Quantification des acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel

ARTICLE

Auteur(s) : C. Tse, J. Capeau

Hôpital Tenon, Laboratoire de biochimie et d’hormonologie, 4, rue de la Chine, 75020 Paris

Article reçu le 5 novembre 2002, accepté le 26 novembre 2002

Les premières approches de quantification de gènes par PCR ou de transcrits géniques par rétrotranscription PCR (RT-PCR) ont reposé sur une analyse de titration faisant appel à l’utilisation d’une solution titrée d’acide nucléique (ou standard externe) servant à l’élaboration d’une gamme d’étalonnage obtenue par dilutions en série du standard externe [2]. Le résultat de l’analyse donne une évaluation de la quantité relative de matrice cible par rapport au standard. Cependant, la précision des résultats obtenus est très souvent limitée, du fait de la grande variabilité d’efficacité d’une PCR à l’autre. L’introduction d’un standard interne coamplifié au cours de la même réaction PCR a permis de corriger en partie la variabilité tube à tube et a conduit au développement de deux méthodologies différentes de quantification : celles par PCR différentielle et celles par PCR compétitive.

Dans les approches de quantification par PCR (ou RT-PCR) différentielle [3], une séquence endogène, c’est-à-dire appartenant à un gène dit de référence présent dans l’échantillon testé (séquence endogène d’un gène présent à l’état d’une seule copie par génome haploïde ou transcrit d’un gène domestique dont la transcription est constante et indépendante de l’environnement extracellulaire), sert de standard interne. La séquence endogène standard est coamplifiée avec la séquence cible au cours d’une même réaction PCR utilisant deux couples d’amorces spécifiques. La méthode permet d’évaluer la quantité relative de gène cible par rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la quantité et la qualité d’acide nucléique extrait. Néanmoins, la quantification à l’aide d’un gène endogène comme standard interne nécessite des conditions d’application extrêmement normalisées afin de s’assurer que l’amplification des deux séquences différentes (gène cible et gène de référence) s’effectue avec des efficacités identiques.

Les approches de quantification par PCR (ou par RT-PCR) compétitive utilisent une séquence exogène comme standard interne [4]. Ce type d’approche repose sur une coamplification compétitive de la séquence cible avec des quantités connues de standard interne et en présence du même couple d’amorces. Le standard interne (ou compétiteur) est une séquence exogène d’ADN ou d’ARN synthétique que l’on construit de façon à être la plus proche possible de la séquence cible à quantifier, qui doit partager les mêmes sites d’amorçage que la séquence cible, qui doit être amplifié avec une efficacité d’amplification équivalente à celle de la séquence cible et dont le produit d’amplification doit cependant pouvoir en être différencié [5]. La quantification s’effectue par comparaison du signal PCR correspondant au gène cible avec ceux qui sont obtenus pour chaque concentration du gène compétiteur. Cependant, le choix du compétiteur et la validation des efficacités d’amplification sont difficiles à établir et relativement laborieux. L’autre limite des techniques de PCR compétitive est la nécessité de coamplifier par échantillon, au moins 4 ou 5 dilutions du standard interne pour couvrir le domaine des concentrations attendues en gène cible.

Le nombre élevé de stratégies de quantification proposées dans la littérature reflète bien la difficulté à obtenir des résultats fiables et reproductibles. L’introduction d’une molécule reporter fluorescente dans le milieu réactionnel de PCR et la détection des produits de PCR par une méthode fluorimétrique a conduit au développement récent des techniques de PCR quantitative en temps réel [6]. Ces dernières reposent, non plus sur une détection en point final des produits de PCR formés, mais sur une analyse de la cinétique de la réaction PCR au moyen d’un système capable de détecter « en tube fermé » les produits de PCR formés après chaque cycle d’amplification.

Principe de la PCR quantitative en temps réel

Les bases mathématiques de la réaction PCR : rappels

Nature exponentielle de la réaction PCR

La PCR est par définition une réaction en chaîne au cours de laquelle les produits issus d’un cycle d’amplification servent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui s’établit par la répétition des cycles de dénaturation-hybridation-élongation aboutit à une accumulation exponentielle théorique de 2ⁿ fois par molécule d’ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d’amplification suivant la relation mathématique suivante :

N = N₀ . 2ⁿ

(où : N est le nombre de molécules amplifiées au final, N₀ le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d’amplification).

Efficacité d’amplification

Au niveau expérimental, la quantité de produit formé dépend d’un facteur primordial qui est l’efficacité d’amplification (E) définie comme étant la proportion moyenne des molécules d’ADN cible se dupliquant à chaque cycle d’amplification. L’efficacité d’amplification est comprise entre 0 (aucune amplification ne s’est produite) et 1 (après chaque cycle PCR, chaque molécule d’ADN cible a généré deux amplicons). Dans les conditions expérimentales habituelles, E est inférieure à 1 et varie entre 0,78 et 0,97 selon le gène amplifié [7]. L’introduction de ce facteur essentiel, qu’est l’efficacité d’amplification, dans le calcul du nombre de molécules amplifiées après n cycles d’amplification conduit à l’équation suivante :

N = N₀ . (1 + E)ⁿ

Convertie sous forme logarithmique, cette équation a pour expression :

Log N = Log N₀ + n . Log (1 + E)

La représentation graphique des variations du logarithme du nombre N de molécules amplifiées (Log N) en fonction du nombre de cycles d’amplification (n) est une droite dont la pente est Log (1 + E) et l’ordonnée à l’origine le nombre initial de molécules (N₀). Il est alors possible de calculer E :

E = 10^– 1/pente

puis d’en déduire le nombre initial de molécules N₀. De nombreux facteurs expérimentaux (concentrations en désoxy nucléoside triphosphate (dNTP), en MgCl₂ et en ADN polymérase, température, structure secondaire et contenu en bases G/C de la séquence cible, longueur du fragment à amplifier, présence d’inhibiteurs de l’ADN polymérase ou de la transcriptase inverse) peuvent affecter l’efficacité d’amplification.

