Identification moléculaire des mycobactéries et détection de la résistance aux antibiotiques

ARTICLE

Auteur(s) : V. Cattoir

Laboratoire de bactériologie-virologie, Faculté de médecine de Rennes Vincent.
Cattoir@chu-rennes.fr

Article reçu le 5 mars 2004, accepté le 27 avril 2004

Conséquence de leur multiplication très lente, les mycobactéries posent le réel problème du délai de rendu des résultats au clinicien. En effet, même si l’examen direct peut être contributif, la culture qui nécessite plusieurs semaines reste la méthode de référence dans le diagnostic de tuberculose et des mycobactérioses humaines. En parallèle, les techniques moléculaires permettent un gain de temps précieux dans la prise en charge de la maladie, notamment avec les méthodes d’amplification génique, applicables directement aux échantillons cliniques. À côté de ces techniques développées pour les espèces du complexe tuberculosis, les méthodes d’identification et de génotypage de la résistance à partir de cultures seront abordées dans cette revue en tenant compte des avantages et inconvénients de chacune, notamment en terme de rapidité, fiabilité, applicabilité et coût.

Généralités sur les mycobactéries

Une taxonomie en constante évolution

Le genre Mycobacterium est le seul représentant de la famille des Mycobacteriaceae de l’ordre des Actinomycetales. Il comprend des bactéries dont le génome a une teneur élevée en G et C (de 55 à 70 %) et dont la paroi contient des acides mycoliques, absents du règne bactérien à l’exception de quelques genres voisins (Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Dietzia et Gordonia). Depuis l’avènement des techniques d’identification moléculaire, le genre Mycobacterium a connu une très grande évolution [1] et comprend à ce jour 97 espèces différentes regroupées dans le tableau I.

Un groupe bactérien atypique

Les mycobactéries sont des bacilles aérobies stricts, immobiles, asporulés et acapsulés. La présence d’acides mycoliques pariétaux est responsable d’une propriété tinctoriale particulière : ce sont des bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR). Pour les colorer, il faut donc utiliser la technique de Ziehl-Neelsen ou la coloration à l’auramine. La croissance in vitro des mycobactéries est souvent très lente (de 1 à 8 semaines) et s’obtient classiquement sur des milieux spécifiques comme ceux de Löwenstein-Jensen et de Coletsos. Les milieux de culture liquides réduisent significativement le délai de croissance. Certains, développés depuis quelques années, ont l’avantage d’être utilisés dans des automates [2].

Tuberculose et mycobactérioses humaines

En bactériologie médicale, on distingue classiquement trois groupes de mycobactéries :
– les espèces du complexe tuberculosis, responsables de la tuberculose ;
– les mycobactéries atypiques ou non tuberculeuses, responsables des mycobactérioses humaines ;
– Mycobacterium leprae ou bacille de Hansen, agent de la lèpre, qui ne sera pas abordé ici.
La tuberculose est une infection due le plus souvent à M. tuberculosis, le bacille de Koch (BK), et plus rarement à Mycobacterium bovis (agent de la tuberculose des bovins) ou à Mycobacterium africanum. Dans le monde, la tuberculose est responsable de plus de 2 millions de décès par an et son incidence annuelle est de 8 à 9 millions de nouveaux cas. En 2001, 6 465 cas de tuberculose ont été déclarés en France avec un taux de mortalité d’environ 10 % [3]. En raison de la fréquence de l’atteinte respiratoire, on distingue la forme pulmonaire représentant 75 à 80 % des tuberculoses en France et les tuberculoses extra-pulmonaires comprenant notamment les formes miliaires, ganglionnaires, osseuses et la méningite tuberculeuse. À noter qu’il existe une quatrième espèce du complexe tuberculosis, responsable de la tuberculose des rongeurs et exceptionnellement décrite chez l’homme : Mycobacterium microti. Enfin, la souche de virulence atténuée BCG ou Bilié de Calmette et Guérin est à différencier de M. bovis.
Les mycobactérioses humaines sont les infections dues aux mycobactéries qui n’appartiennent ni au complexe tuberculosis, ni à l’espèce M. leprae. Ces bactéries sont pour la plupart environnementales et se comportent en pathogènes opportunistes. Elles infectent le plus souvent des patients fragilisés (immunodépression, traumatisme, intervention chirurgicale) ou présentant une pathologie respiratoire chronique (mucoviscidose, dilatation des bronches). Elles peuvent être à l’origine d’adénites, de pneumopathies, d’ostéo-arthrites ou d’infections cutanées ainsi que d’infections disséminées (tableau II) [2, 4].

