ARTICLE
Auteur(s) :, S Fallouh1, P-J
Lejeune2, J Barbaria2, B
Mallet2
1Université de médecine de Damas, Syrie
2Laboratoire de biochimie, CHU Timone et U555 Inserm,
Faculté de médecine, Marseille
Article reçu le 28 Avril 2004, accepté le 10 Août 2004
L’iode est un oligoélément indispensable à la biosynthèse des
hormones thyroïdiennes, métabolites essentiels pour la croissance
normale et la maturation structurale et fonctionnelle du système
nerveux des vertébrés. La glande thyroïde capte activement l’iode
sanguin et le fixe sur quelques résidus de tyrosine de la
prohormone : la thyroglobuline, pour former les iodotyrosines
(MIT et DIT) dont certaines vont se coupler pour former les
hormones T3 et T4 [1]. Dans des conditions physiologiques, l’iode
sérique provient exclusivement des apports alimentaires. Cependant,
on peut observer une concentration excessive, le plus souvent
d’origine iatrogène, due à la prescription de produits de
contraste, d’antiseptiques, de certains médicaments tels que
l’amiodarone ou à une radiothérapie à l’131I après
thyroïdectomie.Des études cinétiques du métabolisme de l’iode ont
montré que les quantités d’iode captées par la thyroïde étaient
équivalentes aux quantités d’iode excrétées dans les urines et dont
la mesure représente un indicateur fiable du statut iodé d’un
individu [2]. Chez l’homme, les concentrations urinaires de MIT et
de DIT peuvent être de l’ordre de 1 à 20 % de celles des
concentrations sanguines [3, 4]. De nombreuses méthodes de dosage
de l’iode urinaire sont décrites [5], allant de la plus
sophistiquée (activation neutronique) à la plus simple et rapide
(Urojod®, Merck). La large majorité des techniques
utilisées fait appel à la méthode colorimétrique décrite par
Sandell et Kolthoff [6], dans laquelle l’effet catalytique des ions
iodures est mesuré par la réduction des ions cériques (CeIV, jaune)
en ions céreux (CeIII, incolore) par les ions arsénites (AsIII).
Cependant, cette méthode est sensible à de nombreuses interférences
dues à la présence de contaminants organiques ou minéraux capables
de réduire les ions cériques ou la présence de métabolites
augmentant la couleur jaune naturelle de l’urine. Pour ces raisons
la méthode préalable de minéralisation revêt une importance
cruciale. Nous avons évalué dans cette étude trois procédés de
minéralisation des urines et nous proposons une nouvelle méthode
alternative pour optimiser le dosage de l’iode urinaire.
Matériel et méthodes
Réactifs
MIT, DIT, KI et KIO3 proviennent de Sigma-Aldrich,
Saint-Quentin Fallavier, France. Les solvants pour chromatographie
et tous les autres réactifs de pureté analytique proviennent de
Merck Eurolab, Fontenay-sous-Bois, France. Toutes les solutions
sont préparées dans l’eau ultra-pure produite au laboratoire
(Milli-Q Water System, Millipore SA, Saint-Quentin, France).
Séparation de KI, KIO3, MIT et DIT par CLHP en phase
inverse
Un système 625LC (Waters Associates, Milford, MA, États-Unis) est
utilisé. Les échantillons (20 μL) sont injectés sur une
colonne Purospher RP18 (5 μm, 25 cm, Merck Eurolab)
équilibrée avec le solvant A (eau/acide trifluoroacétique,
99,5/0,5, v/v). La chromatographie est réalisée avec le solvant A
pendant 10 minutes puis avec un gradient linéaire jusqu’à
50 % de solvant B (acétonitrile/acide trifluoroacétique,
99,5/0,5, v/v) pendant 45 minutes. Le débit est de 0,8 mL
par minute et les fractions sont collectées chaque 0,5 minute.
Procédés de minéralisation
Méthode au persulfate
Soixante grammes de persulfate d’ammonium sont dissous dans
100 mL d’eau ultrapure juste avant utilisation [7]. La
minéralisation des échantillons (500 μL) est réalisée dans des
tubes en pyrex (VWR International, Fontenay-sous-Bois, France) par
ajout de 500 μL de solution de minéralisation pendant
1 heure à 110 °C dans un bain de sable.