Phase plateau de la réaction PCR

L’accumulation exponentielle de la quantité de produits au cours de la réaction PCR n’est, en réalité, observée que pendant les 20 à 35 premiers cycles. Au cours des derniers cycles d’amplification, l’accumulation se ralentit et la quantité de produits formés tend vers une limite. C’est l’effet plateau (ou saturation). La phase plateau reflète une baisse de l’efficacité d’amplification qui résulte en partie de l’inactivation thermique partielle de l’ADN polymérase au cours des derniers cycles et du fait que les produits nécessaires à l’amplification (notamment dNTP et amorces) deviennent limitants. D’autres phénomènes sont également impliqués : réhybridation préférentielle de la cible avec elle-même plutôt qu’avec les amorces, activation de l’activité 5’-3’ exonucléase de l’ADN polymérase et probablement accumulation de pyrophosphates résultant de la dénaturation thermique des dNTP et inhibiteurs de l’activité polymérase [8].

Le cycle seuil

Le principe de la PCR quantitative en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable d’émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR. L’intensité de la fluorescence émise par la molécule reporter augmente à chaque cycle PCR. Par ce suivi, il est alors possible de tracer une courbe, de caractériser les différentes phases de la cinétique PCR et de mesurer la quantité de produit d’amplification généré en un point de la phase exponentielle (figure 1). C’est uniquement au cours de cette phase qu’il sera possible d’extrapoler la quantité de matrice cible initialement présente avant amplification. Au cours des premiers cycles d’amplification, l’intensité de la fluorescence émise est très faible et va permettre de définir la ligne de base de la courbe. Après un certain nombre de cycles, l’accumulation des produits de PCR entraîne une variation mesurable de l’intensité de la fluorescence émise. Le point de départ de la phase exponentielle, phase au cours de laquelle l’efficacité d’amplification est supposée rester constante, est appelé cycle seuil optique (figure 1). Plus précisément, le cycle seuil optique est le nombre fractionnaire de cycles pour lequel l’intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur seuil (ou seuil de détection optique) significativement différente du bruit de fond. Selon l’algorithme utilisé pour son calcul, il est symbolisé par les lettres Ct (threshold cycle) ou Cp (crossing point). Le cycle seuil est un point remarquable de la cinétique d’amplification car il se trouve inversement proportionnel au logarithme du nombre N₀ de molécules d’acide nucléique cible initialement présentes avant amplification par PCR [9].

Les systèmes de détection en temps réel

Les agents intercalants

Les systèmes permettant la détection des molécules d’amplicon générées après chaque cycle d’amplification font appel soit à un agent intercalant se fixant directement sur l’ADN double brin, soit à une sonde fluorogénique allant s’hybrider de manière spécifique sur le fragment cible amplifié. Le système de détection le plus simple repose sur l’inclusion d’un agent intercalant, le SYBR^TM Green I [10, 11] qui se lie préférentiellement à l’ADN double brin nouvellement synthétisé. À chaque étape d’hybridation et d’élongation d’un cycle PCR, le SYBR^TM Green I s’intercale entre les bases nucléotidiques de l’ADN double brin et peut émettre un signal de fluorescence lorsqu’excité par des rayonnements ultraviolets. La mesure de l’intensité du signal émis à la fin de chaque étape d’élongation permet le suivi cycle par cycle de la réaction PCR.
Le système est simple, très sensible mais de spécificité essentiellement conditionnée par le choix des amorces. Le SYBR^TM Green I marque toutes les molécules d’ADN double brin, qu’elles soient spécifiques ou non de la séquence d’intérêt. De ce fait, tous les produits de PCR non spécifiques ainsi que les dimères d’amorces éventuellement formés vont également engendrer un signal de fluorescence. Ce défaut de spécificité constitue la limite majeure des systèmes de détection utilisant un agent intercalant. L’autre limite du système est liée au fait que l’intensité générée est proportionnelle à la masse d’ADN double brin produite et par conséquent à la taille des amplicons. Ce qui n’est pas le cas des systèmes utilisant une sonde fluorogénique pour lesquels la production d’un signal de fluorescence est indépendante de la longueur du produit amplifié et spécifique de l’amplicon détecté.
Néanmoins, le système de détection utilisant le SYBR^TM Green I est un système très simple qui permet de tester la spécificité d’une réaction PCR par l’établissement d’une courbe de fusion post-PCR puis par la détermination de la température de fusion (Tm : melting temperature) des produits amplifiés [12].

