zone de concentration en hémoglobine pour laquelle l’hémolyse
n’est pas visible à l’œil nu. Cet effet ne semble pas dépendant du
phénotype d’haptoglobine.
Effet du degré d’hémolyse sur la mesure d’haptoglobine
Une relation inverse lie de manière assez étroite (r = -
0,72) les différences entre sérum et plasma des deux paramètres
(hémoglobine et haptoglobine). L’équation des moindres carrés est
la suivante : y = - 1,82x + 0,03 avec y en g/L
d’haptoglobine et x en g/L d’hémoglobine. L’effet de l’hémolyse ne
paraît pas être influencé par le phénotype d’haptoglobine (( figure 2 )). Lorsque
les différences entre sérum et plasma des deux paramètres sont
considérées, on n’observe pas de différence significative entre les
séries de valeurs constituées selon les trois phénotypes.
Effet de l’héparinate de lithium sur la mesure d’haptoglobine
en immunonéphélémétrie
Un pool de sérum ne présentant pas d’hémolyse visible a été
surchargé avec des concentrations croissantes d’héparinate de
lithium. Les concentrations d’haptoglobine retrouvées en
immunonéphélémétrie restent constantes dans l’intervalle 0 à
40 UI/mL d’héparinate (tableau II( Tableau II )). Parmi celles-ci, la
concentration d’héparinate de 20 UI/mL est celle présente dans
les tubes de prélèvement que nous avons employés. Dans nos
conditions, l’héparinate de lithium n’interfère pas dans le dosage
immunonéphélémétrique de l’haptoglobine.
Tableau II Effet de l’héparinate de lithium sur la
mesure de l’haptoglobine en immunonéphélémétrie.
|
Héparinate (UI) /mL)
|
0
|
10
|
20
|
30
|
40
|
|
Hp (g/L)
|
3,11
|
3,11
|
3,09
|
3,06
|
3,02
|
Répartition des phénotypes d’haptoglobine
Les phénotypes de 146 patients adultes consultant pour
diverses pathologies ont été déterminés. Les proportions des trois
phénotypes qui sont indiquées dans le tableau III( Tableau III ) sont très voisines de celles
citées par Van Sande et al. à propos d’une population française
[9].
Tableau III Proportion des trois phénotypes
retrouvés dans une population de 146 patients consultant pour
diverses pathologies.
|
Proportion (%)
|
Hp 1-1
|
Hp 2-1
|
Hp 2-2
|
|
Étude présente
|
15,1
|
50,7
|
34,2
|
|
D’après Van Sande et al. [9]
|
15,3
|
49,7
|
35,0
|
Discussion
Les résultats obtenus en comparant sérums et plasmas montrent que
la coagulation entraîne systématiquement une hémolyse légère, ce
qui confirme des observations précédentes [5, 6]. Nos résultats
indiquent aussi que, malgré une standardisation rigoureuse des
prélèvements et de la préparation des sérums et des plasmas,
l’importance de l’hémolyse varie considérablement. Bien que cette
hémolyse reste limitée et dans tous les cas étudiés non visible à
l’œil nu, elle crée une interférence négative lorsque la mesure de
l’haptoglobine est réalisée par immunonéphélémétrie selon un mode
cinétique avec l’appareil Immage® sur sérum. Cette
observation a été retrouvée après surcharge in vitro avec de
l’hémoglobine humaine. Elle confirme les données obtenues par
d’autres auteurs ayant utilisé des concentrations supérieures en
hémoglobine et différents systèmes analytiques [4, 5]. La
différence des concentrations plasmatiques d’haptoglobine par
rapport aux sérums lorsque mesurées en immunonéphélémétrie n’est
pas liée à une interférence positive créée par l’héparinate de
lithium. C’est la raison pour laquelle il nous semble justifié de
recommander de mieux maîtriser la phase préanalytique en réalisant
la mesure d’haptoglobine par immunonéphélémétrie sur plasma plutôt
que sur sérum. L’erreur moyenne observée par l’hémolyse in vitro
due à la coagulation (- 5 %) dépasse la variabilité analytique
évaluée par le contrôle de qualité interne du laboratoire
(CV = 3,8 %) dans la zone des concentrations
plasmatiques usuelles en haptoglobine. Il faut toutefois noter que
dans notre série, les résultats indiquent aussi que l’erreur due à
l’hémolyse peut atteindre 20 % c’est-à-dire bien plus que la
variabilité intra-individuelle estimée à 8,8 % [10]. Les
résultats de cette étude montrent aussi que l’interférence de
l’hémoglobine est retrouvée pour les trois phénotypes de
l’haptoglobine. Il est aussi à noter que les proportions observées
des trois phénotypes sont en accord avec celles rapportées dans la
population européenne [9].