Méthode au chlorate/acide perchlorique
Cinquante grammes de chlorate de potassium sont dissous dans
100 mL d’eau ultrapure puis chauffés pendant 1 heure dans
un bain-marie bouillant ; 37,5 mL d’acide perchlorique
(70 %, p/p) sont ajoutés sous agitation constante. La solution
est ensuite congelée une nuit à – 20 °C. Après décongélation
la suspension est filtrée sur Büchner et stockée à + 4 °C
jusqu’à utilisation [8, 9]. La minéralisation des échantillons
(500 μL) est réalisée par ajout de 500 μL de solution de
minéralisation dans les mêmes conditions que précédemment.
Méthode au mélange acide nitrique/acide chlorhydrique
Trois millilitres d’acide nitrique (65 %, p/p) sont ajoutés à
2 mL d’acide chlorhydrique (37 %, p/p) juste avant
utilisation. Il est à signaler que le mélange de ces deux acides
entraîne le développement d’une coloration jaune qui s’estompe
rapidement à chaud et a totalement disparu à la fin de la réaction
sans effet sur son pouvoir minéralisant. La minéralisation des
échantillons (500 μL) est réalisée par ajout de 250 μL de
solution de minéralisation dans les mêmes conditions que
précédemment.
À la fin de la minéralisation et après total refroidissement,
tous les tubes d’échantillons, quelle que soit la méthode utilisée,
sont complétés à 1 mL avec un tampon PBS 0,01 M, pH
9,0.
Solutions étalons
Une solution mère (1 mM) est préparée par dissolution de
16,6 mg d’iodure de potassium dans 100 mL d’eau
ultrapure. Cette solution est stable pendant 6 mois conservée
à + 4 °C à l’abri de la lumière et sert à préparer, par
dilution extemporanée, la solution 1 μM pour réaliser la gamme
d’étalonnage. Des volumes de 5, 10, 20 et 40 μL de cette
solution, correspondant respectivement à 5, 10, 20 et
40 pmol, sont déposés dans les puits d’une plaque de
microtitration-96 puits à fond plat (Nunc, VWR International,
Fontenay-sous-Bois, France). Les solutions étalons de
KIO3 (1 μM), MIT (1 μM) et DIT (1 μM) ont
été préparées extemporanément par dissolution dans l’eau ultrapure.
Échantillons
L’iode urinaire est évalué chez 250 patients hospitalisés au
CHU de la Timone. Les échantillons des urines des 24 heures
adressés au laboratoire n’ont pas été triés par rapport à une
pathologie particulière et sont stockés à – 20 °C
jusqu’au moment du dosage.
Réalisation du dosage colorimétrique
Le dosage est basé sur la méthode de Sandell-Kolthoff adaptée sur
microplaque [10-12] qui mesure la vitesse de décoloration,
catalysée par les ions iodures (I-) en milieu acide, des
ions cériques (Ce IV) par les ions arsénieux (As III). Le réactif
cérique est préparé par dissolution de 6,32 g de sulfate
d’ammonium cérique dihydraté dans l’acide sulfurique 2,5 M. La
solution obtenue (0,1 M) est stable conservée à + 4 °C en
flacon coloré pendant 6 mois et doit être diluée au
1/7 dans l’acide sulfurique à 10 % (v/v) au moment du
dosage. L’acide arsénieux est préparé par dissolution à chaud sous
agitation constante de 3,76 g de trioxyde d’arsenic dans
200 mL d’eau ultrapure additionnée de 7 mL d’acide
sulfurique 18 M. Après refroidissement, la solution est
filtrée et complétée à 250 mL avec de l’eau ultrapure. Elle
est stable pendant 6 mois conservée à + 4 °C. Dans une
première étape pour chaque échantillon 3 puits d’une
microplaque sont utilisés, chacun recevant 5, 10 et 40 μL
de minéralisat puis complétés à 100 μL avec le tampon PBS
0,01 M, pH 9,0. Ensuite sont ajoutés 60 μL d’acide
arsénieux puis, après agitation douce de la microplaque, 25 μL
du réactif cérique qui déclencheront le début de la cinétique.