Tableau II. Manifestations cliniques des principales mycobactérioses humaines [2, 4].

Diagnostic et traitements

Actuellement, le diagnostic microbiologique de la tuberculose et des mycobactérioses repose toujours sur l’examen direct et la culture mais connaît une évolution importante grâce au développement de nouvelles techniques moléculaires, directement applicables aux échantillons cliniques, notamment respiratoires [5]. En effet, différents kits commerciaux permettent ainsi une identification moléculaire des espèces du complexe tuberculosis. Leur principe repose sur l’amplification de l’ADN ou de l’ARN mycobactérien mais l’interprétation doit rester prudente du fait des limites actuelles de ces méthodes (extraction de l’ADN, présence d’inhibiteurs, risque de contamination) et doit toujours être faite avec les données clinico-radiologiques et biologiques (référentiel en microbiologie médicale 2004 : 145-8). Ces techniques permettent un diagnostic très rapide avec une bonne spécificité (allant de 96 % à 100 %) mais leur sensibilité est très variable : elle passe de 98-100 % à seulement 27-75 % selon que l’examen microscopique est positif ou négatif [6].
Le traitement de la tuberculose fait appel à quatre antibiotiques classiques : la rifampicine, l’isoniazide, le pyrazinamide et l’éthambutol. Cependant, certaines souches résistantes à un ou plusieurs antituberculeux, imposent le recours à des antibiotiques dits de seconde ligne, comme les fluoroquinolones ou les aminosides. La résistance est dite primaire si la souche est isolée chez un patient qui n’a jamais été traité ou traité moins de 4 semaines. Elle est dite secondaire ou acquise s’il y a eu traitement pendant plus de 4 semaines. Entre 1995 et 1999, en France, le taux de résistance primaire à l’un des antituberculeux majeurs était de 9 % (valeur médiane mondiale de 10 %) tandis que la prévalence de la résistance acquise était de 20 % (valeur médiane mondiale de 30 %). Enfin, les souches sont dites multirésistantes (MDR pour multi-drug resistant) lorsqu’elles sont au moins résistantes à la rifampicine et l’isoniazide. Un document intéressant sur la prise en charge de la tuberculose à bacilles résistants est accessible en ligne sur le site internet de l’OMS http ://whqlibdoc.who.int/hq/1997/WHO_TB_96.210_(Rev.1).pdf. À noter qu’en France, la fréquence de souches de BK MDR dans les nouveaux cas de tuberculose est faible, de l’ordre de 0,6 % (médiane mondiale, 1 %) et son évolution est stable depuis une décennie [7].

Identification des mycobactéries

Orientation phénotypique

Les caractères culturaux en milieu solide permettent d’orienter le choix des tests d’identification les plus appropriés. L’aspect macroscopique des colonies (morphologie et pigmentation) ainsi que le délai de culture peuvent être très évocateurs de certaines espèces. Ainsi, les colonies de M. tuberculosis apparaissent en 15 à 21 jours sur milieu de Löwenstein-Jensen, et sont élevées, épaisses, irrégulières, rugueuses, « en chou-fleur » (aspect eugonique) de couleur crème à beige chamois. Parmi les mycobactéries atypiques, on distingue les espèces scotochromogènes (pigmentées en l’absence de lumière), photochromogènes (pigmentées en présence de lumière), non chromogènes (non pigmentées) et les mycobactéries à croissance rapide (RGM pour rapid growth mycobacteria).
L’aspect microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen permet d’apprécier la forme, la coloration et le regroupement des bacilles. Par exemple, les bacilles de Koch sont bien colorés, petits, incurvés, en amas denses ou en « cordes » bien visibles en milieu liquide. Pour les autres espèces courantes, certains caractères microscopiques sont aussi très informatifs : les bacilles de M. xenopi sont longs et effilés, ceux de M. kansasii sont longs, larges et tigrés (« en échelle ») et ceux de M. avium sont courts et groupés en amas réguliers.
Selon ces caractères d’orientation, différents tests biochimiques peuvent être mis en œuvre pour obtenir un diagnostic [2]. Une autre approche phénotypique est représentée par l’analyse des acides mycoliques de la paroi par des techniques chromatographiques en phase gazeuse ou liquide. C’est un bon outil d’identification des mycobactéries, fournissant un résultat définitif en quelques heures. Cependant, l’équipement nécessaire est coûteux et la mise au point délicate [8].