Les sondes fluorogéniques

Principe de base : quenching par FRET

Une sonde fluorogénique est un fragment d’ADN monobrin, non extensible par l’ADN polymérase, spécifique du fragment cible amplifié et portant un ou deux groupements fluorophores. Un groupement fluorophore est une molécule capable d’absorber de l’énergie lumineuse et ainsi de passer à un état excité, puis de restituer cette énergie sous forme d’une émission fluorescente en retournant à son état initial. À chaque cycle d’amplification PCR, l’hybridation spécifique d’une molécule de sonde fluorogénique sur chaque molécule d’amplicon générée, couplée à une mesure de l’intensité de la fluorescence émise par le groupement fluorophore excité, vont permettre le suivi en direct de la réaction d’amplification. Cependant, l’émission de fluorescence mesurée ne doit se produire que lorsque la sonde s’est hybridée sur sa cible spécifique. D’où l’introduction d’un second fluorophore allant plus ou moins complètement absorber l’énergie émise par le fluorophore excité et réduire voire empêcher l’émission de fluorescence lorsque la sonde se trouve libre dans le milieu réactionnel. Afin d’obtenir un signal intense avec un très faible bruit de fond, le système permettant la détection des produits d’amplification exploite le processus de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET : fluorescence resonance energy transfer) entre une molécule électroniquement excitée (le fluorophore donneur) et une molécule voisine (le fluorophore accepteur ou quencher) [13, 14]. Suite à ce transfert d’énergie, le fluorophore donneur excité retourne à son état initial et l’énergie transférée au quencher est, soit absorbée par ce dernier, soit dissipée dans l’environnement sous forme de chaleur. Ce processus de capture et de transfert d’énergie lumineuse est appelé quenching. Le fluorophore quencher est la molécule qui réalise le quenching de fluorescence. Deux conditions sont essentielles pour obtenir un quenching efficace par FRET : un chevauchement spectral compatible du couple donneur/accepteur et un rayon dit de Förster (distance optimale entre donneur et accepteur) compris entre 40 et 100 angströms.
Selon la nature du quencher participant au processus FRET, plusieurs systèmes de détection ont été élaborés. À l’heure actuelle, les stratégies de détection les plus employées sont celles utilisant comme sonde fluorogénique, les sondes TaqMan^TM ou sondes d’hydrolyse [15], les sondes FRET en tandem ou sondes LightCycler^TM [16] et les sondes Beacon^TM [17]. D’autres systèmes comme le système Scorpion^TM [18], le système Amplifluor^TM [19] et le système des sondes peptidiques light-up ou sondes peptide nucleic acids (PNA) [20] ont été récemment développés.

Les sondes d’hydrolyse ou sondes Taqman^TM

La sonde TaqMan^TM (figure 2) est un fragment oligonucléotidique marqué par deux groupements fluorophores en ses extrémités 5’ et 3’ [15]. L’extrémité 5’ porte le fluorophore donneur qui est un dérivé de la fluorescéine (FAM, TET, JOE, HEX ou VIC^TM). À l’extrémité 3’, se trouve le fluorophore quencher qui est habituellement un dérivé de la rhodamine (TAMRA). Du fait de la proximité des deux groupements fluorophores, liée à la petite taille de la sonde (25 à 30 nucléotides, soit moins de 55 angströms entre les deux fluorophores), l’énergie absorbée par le fluorophore donneur excité est transférée par FRET au fluorophore accepteur. Le spectre d’excitation du TAMRA ne chevauchant pas le spectre d’émission du fluorophore donneur, le quencher absorbe l’énergie qui lui est transmise mais n’émet aucune fluorescence (figure 2A). La particularité du système TaqMan^TM est d’exploiter l’activité 5’-3’ nucléase de l’ADN polymérase qui permet d’hydrolyser la sonde hybridée à sa cible spécifique lors de l’étape d’élongation des amorces [21]. Le clivage de la sonde au cours de cette étape a pour conséquence d’éloigner les deux fluorophores, de libérer le fluorophore donneur de l’effet quenching exercé par le TAMRA et ainsi de rétablir son émission de fluorescence (figure 2B). L’intensité de la fluorescence émise par le fluorophore donneur, couramment dénommé fluorophore reporter dans une sonde TaqMan^TM, est mesurée en fin de chaque cycle d’amplification.
De par son mode de fonctionnement, le système TaqMan^TM utilise des conditions d’amplification particulières en deux étapes, une étape de dénaturation à 94 °C et une seconde étape combinant hybridation et élongation réalisées à une température identique (aux alentours de 60 °C). La sonde ne pouvant être clivée que lorsqu’hybridée à son brin complémentaire, la température d’extension des amorces doit être compatible avec la température d’hybridation de la sonde. La Tm d’une sonde TaqMan^TM doit donc être élevée et voisine de 70 °C, ce qui impose une conception rigoureuse des amorces mais facilite l’application d’un profil de thermocyclage standard. Par ailleurs, le système TaqMan^TM impose l’utilisation d’une ADN polymérase obligatoirement dotée d’une activité 5’-3’ exonucléase dont l’efficacité conditionnera la qualité et l’intensité du signal émis [22]. Le clivage de la sonde étant irréversible, le système TaqMan^TM ne permet pas l’établissement d’une courbe de fusion post-PCR.
Le développement d’un nouveau type de sondes TaqMan^TM, les sondes TaqMan^TM – MGB [23], a permis de pallier certaines limites du système TaqMan^TM. L’introduction à l’extrémité 3’ d’une molécule ayant une affinité pour le petit sillon de l’ADN ou noyau MGB (minor groove binder) augmente la Tm de la sonde et stabilise plus fortement son interaction avec la matrice ADN, ce qui permet de dessiner des sondes de plus petite taille (13 à 20 nucléotides) et capables de s’hybrider avec une matrice riche en dinucléotides GC ou AT. Par ailleurs, dans une sonde TaqMan^TM – MGB, le fluorophore reporter est associé à un quencher non fluorescent ; ce qui rend possible la détection de deux cibles différentes (ou biplexing) au cours d’une même réaction PCR. Ces modifications chimiques apportées aux sondes TaqMan^TM ont également permis d’étendre les applications de cette chimie au génotypage par discrimination allélique.