L’absorbance de chaque puits est mesurée à 405 nm toutes les
5 minutes pendant 30 minutes à l’aide d’un lecteur
multicanaux (ν max, Molecular Devices, Saint-Grégoire, France). La
valeur d’absorbance 100 % correspond aux puits remplis de
100 μL de PBS à la place des standards ou des échantillons.
Tous les résultats présentés dans cette étude correspondent à la
moyenne obtenue à partir des 3 prises d’essai de minéralisat
des échantillons, sauf si cela est précisé dans le texte.
Dosage de l’iode moléculaire (I2)
I2 est titré par une solution de thiosulfate de sodium
0,01 M selon la réaction :
L’empois d’amidon (10 mg/L) produisant une coloration bleue
avec I2 est utilisé comme indicateur.
Résultats et discussion
Effet du temps sur la linéarité de la courbe d’étalonnage
Dans la plupart des méthodes utilisant la réaction de
Sandell-Kolthoff l’absorbance est mesurée après un temps
d’incubation de 20 minutes après l’ajout du réactif cérique
[7, 8, 13]. Cependant dans quelques études elle est également
mesurée après seulement 5 ou 10 minutes [10, 11, 14]. La
( figure 1 )
montre que le Log de l’absorbance est linéaire de 0 à
15 minutes pour des quantités en iodure allant jusqu’à
40 pmol/puits et après 15 minutes seulement pour des
quantités n’excédant pas 20 pmol/puits. Tenant compte de ces
données, tous les résultats présentés dans ce travail sont obtenus
après un temps d’incubation de 10 minutes.
Cinétique catalytique des différents composés iodés
En comparaison avec la courbe d’étalonnage obtenue à partir de
l’iodure, les cinétiques catalytiques des autres composés iodés
(iodate, MIT et DIT) ont été définies. La ( figure 2 ) montre que pour
des quantités de 0 à 40 pmol/puits la courbe des quatre
composés iodés est linéaire avec des coefficients de corrélation
(r2) supérieurs à 0,99. Les coefficients de variation
(CV) intra essai (répétabilité, 12 mesures) et inter essai
(reproductibilité, 12 séries) ont été déterminés à partir
d’une solution étalon d’iodure correspondant à une quantité de
20 pmol/puits. Ils sont respectivement de 2,8 % et de
8,4 %. La limite de détection, calculée comme 3 fois
l’écart-type obtenu sur les valeurs de l’étalon zéro est de
0,5 pmol/puits pour l’iodure et l’iodate, 1,0 pmol/puits
pour la DIT et 1,5 pmol/puits pour la MIT. Comme le montre la
( figure 2 ),
chaque composé iodé possède une activité catalytique spécifique
(K). Si la valeur du K de l’iodure est considérée égale à
100 %, celle de chaque composé iodé est rapportée dans le
tableau I( Tableau I )
et a été calculée selon l’équation :où Ci et
Co représentent respectivement les concentrations en
iodure et en composé iodé et n le nombre d’atomes d’iode dans la
molécule [14]. Les valeurs du K pour MIT et DIT pointent sur
l’importance majeure du procédé de minéralisation qui doit
transformer en iodure ces 2 principaux composés organiques
iodés présents dans les urines. De plus pour l’iodate, bien que le
K soit proche de 80 %, il se dissocie suffisamment de celui de
l’iodure pour ne pas être utilisé comme solution étalon en dépit
d’une meilleure conservation [9, 13].
Tableau I Activité catalytique des composés
iodés.
|
Composés iodés
|
K (%)
|
|
Iodure
|
100
|
|
Iodate
|
76,1 ± 4,7
|
|
MIT
|
67,1 ± 3,8
|
|
DIT
|
37,5 ± 5,6
|
Étude de l’efficacité des différents procédés de
minéralisation
Une solution étalon contenant le mélange KI (0,5 μM), MIT
(1 μM) et DIT (1 μM) a été minéralisée par le mélange
chlorate/acide perchlorique, le persulfate d’ammonium et le mélange
acide nitrique/acide chlorhydrique.