Identification moléculaire

Les mycobactéries les plus courantes (notamment pour le BK) sont traditionnellement identifiées par des techniques phénotypiques. Cependant, l’identification moléculaire devient de plus en plus indispensable [9]. En effet, les tests biochimiques sont lents et leurs résultats sont souvent ambigus. De plus, la description de plus en plus fine des espèces et la fréquence d’isolement d’espèces environnementales imposent aux laboratoires des méthodes génétiques d’identification. Celles-ci peuvent être mises en œuvre à partir de cultures en milieu solide ou liquide et donnent des résultats rapides et fiables. Cependant, la notion de rapidité d’identification doit être nuancée par le fait que les analyses sont effectuées après culture et qu’elles sont souvent regroupées selon l’organisation du laboratoire (utilisation du séquenceur, par exemple). Tous ces diagnostics s’appuient sur une étape d’amplification génique. Actuellement, on dispose en France de trois kits commerciaux [6, 9] :
– Accuprobe^ND (Gen-Probe) est une technique TMA (transcription mediated amplification) qui repose sur l’amplification de l’ARN ribosomal 16S suivie d’une détection par chimiluminescence. Elle permet le diagnostic différentiel entre le complexe tuberculosis et les mycobactéries atypiques les plus fréquemment rencontrées en médecine (MAC, M. kansasii, M. gordonae). Spécifique et très rapide (environ 2 heures), elle permet de porter un diagnostic précoce d’infection à mycobactéries du complexe tuberculosis ;
– les techniques Inno LiPA^ND Mycobacteria (Innogenetics) et Genotype Mycobacteria^ND (Hain Diagnostika) reposent sur le principe de SSO (single strand oligonucleotide reverse). Des sondes spécifiques de chaque espèce sont immobilisées sur une bandelette et une réaction d’hybridation se fait après amplification de la région intergénique 16S-23S. Seize espèces ou groupes d’espèces sont actuellement identifiés : MCT, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. chelonae, M. fortuitum, M. malmoense, M. marinum/M. ulcerans, M. haemophilum, M. simiae, M. smegmatis, M. genavense, M. celatum. La sensibilité et la spécificité sont identiques à celles de la technique Accuprobe^ND. Si le nombre d’espèces identifiées est plus important, le temps de réalisation est plus long (6 heures) et son coût élevé.
À côté de ces techniques commercialisées, il existe des méthodes moléculaires d’amplification par PCR suivie d’une restriction enzymatique (PCR amplification restriction analysis) ou d’un séquençage [6, 9]. Elles consistent en l’amplification d’un gène cible (tableau III) puis l’analyse de l’amplicon par digestion et électrophorèse ou séquençage. Le séquençage du gène rrs, encodant l’ARN 16S, constitue une méthode universelle d’identification moléculaire des bactéries [10]. À noter que le séquençage des 500 premières bases du gène rrs suffit au diagnostic d’espèce car cette courte séquence génomique contient les deux régions hypervariables de l’ARN 16S [10]. Dans le genre Mycobacterium, il permet d’identifier la plupart des espèces mais ne permet pas de différencier certaines espèces comme celles du complexe tuberculosis ou M. kansasii et M. gastri (figure 1). Le séquençage du gène rpoB présente l’intérêt supplémentaire de distinguer M. kansasii de M. gastri [11]. D’autres régions génomiques peuvent être utilisées, comme la séquence rrs-rrl (espace intergénique 16S-23S) [12], le gène gyrB [13] ou le gène hsp65 d’une protéine du choc thermique de 65 kDa [14] (tableau III).