Les sondes FRET en tandem (sondes LightCycler^TM)

Le système utilise un couple de sondes d’hybridation très courtes [16] portant chacune un fluorophore (figure 3). La particularité de ce système réside dans le fait que le processus de transfert d’énergie par FRET s’effectue entre deux fluorophores séparés par moins de cinq nucléotides, le fluorophore donneur ayant un spectre d’émission se chevauchant avec le spectre d’excitation du fluorophore accepteur (figure 3A). Le transfert d’énergie est alors direct et hautement efficace : une fois les deux sondes appariées à leur séquence cible tout en restant adjacentes l’une envers l’autre, l’énergie libérée par le fluorophore donneur de haute énergie est directement captée par le fluorophore accepteur de moindre énergie qui ainsi excité émet à son tour un signal fluorescent mesurable (figure 3B).
À la différence du signal fluorescent émis par une sonde TaqMan^TM, celui émis à l’aide d’un couple de sondes FRET en tandem est directement lié à l’hybridation des sondes sur une cible qui leur est spécifique. Cela confère une certaine flexibilité dans le choix des sondes, ces dernières devant avoir des Tm identiques à 2 °C près et supérieurs au Tm des amorces de 5 à 10 °C. De plus, les sondes ne subissant pas d’hydrolyse, l’émission de fluorescence est réversible et la production d’une courbe de fusion réalisable après PCR. Le système des sondes FRET en tandem est simple mais cependant limité par le choix du couple de fluorophores. Le transfert d’énergie par FRET n’est efficace que lorsque la fluorescéine est associée à l’un des fluorophores très particuliers que sont les rouges LightCycler^TM, LC Red 640 et LC Red 705, ce qui limite à deux cibles maximum la capacité du système à quantifier simultanément plusieurs cibles.

Les sondes Beacon^TM (ou sondes d’hybridation phare)

Une sonde Beacon^TM [17] est une sonde d’hybridation en épingle à cheveux qui porte à son extrémité 5’ un groupement fluorophore reporter et à celle 3’ un groupement fluorophore non fluorescent quencher (figure 4). Elle possède une structure particulière de type tige boucle dans laquelle les bras de la tige résultent de l’appariement de ses extrémités complémentaires ; la boucle est spécifique et complémentaire de la séquence cible à détecter. Dans ce type de sonde, la proximité des deux groupements fluorophores est imposée par la structure secondaire en épingle à cheveux de la sonde, ainsi dénommée sonde phare. En présence de la séquence cible complémentaire, la sonde s’apparie de façon spontanée à cette cible et subit un changement de conformation au cours duquel le quencher s’éloigne du reporter alors capable d’émettre une fluorescence mesurable (figure 4A).
À la différence des systèmes TaqMan^TM, le groupement quencher porté par l’extrémité 3’ est une molécule non fluorescente appartenant à la famille des quenchers non fluorescents (dark quenchers) qui sont le DABCYL (ou rouge de méthyle) et les fluorophores BHQ^TM (black hole quenchers^TM). Ces quenchers non fluorescents captent l’énergie transmise par le fluorophore donneur excité puis la restituent, non pas sous forme d’une émission lumineuse, mais sous forme de chaleur. Parce que possédant un très large spectre d’absorption couvrant plus ou moins complètement le spectre d’émission des fluorophores reporter qui leur sont associés (figure 4B), les quenchers non fluorescents ont une plus grande efficacité de quenching. Le bruit de fond de fluorescence est alors considérablement réduit, d’où une sensibilité largement supérieure à celle des systèmes utilisant un quencher fluorescent. Le DABCYL et les quenchers BHQ^TM constituent le groupement quencher universel des sondes Beacon^TM auquel peuvent être couplés la quasi-totalité des fluorophores employés en détection de fluorescence (FAM, TET, HEX, JOE/VIC^TM, TAMRA, CY5, CY3, Rouge Texas...). Cette possibilité de coupler autant de fluorophores reporter fait du système Beacon^TM l’outil de choix adapté à la détection simultanée de plus de deux cibles (multiplexing) au cours d’une même réaction PCR. Il est à souligner l’utilisation récente du DABCYL à la place du TAMRA dans les sondes TaqMan^TM [24].
En cas de mésappariement touchant un seul nucléotide, l’hybridation d’une sonde Beacon^TM n’a pas lieu, la formation d’une structure repliée en épingle à cheveux se trouvant thermodynamiquement favorisée. La spécificité de détection du système est telle qu’elle permet de détecter des différences d’une seule base, ce qui est difficilement réalisable avec les systèmes TaqMan^TM et LightCycler^TM.
L’inconvénient majeur du système Beacon^TM est la difficulté de conception des sondes. Un dessin optimal de la structure en boucle est crucial [25] car un repliement de la sonde qui n’amènerait pas le reporter à proximité immédiate du quencher entraînerait un bruit de fond important. Inversement une structure en boucle trop forte empêcherait le dépliement de la sonde lors de son hybridation à la cible. Pour chaque sonde Beacon^TM dessinée, un profil de dénaturation thermique doit préalablement être établi pour définir les caractéristiques de fusion de la sonde.

Les stratégies de quantification

La concentration en acide nucléique cible peut être mesurée, soit de façon « absolue » après établissement d’une courbe d’étalonnage à partir d’un standard homologue externe, soit de façon relative après normalisation par rapport à un gène de référence (gène endogène validé) ou un calibrant (échantillon servant de référence). Les stratégies de quantification « absolue » expriment la concentration en cible d’intérêt en tant que valeur absolue, c’est-à-dire en nombre de copies par μL ou en unités de concentration (par exemple en moles d’acide nucléique par μL) ; celles de quantification relative mesurent la concentration en cible d’intérêt, relativement par rapport à la référence choisie, c’est-à-dire au moyen d’un rapport cible/référence.

Quantification « absolue » par étalonnage avec un standard

Le principe

La détermination d’une quantité absolue d’acides nucléiques repose sur l’établissement d’une gamme d’étalonnage à partir de plusieurs dilutions sérielles d’un standard externe homologue titré en nombre de copies de gène ou de transcrit cible. Pour chacune des dilutions effectuées, la cinétique de la réaction PCR est suivie en temps réel afin de déterminer le cycle seuil correspondant. La droite d’étalonnage exprimant les variations du Ct en fonction de la quantité d’acide nucléique cible contenu dans chaque point de gamme est ensuite tracée. Après validation de la droite obtenue par le calcul de l’efficacité d’amplification (E doit être voisine de 1) et du coefficient de régression linéaire r qui permet de vérifier la reproductibilité du pipettage (r² ≥ 0,99), il est alors possible d’en extrapoler le Ct et par conséquent d’en déduire la quantité d’acide nucléique cible initialement présente.