Dans une première étape, chaque minéralisat a été
chromatographié par CLHP avec mesure de la DO à 280 nm et
recueil de fractions de 400 μL selon les conditions décrites
dans le paragraphe Matériels et méthodes. En parallèle, la même
solution étalon n’ayant pas subi une minéralisation a été aussi
chromatographiée afin d’établir un profil témoin. La partie
supérieure de la ( figure 3 ) montre les
différents chromatogrammes obtenus. Pour le mélange étalon non
minéralisé (( figure
3a )) la détection à 280 nm permet d’identifier
2 pics correspondant à MIT (temps de
rétention = 18 minutes) et à DIT (temps de
rétention = 21 minutes). Dans le cas du mélange
étalon après minéralisation, la disparition des 2 pics
correspondant à MIT et DIT traduit l’efficacité du procédé à les
transformer en iodure. C’est le cas de la minéralisation par le
mélange acide nitrique/acide chlorhydrique (( figure 3b )) et par le
persulfate d’ammonium (( figure 3c )). Par contre
40 % environ de MIT et de DIT subsistent après traitement par
le mélange chlorate/acide perchlorique (( figure 3d )).
Dans une deuxième étape, le dosage des composés iodés a été
réalisé sur microplaque-96 puits en utilisant une aliquote de
chaque fraction recueillie à partir des différents éluats
chromatographiques. Les résultats, exprimés par l’inverse de la DO
à 405 nm, sont présentés dans la partie inférieure de la (
figure 3 ). En
comparaison avec le mélange étalon non minéralisé (( figure 3e )), le taux de
recouvrement est de l’ordre de 75 % aussi bien avec la méthode
utilisant le mélange acide nitrique/acide chlorhydrique (( figure 3f )) qu’avec
celle utilisant le persulfate d’ammonium (( figure 3g )). Dans le cas
de la minéralisation par le mélange chlorate/acide perchlorique ((
figure 3h )), le
dosage confirme d’une part la présence de MIT et DIT et, d’autre
part, ne montre pas d’augmentation significative de la
concentration en iodure ce qui pourrait être dû à l’oxydation de
l’iodure en iode moléculaire. Pour vérifier cette hypothèse
10 échantillons d’une solution de KI (10,8 μM) ont été
minéralisés par le mélange chlorate/acide perchlorique. Le dosage
de l’iodate après séparation par CLHP (temps de rétention de
4 et 5 minutes pour respectivement KI et KIO3)
ne met pas en évidence ce composé. Par contre le dosage de l’iode
moléculaire, réalisé par une méthode de titration, montre
qu’environ 40 % de l’iodure initial sont transformés en iode
libre (I2).
Étude des différents procédés de minéralisation sur
l’expression d’une coloration jaune
Deux cent cinquante échantillons d’urines des 24 heures de
patients hospitalisés au CHU de la Timone et adressés au
laboratoire ont été minéralisés par le persulfate d’ammonium et par
le mélange acide nitrique/acide chlorhydrique. Les minéralisats
d’urine (40 μL) obtenus par les 2 procédés ont été
déposés dans les puits d’une microplaque puis complétés à
100 μL par le tampon PBS. Tous les puits ont reçu ensuite
60 μL d’acide arsénieux et 25 μL de tampon PBS à la place
du réactif cérique. La microplaque a été incubée pendant
10 minutes à température ambiante puis l’absorbance a été
mesurée à 405 nm contre des puits ayant reçu les mêmes
réactifs à l’exception du minéralisat remplacé par du PBS. Dans le
cas de la minéralisation par le persulfate d’ammonium, environ
50 % des échantillons d’urine présentent une coloration jaune
dont la DO moyenne ± DS est de
0,192 ± 0,104 (valeurs extrêmes 0,044–0,315). Par
contre, pour la minéralisation avec le mélange acide nitrique/acide
chlorhydrique, seulement 8 % des échantillons sont colorés
avec une DO moyenne ± DS égale à
0,042 ± 0,021 (valeurs extrêmes 0,008–0,069). La
même étude réalisée en utilisant 5 μL de minéralisat d’urine
montre que pour le procédé au persulfate d’ammonium la DO
moyenne ± DS est de 0,011 ± 0,010 (valeurs
extrêmes 0,005–0,027) et pour le procédé au mélange acide
nitrique/acide chlorhydrique de
0,005 ± 0,004 (valeurs extrêmes 0,001–0,011). Si
l’on considère que la valeur de la DO moyenne à 405 nm de la
courbe d’étalonnage correspondant à 40 pmol/puits (soit
40 μL d’un minéralisat d’urine d’un patient ayant une iodurie
normale de 2 μmol/L) est d’environ 0,080, toute mesure de
l’iodurie est ininterprétable chez des patients dont la DO du
minéralisat avant le dosage est supérieure à cette valeur.