Tableau III. Liste des gènes cibles pour l’identification des mycobactéries par PCR-séquençage [10-14].

Gène	Taille du gène Position/Sensa	Produit du gène Taille de la protéineb		Avantages/inconvénientsc
rrs	1537 bp 1471846 → 1473382 (+)	ARN ribosomal 16S		Identification de toutes les espèces Pas de différenciation entre les espèces du CT, M. kansasii/M.gastri, M. ulcerans/M. marinum, M. chelonae/M. ulcerans Banques de données les plus fournies
rpoB	3516 bp 759807 → 763322 (+)	Sous-unité β de l’ARN polymérase 1172 AA		Identification de toutes les espèces Pas de différenciation entre les espèces du CT et M. ulcerans/M. marinum Mise en évidence simultanée des mutations responsables de résistance à la rifampicine Banques de données bien fournies
gyrB	2142 bp 5123 → 7264 (+)	Sous-unité GyrB de l’ADN gyrase 714 AA		Identification de la plupart des espèces Identification des espèces au sein du complexe tuberculosis Banques de données bien fournies
ITS 16S-23S		Région intergénique entre les gènes codant les ARNr 16S et 23S		Identification de toutes les espèces Mêmes limites qu’avec rrs (mais distinction entre M. kansasii/M.gastri) Banques de données assez bien fournies
groEL2	1620 bp 528608 → 530227 (+)	Protéine de choc thermique de 65 kDa 540 AA		Identification de toutes les espèces notamment les RGM Distinction entre M. abscessus/M. chelonae Banques de données bien fournies
sodA	621 bp 4320704 → 4321324 (+)	Superoxyde dismutase 207 AA		Identification de la plupart des espèces Banques de données assez bien fournies
recA	2370 bp 3049055 → 3051424 (–)	Recombinase A 790 AA		Identification de la plupart des espèces Absence de banques de données sur internet (banques personnelles uniquement)
rpoV (= sigA)	1584 bp 3017835 → 3019418 (+)	Facteur ς de l’ARN polymérase 528 AA
dnaJ (= dnaJ1)	1185 bp 422452 → 423636 (+)	Protéine chaperonne 395 AA
fbpA	1014 bp 4265645 → 4266658 (–)	Protéine de 32 kDa (= antigène 85A) 338 AA

La principale limite des techniques fondées sur l’analyse des séquences cibles rrs, rpoB, ITS 16S-23S ou hsp65 est l’absence de différenciation des espèces du complexe tuberculosis. Leurs séquences génomiques sont en effet identiques à 99,99 %. Seule la séquence du gène gyrB présente quatre sites de polymorphisme naturel permettant la différenciation des espèces tuberculeuses [13]. Pour détecter ces différences, deux techniques peuvent être utilisées : 1) l’amplification/hybridation sur bandelette, commercialisée sous le nom de Genotype MTBC^ND (Hain Diagnostika) ; 2) le séquençage de gyrB, moins coûteux mais qui nécessite l’accès à un séquenceur [13, 15]. À noter que la différenciation entre M. bovis et le BCG n’est pas possible par cette approche moléculaire.
La technique de PCR-séquençage est devenue la méthode la plus fiable pour l’identification des mycobactéries grâce aux banques de données de plus en plus riches en séquences bactériennes (par exemple RIDOM, http ://www.ridom-rdna.de/ et BIBI, http ://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/query.php) [16, 17]. Enfin, il est probable que les technologies récentes d’hybridation sur puces à ADN (microarrays technologies) seront dans un avenir proche appliquées au diagnostic des infections à mycobactéries et à la détection des principales résistances. Cependant, leur introduction en pratique courante est retardée par des coûts élevés et une mise au point délicate [18].