Le standard

Le standard servant à l’établissement de la courbe d’étalonnage doit présenter une efficacité d’amplification similaire à celle des échantillons (la différence d’efficacité maximale tolérée étant de 5 %) et une séquence amplifiable homologue à celle de la cible (même longueur d’amplicon et même contenu en nucléotides G et C) afin que l’amplification PCR soit réalisée avec le même couple d’amorces et la même sonde d’hybridation que celle du gène cible. Les standards externes habituellement employés sont constitués par une solution titrée de plasmides contenant la séquence d’intérêt ou de produits de PCR contenant les séquences du couple d’amorces utilisées pour l’amplification PCR du fragment d’intérêt. Pour la quantification d’ARN messagers et afin de contrôler l’efficacité de l’étape de transcription inverse, le standard préconisé pour la quantification des ARN messagers est une solution titrée, soit d’ARN recombinant, soit d’ARNc synthétique, identique à l’ARN cible natif et généré par transcription in vitro. Les stratégies de quantification utilisant un standard externe sont souvent qualifiées de quantification « absolue ». Cependant, l’exactitude de ce type de quantification est totalement dépendante de l’exactitude du titre des standards employés. La difficulté majeure d’une quantification « absolue » est la préparation d’un standard dont le nombre absolu de copies ou la concentration en cible d’intérêt est exactement connu, reproductible et stable durant un temps bien défini. Il se pose alors le problème de déterminer avec exactitude le nombre absolu de copies de gène cible par μL du standard utilisé. Cette concentration est en général mesurée par un dosage spectrophotométrique UV qui ne donne en fait qu’une valeur approximative et très souvent surestimée de la quantité de gène cible amplifiable. Seules la méthode des dilutions limites et l’application d’une méthode d’analyse statistique reposant sur la distribution de Poisson [26] permettraient de déterminer le nombre absolu moyen de copies du standard préparé.
Étant donné la difficulté et l’extrême lourdeur de préparation d’un standard exactement titré en acide nucléique, les stratégies de quantification « absolue » sont le plus souvent réservées à des applications bien particulières telles que la quantification dans les liquides biologiques de virus responsables de pathologies telles que le sida et les hépatites B ou C [27]. Les applications principales de la PCR quantitative sont représentées par la comparaison entre différents types cellulaires du niveau d’expression d’un gène [28]. Pour de telles applications, la connaissance exacte du nombre de molécules d’acide nucléique ne s’avère pas indispensable, d’où le développement des stratégies de quantification relative.

Quantification relative

Le principe

Les méthodes de quantification relative permettent d’analyser la quantité de cible relativement à un gène de référence allant normaliser les différences liées à la qualité et la quantité des acides nucléiques extraits et détecter la présence d’éventuels inhibiteurs de la PCR. Le gène de référence doit satisfaire aux critères suivants : 1) être un gène endogène existant à l’état d’une seule copie et d’expression constante ; 2) être amplifié par PCR avec une efficacité similaire à celle du gène cible, quelle que soit la nature de l’échantillon étudié. Les gènes de référence les plus utilisés sont les gènes des sous-unités 18S et 28S des ARN ribosomaux, des gènes de strucure tels que ceux de la β-actine ou de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), les gènes de l’albumine, de la cyclophyline et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HRPT). Il est toutefois nécessaire de valider la stabilité d’expresion du gène choisi comme référence en vérifiant au préalable que les niveaux d’expression de ce gène sont équivalents dans différentes conditions expérimentales [29, 30]. Le résultat obtenu pour le gène cible est divisé par celui obtenu pour le gène de référence. Le rapport cible/référence ainsi calculé pour chaque échantillon inconnu est dans un second temps rapporté à celui d’un calibrant. Le calibrant est une solution d’acide nucléique servant de référence et contenant les gènes cible et référence appropriés. Le résultat final est exprimé par un indice et non pas, contrairement aux méthodes de quantification absolue, par une valeur absolue.

Quantification relative avec standard externe

Cette méthode est en fait une variante de la méthode par étalonnage qui utilise pour calibrant un standard externe allant être dilué en série. Deux courbes d’étalonnage sont parallèlement construites, l’une pour le gène cible et l’autre pour le gène de référence endogène. Les quantités de gène cible et de gène de référence contenues dans l’échantillon étudié sont ensuite extrapolées à partir des courbes établies puis divisées entre elles pour obtenir une valeur normalisée de la quantité de gène cible. Le fait de normaliser la quantité de gène cible par rapport à celle du gène de référence ne nécessite pas l’utilisation d’un standard externe titré de façon absolue.