Conséquences de l’expression d’une coloration jaune du
minéralisat sur l’iodurie
Les minéralisats de 145 échantillons présentant une coloration
jaune (en absence du réactif cérique) et plus précisément ceux pour
lesquels une prise d’essai de 40 μL génère une DO à
405 nm supérieure à 0,050 ont été sélectionnés pour cette
étude. L’iode urinaire a été déterminé pour chaque minéralisat à
partir des prises d’essai de 40 et 5 μL. Les résultats se
révèlent significativement différents selon le procédé de
minéralisation et selon le volume déposé dans les puits
(tableau II( Tableau II )).
Dans le cas de la minéralisation par le persulfate d’ammonium,
l’iodurie déterminée à partir d’une prise d’essai de 40 μL
montre une valeur égale à environ la moitié de celle déterminée à
partir d’une prise d’essai de 5 μL. Ce résultat s’explique
facilement si l’on tient compte du raisonnement précédent sur
l’influence d’une DO élevée du minéralisat ayant pour conséquence
de masquer la décoloration du réactif cérique. La génération d’un
minéralisat coloré peut s’expliquer par l’action du persulfate
d’ammonium qui est un agent oxydant faisant intervenir les radicaux
libres oxygénés et plus particulièrement le radical hydroxyle [15]
très agressif vis-à-vis de nombreux substrats organiques [16, 17]
tels que les pigments urinaires ou des métabolites médicamenteux.
Par contre, dans le cas de la minéralisation par le mélange acide
nitrique/acide chlorhydrique, les résultats sont comparables car
l’absorbance du minéralisat est toujours faible (< 0,050),
quel que soit le volume utilisé. Ce procédé permet donc dans
certains cas, sans risque d’erreurs, d’améliorer la sensibilité du
dosage en augmentant le volume de la prise d’essai ce qui peut être
mis à profit pour la détermination de l’iode dans d’autres milieux
comme les tissus ou les aliments.
Tableau II Évaluation de l’iodurie dans les
minéralisats présentant une coloration jaune
(DO > 0,050).
|
Volume de la prise d’essai
|
Minéralisation par le sulfate d’ammonium
|
Minéralisation par le mélange HNO3/HCl
|
|
5 μL
|
1,91 ± 3,12
|
1,99 ± 2,85
|
|
40 μL
|
0,99 ± 2,89*
|
2,10 ± 2,76
|
*Test t = 3,34 ; P < 0,01.
Conclusion
L’iode dans les échantillons biologiques a été mesuré pendant
longtemps à l’aide de l’autoanalyseur Technicon® avec
minéralisation automatique des échantillons par l’acide
perchlorique ou le mélange chlorate/acide perchlorique. Cet
appareil n’étant plus de nos jours commercialement disponible, les
laboratoires désirant réaliser le dosage de l’iode doivent
développer leurs propres méthodes. L’étape préalable de
minéralisation des échantillons d’urines est cruciale. Parmi les
méthodes conventionnelles, celle utilisant le mélange
chlorate/acide perchlorique devrait être proscrite en raison de son
important manque de spécificité. La méthode au persulfate
d’ammonium est avantageuse du point de vue sécurité et facilité
d’emploi, mais une attention particulière doit être apportée au
volume de la prise d’essai qui peut être un facteur limitant la
sensibilité de l’analyse et l’exactitude du résultat. Par contre,
une nouvelle méthode faisant appel au mélange acide nitrique/acide
chlorhydrique a certes les inconvénients liés à l’utilisation des
acides concentrés (dégagement de vapeurs toxiques, nécessité d’une
hotte ventilée) mais est précise, fiable et possède une bonne
sensibilité.