Détection de la résistance aux antibiotiques

La méthode de référence : l’antibiogramme

La méthode des proportions, réalisée en milieu solide ou liquide, est la technique de référence. Elle consiste à répartir des quantités égales d’inoculum bactérien sur des milieux contenant les antibiotiques à tester. Elle permet de déterminer au sein d’une population donnée le nombre de mutants résistants par rapport à un témoin sans antibiotique. Ce pourcentage de mutants résistants est à comparer à une « proportion critique » qui varie selon le milieu utilisé et la nature de l’antibiotique ; elle est généralement de 1 % (pour l’isoniazide, la rifampicine, l’éthambutol ou la streptomycine) mais elle est fixée à 10 % pour le pyrazinamide. Il existe aussi des techniques automatisées en milieu liquide (type Bactec 460TB et MGIT, Becton Dickinson) qui fournissent des résultats fiables plus rapidement (5 à 10 jours). Les antibiotiques couramment testés par ces méthodes phénotypiques sont l’isoniazide, la rifampicine, l’éthambutol, le pyrazinamide et la streptomycine [19].

La place du diagnostic moléculaire

L’antibiogramme classique permet de connaître la sensibilité ou la résistance d’une mycobactérie à chaque antibiotique, alors que l’approche moléculaire ne permet que la détection de résistances de support génétique connu. Néanmoins, la facilité et la rapidité d’obtention des résultats en font un outil actuel très intéressant.
Même s’il existe des résistances par efflux actif ou inactivation enzymatique, les résistances des mycobactéries vis-à-vis des antituberculeux sont principalement dues à des mutations chromosomiques dans les gènes qui encodent les cibles des antibiotiques ou les enzymes impliquées dans l’activation de ces médicaments (tableau IV) [20]. L’identification de mutations conférant la résistance aux antibiotiques permet d’envisager la mise au point de tests rapides prédictifs de la résistance des mycobactéries, notamment pour M. tuberculosis. Les tests de détection de la résistance à la rifampicine sont les plus pertinents. Il existe d’ailleurs une technique commercialisée, Inno LiPA^ND Rif TB (Innogenetics), qui repose sur le principe d’amplification/hybridation avec des sondes spécifiques de séquences génomiques sauvages ou mutées du gène rpoB. La sensibilité et la spécificité de cette technique sont proches de 100 % [21]. À côté de ce kit, la méthode de PCR-séquençage du gène rpoB est aisément applicable dans les laboratoires ayant accès au séquençage, avec les mêmes performances. À l’exception de la rifampicine, les techniques « d’antibiogramme moléculaire » sont peu utilisées pour les autres antituberculeux. Pourtant, la mise au point de méthodes de PCR-séquençage d’un nombre restreint de gènes permettrait de détecter les principales mutations responsables de résistance (tableau IV). La valeur prédictive positive de cette méthode génotypique est élevée. En effet, si une mutation majeure est retrouvée, la résistance phénotypique est très probable. Cependant, en absence de mutations, on ne peut affirmer, stricto sensu, la sensibilité (mutations non décrites, autres mécanismes de résistance type efflux). Par contre, cette technique est adaptable aux souches à croissance difficile (comme le sont souvent les BK MDR) et permet de tester la sensibilité aux fluoroquinolones et aux macrolides, ce qui est d’autant plus intéressant que les milieux commerciaux classiques contenant ces antibiotiques ne sont pas disponibles. Enfin, le délai diagnostique pourrait être encore raccourci grâce aux techniques nouvelles de PCR en temps réel par détection rapide et ciblée des principales mutations par exemple, au niveau des codons 516, 526 et 531 pour rpoB ou au niveau du codon 315 pour katG [32].

Tableau IV. Principaux gènes associés à la résistance aux antibiotiques chez les mycobactéries [19, 20, 22-31].