Méthode comparative des Ct

C’est une méthode de quantification relative qui permet de calculer à partir d’une formule mathématique le nombre de molécules de gène ou de messager contenues dans un tissu donné. Elle consiste, après coamplification du gène cible avec un gène endogène de référence à comparer les Ct calculés à partir du tissu analysé et du calibrant. Le calibrant est ici une solution d’acide nucléique obtenue à partir de tissu sain ou de leucocytes notamment. Le nombre de molécules de gène ou de transcrit initialement présents dans le tissu analysé, normalisé par rapport au gène de référence et relatif au calibrant est alors donné par la relation mathématique 2^– ΔΔCt dans laquelle : ΔΔCt = ΔCt (tissu analysé) – ΔCt (calibrant) avec ΔCt = Ct (gène cible) – Ct (gène endogène). Comme toute méthode de quantification, la méthode de calcul du ΔΔCt repose également sur l’hypothèse que les échantillons et le calibrant ont des efficacités d’amplification égales. Néanmoins, pour un gène donné, il existe des différences d’efficacité d’amplification d’un échantillon à un autre, susceptibles de générer des erreurs de calcul plus ou moins importantes. Cette variabilité est probablement liée à différents facteurs (qualité des acides nucléiques extraits, présence de composés inhibiteurs de la PCR et différence d’efficacité du processus FRET selon les matrices) et se trouve à l’origine du manque d’exactitude et de reproductibilité des résultats obtenus par les méthodes de quantification relative. D’où le développement de nouveaux modèles mathématiques de calcul permettant de corriger les différences d’efficacité d’amplification entre les échantillons et ainsi d’obtenir des résultats exacts et reproductibles [31, 32].

Exploitation des courbes cinétiques

Quelle que soit la stratégie de quantification employée, « absolue » ou relative, les courbes cinétiques générées au cours d’une même série de réactions PCR sont significativement comparables : 1) après normalisation des fluctuations auxquelles sont soumises les mesures de fluorescence réalisées ; 2) après définition d’un seuil de fluorescence commun à toutes les courbes cinétiques.

Normalisation des mesures de fluorescence et ligne de base

Elle s’effectue à deux niveaux : 1) normalisation des différences de mesures de fluorescence qui se produisent de cycle à cycle ; 2) normalisation des différences de mesures de tube à tube. Les variations dans le temps du signal mesuré pour un échantillon donné sont le plus souvent causées par une dérive de la lampe émettrice ou par une dégradation des fluorophores au cours de la réaction PCR. Les variations tube à tube sont principalement liées à des erreurs de pipettage, mais aussi à la non-uniformité de l’illumination des échantillons et à la différence de transmissibilité de la lumière au travers des capuchons optiques fermant les tubes PCR. Afin de corriger cette variabilité des mesures de fluorescence, source de bruit de fond, l’intensité de fluorescence émise par le reporter est rapportée, soit à celle émise par une référence passive (la référence passive étant un fluorophore présent dans le milieu réactionnel mais inerte à la réaction PCR comme le fluorophore ROX^TM ou le Texas-Red-X^TM), soit à la fluorescence basale mesurée dans chaque tube avant le démarrage de la réaction d’amplification (normalisation dynamique tube par tube). Dans le cas du système des sondes FRET en tandem, l’intensité du signal de fluorescence émis par le fluorophore donneur (F1) est supposée rester relativement constante au cours de l’amplification et sert de contrôle interne pour normaliser l’émission de fluorescence par le fluorophore accepteur (F2). Les valeurs mesurées relatives aux variations du signal de fluorescence émis d’un cycle à un autre sont ainsi exprimées en unités relatives de fluorescence (RFU : relative fluorescence units).
Le fait de normaliser les mesures et de les exprimer en valeur relative plutôt qu’absolue permet de définir une ligne de base (ou bruit de fond) commune à toutes les cinétiques générées. La ligne de base permet de caractériser et de corriger toute dérive de fluorescence au cours de la réaction d’amplification. Dans le cas d’une dérive de la ligne de base, cette dernière peut être calculée comme étant la moyenne des intensités de fluorescence émise au cours des premiers cycles (par défaut entre 3 et 18 cycles) ou auto-ajustée au moyen d’un algorithme de calcul (droite des moindres carrés).

Définition d’un seuil de fluorescence

La quantité de matrice initiale contenue dans un échantillon n’est extrapolable qu’au cours de la phase exponentielle de la cinétique d’amplification. La comparaison entre toutes les cinétiques PCR produites n’est significative qu’après établissement d’un seuil de fluorescence (ou ligne seuil) commun à toutes les phases exponentielles. Le seuil de fluorescence correspond à une intensité de fluorescence significativement plus grande que la fluorescence de bruit de fond. Il est calculé comme étant une fonction du bruit de fond. La ligne seuil peut aussi être établie par l’utilisateur lui-même qui la définira comme étant une droite parallèle à l’axe des abcisses et coupant toutes les cinétiques en un point de leur phase exponentielle.

Détermination du cycle seuil

Selon le logiciel d’analyse équipant un appareil de PCR quantitative en temps réel, plusieurs méthodologies ont été développées pour déterminer le cycle seuil à partir de la courbe cinétique RFU = f(n), n étant le nombre de cycles d’amplification [33]. Le cycle seuil est le nombre fractionnaire de cycles pour lequel l’intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur statistiquement significative du bruit de fond. Dans la méthode dite « du seuil » (threshold method), il peut être défini comme étant le nombre de cycles correspondant au point d’intersection de la courbe avec la ligne seuil établie. Dans la méthode dite « des points ajustés » (fit points method), la courbe cinétique est convertie en fonction semi-logarithmique. Après exclusion des points non informatifs (ligne de base et phase plateau), une droite de régression est établie à partir des points restants qui sont ceux de la phase exponentielle linéarisée. La valeur du cycle seuil correspondant à une cinétique donnée est alors définie comme étant le point d’intersection de la droite de régression avec la ligne seuil. Le cycle seuil correspondant aussi au point de départ de la phase exponentielle de la cinétique d’amplification par PCR, le calcul de la valeur maximale de la dérivée seconde de la courbe RFU = f(n) est une autre méthode de calcul du cycle seuil.