Conclusion
Dans nos conditions de mesure (mesure immunonéphélémétrique sur
appareil Immage®), une hémolyse non décelable à l’œil nu
telle que celle provoquée par la coagulation sanguine entraîne une
interférence négative systématique et non négligeable dans le
dosage de l’haptoglobine. Ce fait nous conduit à recommander de
déterminer l’haptoglobine sur plasma plutôt que sur sérum. Cette
recommandation s’applique lorsque l’objectif est de suivre un
phénomène inflammatoire, une hémolyse in vivo ou encore lorsque
l’haptoglobine est utilisée comme variable dans des scores
multiparamétriques tels que Fibrotest® ou
Actitest®[11]. Enfin, il nous paraît également justifié
d’établir des intervalles de référence sur des spécimens
plasmatiques et non sériques.
Références
1 McCormick DJ, Atassi MZ. Hemoglobin binding with
haptoglobin : delineation of the haptoglobin binding site on
the alpha-chain of human hemoglobin. J Protein Chem 1990 ;
9 : 735-42.
2 Bowman BH, Kurosky A. Haptoglobin : the
evolutionary product of duplication, unequal crossing over, and
point mutation. Adv Hum Genet 1982 ; 12 : 189-261.
3 Javid J. The effect of haptoglobin-polymer size on
hemoglobin binding capacity. Vox Sang 1965 ; 10 :
320-5.
4 Boussuyt X, Blanckaert N. Evaluation of
interferences in rate and fixed-time nephelometric assays of
specific serum proteins. Clin Chem 1999 ; 45 : 62-7.
5 Zerbani A, Giraudeaux V. Dosage de l’haptoglobine
par immunonéphélémétrie sur Immage (Beckman) : attention à
l’interférence de l’hémoglobine. Ann Biol Clin 1999 ;
57 : 490.
6 Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B.
Samples : from the patient to the laboratory. The impact of
preanalytical variables on the quality of laboratory results.
Darmstadt : GIT Verlag GmbH, 1996.
7 Delanghe J, Allcock K, Langlois M,
Claeys L, De Buyzere M. Fast determination of haptoglobin
phenotype and calculation of hemoglobin capacity using high
pressure gel permeation chromatography. Clin Chim Acta 2000 ;
291 : 43-51.
8 Standefer JC, Vanderjagt D. Use of
tetramethylbenzidine in plasma hemoglobin assay. Clin Chem
1977 ; 23 : 749-51.
9 Van Sande M, Van Ros G, Druet R. Determination
of haptoglobin groups frequencies by starch-gel and agar-gel
electrophoresis : application to Belgian and Barundi
populations. Nature 1963 ; 197 : 603-4.
10 Statland BE, Winkel P, Killingsworth LM.
Factors contributing to intra-individual variation in concentration
of 10 specific proteins in sera of healthy subjects. Clin Chem
1976 ; 22 : 1635-8.
11 Imbert-Bismut F, Ratziu V, Pieroni L,
Charlotte F, Benhamou Y, Poynard T. Biochemical
markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus
infections : a prospective study. Lancet 2001 ;
357 : 1069-75.
|
Printable version