Remerciements
Nous remercions S. Romano, L. Giraud et G. Feuillerat pour leur
excellente assistance technique. Cette étude a été financée en
partie par l’Association pour le développement des recherches
biologiques et médicales.
Références
1 Taurog A. Hormone synthesis : thyroid iodine
metabolism. In : Braverman LE, Utiger RD, editors.
Werner and Ingbar’s The Thyroid 7th edition.
Philadelphie : New York : Lippincott-Raven, 1996 :
47-81.
2 Dunn JT. Whats happening to our iodine. J Clin Endocrinol
Metab 1998 ; 83 : 3398-400.
3 Goumaz MO, Burger AG. Production, distribution et
catabolisme des hormones thyroïdiennes. In : Leclère J,
Orgiazzi J, Rousset B, Schlienger JL,
Wemeau JL, editors. La thyroïde. Paris : Expansion
Scientifique Française, 1992 : 104-10.
4 Meinhold H, Olbricht T, Schwartz-Porsche D.
Turnover and urinary excretion of circulating diiodotyrosine. J
Clin Endocrinol Metab 1987 ; 64 : 794-800.
5 Baloch Z, Carayon P, Conte-Devolx B,
et al. Laboratory medicine practice guidelines. Guidelines
committee, National academy of clinical biochemistry. Laboratory
support for the diagnosis and monitoring of thyroid disease.
Thyroid 2003 ; 13 : 75-9.
6 Sandell EB, Kolthoff IM. Microdetermination of
iodine by a catalytic method. Mikrochim Acta 1937 ; 1 :
9-25.
7 Pino S, Fang SL, Braverman LE. Ammonium
persulfate : a safe alternative oxidizing reagent for
measuring urinary iodide. Clin Chem 1996 ; 42 :
239-43.
8 Ohashi T, Yamaki M, Pandav CS,
Karmarkar MG, Irie M. Simple microplate method for
determination of urinary iodine. Clin Chem 2000 ; 46 :
529-36.
9 Dunn JT, Crutchfield HE, Gutekunst R,
Dunn AD. Two simple methods for measuring iodine in urine.
Thyroid 1993 ; 3 : 119-23.
10 O’Kennedy R, Bator JM, Reading C. A microassay
for the determination of iodide and its aplication to the
measurement of the iodination of proteins and the catalytic
activities of iodocompounds. Anal Biochem 1989 ; 179 :
138-44.
11 Baudry N, Mallet B, Lejeune PJ, Vinet L,
Franc JL. A micromethod for quantitative determination of
iodoamino acids in thyroglobulin. J Endocrinol 1997 ;
153 : 99-104.
12 Houzé P, Corvisier M, Toubert ME,
Gourmel B, Bousquet B. Dosage de l’iode sérique par
microméthode colorimétrique : mise au point analytique et
application clinique. Ann Biol Clin 2004 ; 62 :
222-8.
13 Rendl J, Bier D, Reiners C. Methods for
measuring iodine in urine and serum. Exp Clin Endocrinol Diabetes
1998 ; 106 : 34-41.
14 Thimoteou-Potamia M. Catalytic/kinetic potentiometric
determination of organic iodine-containing compounds. Anal Chem
1998 ; 206 : 375-8.
15 House DA. Kinetics and mechanisms of oxidation by
peroxidisulfate. Chem Rev 1962 ; 62 : 185-203.
16 Berlett BS, Stradtman ER. Protein oxidation in
aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem 1997 ;
272 : 20313-6.
17 Delom F, Lejeune PJ, Vinet L, Carayon P,
Mallet B. Involvement of oxidative reactions and extracellular
protein chaperones in the rescue of misassembled thyroglobulin in
the follicular lumen. Biochem Biophys Res Commun 1999 ;
255 : 438-43.
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