Les systèmes de PCR quantitative en temps réel

Une instrumentation sophistiquée a été développée pour capitaliser ces nouvelles approches de PCR quantitative. Les appareils actuellement commercialisés peuvent être classés en deux catégories. Les systèmes haut débit qui permettent le suivi simultané d’au moins 96 réactions PCR sont les systèmes ABI Prism^TM 7000, 7700 et 7900 (Applied Biosystems), l’iCycler^TM (Bio-Rad), le MX-4000^TM (Stratagene) et le DNA Engine Opticon^TM (MJ Research). Les systèmes LightCycler^TM (Roche Diagnostics), Smart Cycler^TM (Eurogentec) et Rotor-Gene^TM (Corbett Research) sont des systèmes à moindre débit mais de plus grande flexibilité. Tous les systèmes proposés (tableau I) combinent un thermocycleur et un module de détection fluorimétrique pilotés par une station de travail allant permettre l’acquisition et le traitement des données obtenues.

Tableau I. Les systèmes de PCR quantitative en temps réel

Le thermocycleur

Tous les systèmes haut débit précédemment cités (à l’exception de l’ABI Prism^TM 7700 qui fonctionne avec un thermocycleur combinant une résistance électrique comme système de chauffage et un groupe froid comme système de refroidissement) utilisent un thermocycleur 96 puits muni d’un module thermoélectrique à effet Peltier et d’un couvercle chauffant contribuant à limiter la formation de gradients de température au sein des tubes tout en rendant inutile l’adjonction d’huile minérale. Afin de compenser les incohérences de température liées à un effet de gradient de température entre le centre et les bords du bloc thermique (ou « effet bord »), ce dernier peut être équipé de bords chauffants (cas de l’ABI Prism^TM 7000) ou d’un couvercle chauffant à gradient de température (cas du MX-4000^TM). Par ailleurs, l’association d’un effet Joule à l’effet Peltier a permis d’obtenir une meilleure homogénéité de la température au sein du bloc thermique, d’atteindre des variations thermiques plus rapides que celles obtenues par simple effet Peltier (vitesses de chauffage et de refroidissement de l’ordre de 2 à 3 °C par seconde au lieu d’1 °C par seconde) et ainsi de raccourcir la durée des cycles de température (soit 40 cycles réalisés en environ 90 minutes au lieu de 120 minutes). Le développement de blocs spéciaux permettant d’effectuer les PCR directement au sein des puits de microplaques permet l’automatisation des étapes pré-PCR et post-PCR au moyen de stations de pipettage. D’où l’évolution probable dans un proche avenir, du format 96 puits vers des microplaques 384 puits voire 768 puits.
Le LightCycler^TM et le Rotor-Gene^TM ont un thermocycleur à air pulsé. L’air ambiant insufflé dans une enceinte hermétique est chauffé au moyen d’une résistance électrique puis homogénéisé par un ventilateur (cas du LightCycler^TM) ou par la force centrifuge d’un rotor animé d’une certaine vitesse (cas du Rotor-Gene^TM). L’air chaud est ensuite refroidi par une nouvelle insufflation d’air ambiant. Comparé aux thermocycleurs à effet Peltier, les thermocycleurs à air pulsé assurent une répartition plus homogène de la température d’un échantillon à un autre, l’homogénéité de la température étant un critère très important allant conditionner la précision et la reproductibilité des mesures effectuées. Le LightCycler^TM présente la particularité d’utiliser un carroussel piloté par un moteur pas-à-pas qui porte 32 capillaires en verre dans lesquels vont se dérouler les réactions PCR. Les capillaires étant en verre, de faible section et totalement immergés dans l’enceinte thermorégulée, les transferts thermiques sont extrêmement rapides et les vitesses de montée et descente en température également rapides, pouvant atteindre jusqu’à 20 °C par seconde. Les cycles sont très courts et la durée d’amplification peut être réduite à 30 minutes pour 40 cycles. Dans le Rotor-Gene^TM, l’action combinée de la force centrifuge exercée par le rotor (36 ou 72 puits) en mouvement (500 tours/minute pour les montées en température et 1 000 tours/minute pour les descentes) et de l’air pulsé sur la résistance électrique permet de maintenir une uniformité de température largement supérieure à celle obtenue dans les autres thermocycleurs (± 0,01 °C entre les puits).
Le Smart Cycler^TM est un système constitué de 16 modules iCore^TM (intelligent cooling heating optical reaction) comprenant chacun un thermocycleur miniaturisé, un microspectrofluorimètre et un système micro-informatique d’analyse de données. Le thermocycleur est équipé d’un ventilateur et de plaques chauffantes en céramique hautement conductrices de chaleur et munies de capteurs thermiques. Le système permet d’obtenir des variations thermiques très rapides, de l’ordre de 10 °C par seconde pour les montées en température et de 2,5 °C par seconde pour les descentes. Chaque module iCore^TM étant indépendamment programmable, il est possible de réaliser simultanément 16 réactions PCR différentes. Six blocs de 16 modules peuvent être montés en parallèle et permettre la réalisation de 96 PCR.
À la différence des systèmes ABI Prism^TM, LightCycler^TM, MX 4000^TM, Smart Cycler^TM et Rotor-Gene^TM qui incluent dans un même ensemble le thermocycleur et le module de détection fluorimétrique (systèmes compacts), l’iCycler^TM et le DNA Engine Opticon^TM sont des systèmes modulaires comprenant un thermocycleur auquel peut être adapté un bloc optique optionnel pour la PCR quantitative en temps réel.