Catalase-peroxydase 740 AA	S315T/R ; D63E ; H108Q ; T262R ; T275P ; A350S ; G629S
inhA	810 pb	Enoyl-ACP réductase NADH dép. 269 AA	G(– 24)T ; C(– 15)T ; T(– 8)G/A (en amont de mabA) I16T ; I21V ; I47T ; S94A ; I95P (dans inhA)
ahpC	588 pb	Alkyl hydropexoyde réductase C 195 AA	C(– 81)T ; G(– 74)A ; C(– 54)T ; G(– 51)T ; G(– 48)T
kasA	1251 pb	β-cétoacyl-ACP synthase 416 AA	D66N ; R121K ; G269S ; G312S ; G387D ; F413L
ndh	1392 pb	NADH déshydrogénase 463 AA	T110A ; R268H
EMB	M. tuberculosis	embB	3297 pb		47-65	Arabinosyltransférase 1098 AA	M306I/V/L ; F285L ; D328Y ; F330V ; Y334H ; G406D/S/A/C ; Q497K/R ; T630I ; G745D ; M1000R
PZA	M. tuberculosis	pncA	561 pb		72-97	Pyrazinamidase (PZase) 186 AA	A(– 11)G ; Q10P ; D12A ; A46V ; T47A ; L85P ; V139A ; R140S Polymorphisme C(169)G spécifique de M. bovis
STR	M. tuberculosis, M. smegmatis	rpsL	375 pb		70	Protéine ribosomale S12 124 AA	K43R/T ; K88Q/R
		rrs	1537 pb		70	ARN 16S	C(491, 512, 513, 516, 798)T ; A(877, 904, 905, 906)C A(1400)G pour la R à la kanamycine et amikacine
FQ	M. tuberculosis, M. smegmatis	gyrA	2517 pb		75-94	Sous-unité A ADN gyrase 838 AA	A90V/P ; D94G/A/Y/H/N ; D89V ; S91P au niveau de la QRDR de gyrA (codons 74 à 113)
		gyrB	2145 pb			Sous-unité B ADN gyrase 714 AA	D495R/H au niveau de la QRDR de gyrB (codons 495 à 533)
Macrolides	MAC, M. chelonae, M. abscessus	rrl	3138 pb		95	ARN 23S (domaine V)	A(2058)C/G/T ; A(2059)C/G

^{a, b} Les tailles des gènes et des protéines sont ceux décrits pour la souche de M. tuberculosisH37Rv (http ://genolist.pasteur.fr/TubercuList/index.html) ; ^c Les mutations les plus fréquentes sont représentées en gras ; ^d Pourcentage de la résistance associé à une mutation dans le gène décrit.

Conclusion

L’approche moléculaire des infections à mycobactéries permet de diminuer considérablement le délai de diagnostic. En effet, ces nouvelles méthodes d’identification et de détection de la résistance fournissent des résultats fiables, pour une prise en charge des patients plus précoce. La détection moléculaire, directement à partir des prélèvements cliniques, n’est possible qu’avec les espèces du complexe tuberculosis (en se rapportant toujours à l’examen direct). Quant à l’identification moléculaire des mycobactéries après culture, elle tend à remplacer les nombreux tests nécessaires à l’identification phénotypique. Un algorithme d’identification « mixte » est pour l’instant la solution la plus astucieuse afin d’obtenir des résultats les plus rapides, précis et au meilleur coût. La détection génotypique de résistances ne remplace pas à ce jour l’antibiogramme et doit être interprétée avec prudence. En fait, elle est surtout intéressante pour la détection rapide de la résistance à la rifampicine même si, en France, la prévalence de ces souches est très faible. En revanche, l’utilisation de tests moléculaires pour les autres antituberculeux, reste une solution onéreuse du fait de la nécessité de réaliser simultanément un antibiogramme classique. Seule une connaissance exhaustive des mécanismes moléculaires des résistances permettrait éventuellement de s’affranchir de l’analyse phénotypique. Enfin, les puces à ADN et la PCR en temps réel sont les outils potentiels de demain qui seront utilisables directement à partir du prélèvement clinique et auront l’avantage d’être automatisables.

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ATB	Espèce(s)	Gène	Taille du gènea		Résistanced %	Produitb	Principales mutationsc
RIF	M. tuberculosis,  M. africanum, M. kansasii, M. bovis	rpoB	3519 pb		96	Sous-unité β ARN polymérase 1172 AA	S531L/W ; D516V/Y ; H526Y/D/R/L ; L533P ; G513L au niveau des 81 pb de la RRDR (codons 507 à 533)
INHa	M. tuberculosis	katG	2223 pb		90