Le module de détection fluorimétrique

Il est composé d’une source lumineuse d’excitation et d’un système de détection allant capter les signaux de fluorescence émise.
Les sources lumineuses d’excitation employées sont de trois types : source laser-argon, lampe électronique LED (light emitting diode) et lampe halogène à filament de tungstène. Les systèmes ABI Prism^TM 7700 et 7900 utilisent une source laser-argon qui émet un faisceau lumineux à spectre étroit allant être transmis dans tous les puits par l’intermédiaire de fibres optiques. L’émission de fluorescence est ensuite dirigée via les fibres optiques vers le système de détection. L’utilisation de fibres optiques confère au système une sensibilité maximale. Les lampes électroniques (systèmes LightCycler^TM, Smart Cycler^TM, Rotor-Gene^TM et DNA Engine Opticon^TM) produisent un faisceau lumineux très intense mais correspondant à un domaine encore plus étroit de longueurs d’onde physiquement sélectionnées au moyen d’un filtre à bande passante étroite. La lumière émise est ensuite filtrée puis déviée sur le système de détection par l’intermédiaire d’un autre jeu de filtres passe-bandes. Les sources laser et les LED produisent un faisceau lumineux très intense mais correspondant à un domaine très étroit de longueurs d’onde, ce qui limite le choix des fluorophores utilisables. Elles sont préconisées pour les fluorophores qui possèdent une longueur d’onde d’excitation proche de la longueur d’onde centrale de leur domaine spectral et apporteront dans ce cas une très grande sensibilité et brillance spectrale. Elles sont en revanche moins efficaces pour les fluorophores dont la longueur d’onde d’excitation s’éloigne de la longueur d’onde maximale et totalement inefficaces pour les fluorophores dont la longueur d’onde d’excitation n’appartient pas à leur domaine spectral. De par l’étendue de leur domaine spectral, les lampes halogènes (ABI Prism^TM 7000, MX-4000^TM et iCycler^TM) offrent la possibilité d’un très grand choix de fluorophores dont les longueurs d’onde d’excitation sont sélectionnées à l’aide de filtres optiques optimisés pour éviter un chevauchement des spectres d’excitation. Elles produisent une luminosité moins intense que les lampes laser ou électroniques et sont donc moins sensibles, mais le bruit de fond est beaucoup plus faible. Le module optique de l’iCycler^TM dispose d’une technologie exclusive d’amplification qui permet l’obtention d’un signal lumineux intensifié suffisant pour illuminer instantanément les 96 puits du bloc thermique.
Les signaux de fluorescence émis sont ensuite détectés par l’intermédiaire d’une caméra CCD (charge coupled device), d’une barrette de photodiodes ou d’un ou plusieurs tubes photomultiplicateurs (PMT) indépendants. Le refroidissement d’une caméra CCD réduit de façon très significative le bruit de fond électronique et améliore considérablement la sensibilité de détection et la linéarité de réponse du système. Les tubes photomultiplicateurs sont auto-ajustables en fonction de la longueur d’onde émise. Ils détectent les signaux de fluorescence émis avec une très grande sensibilité et un faible bruit de fond. Comparés aux caméras CCD et aux photodiodes, ils auraient un pouvoir discriminateur supérieur et seraient particulièrement adaptés à la détection simultanée des signaux émis par plusieurs fluorophores (réactions multiplexes). La capacité d’un système de PCR quantitative en temps réel à réaliser du multiplexing est en effet liée, non seulement au choix de la chimie et des fluorophores portés par les sondes fluorogéniques mais aussi aux performances du système de détection optique (filtres optiques et détection simultanée des signaux de fluorescence émis par plusieurs fluorophores) et à la capacité du logiciel à effectuer, selon un algorithme matriciel, l’analyse différentielle de tous les fluorophores présents dans le milieu réactionnel (ou analyse en multicomposant).

La station de travail informatique

Tous les systèmes, à l’exception de l’ABI Prism^TM 7700, permettent d’acquérir en temps réel et d’afficher « en ligne » les données mesurées, et par conséquent de suivre en direct la cinétique d’amplification. La vitesse d’acquisition des données est variable d’un système à l’autre et dépend du mode de détection des signaux de fluorescence émis : simultané ou séquentiel (lorsqu’un seul signal de fluorescence est détecté), position par position ou simultanément sur toutes les positions. Les logiciels d’analyse assurent le pilotage du thermocyclage, l’acquisition et l’analyse des données brutes de fluorescence ainsi que l’exploitation de ces données pour obtenir le résultat final selon l’application choisie (quantification absolue ou relative, courbe de fusion). Ils offrent également la possibilité d’importation et d’exportation des données brutes ou analysées sous format tabulaire (type Excel^TM) et peuvent être complétés par un logiciel de dessin des amorces et sondes.
Les systèmes décrits apparaissent tous comme des systèmes intéressants, équivalents en termes de sensibilité et de reproductibilité. La possibilité d’adapter plusieurs chimies de détection, de quantifier plusieurs cibles simultanément, de disposer d’un logiciel d’analyse des résultats performant et souple, d’utiliser des consommables standard et de bénéficier de bonnes prestations de service (formation et service après-vente) apparaissent comme étant les principaux critères de choix à considérer lors de l’achat d’un système de PCR quantitative en temps réel. Le coût de l’appareil lui-même et des réactifs associés (sondes, mélanges PCR...) est bien sûr important.

Les applications de la PCR quantitative en temps réel

La technologie de PCR en temps réel a grandement amélioré et simplifié la quantification des acides nucléiques. Elle est aujourd’hui devenue un outil inestimable pour de nombreux scientifiques. En biologie médicale, les applications sont déjà très nombreuses et couvrent des domaines très diversifiés dont les plus importants se situent en microbiologie clinique, en oncologie et dans l’étude de l’expression des gènes. Des applications très importantes ont également été développées en microbiologie alimentaire et en agroalimentaire.

Microbiologie clinique

La détection et la quantification d’agents pathogènes bactériens (mycobactéries, légionelles, mycoplasmes, Bordetella pertussis, Chlamydia...) et fongiques (champignons du genre Candida, Aspergillus, Cryptococcus...) par PCR en temps réel a fait l’objet de plusieurs centaines de publications scientifiques, cet intérêt s’expliquant par la durée du diagnostic traditionnel qui s’exprime en jours voire en semaines et par la grande sensibilité de cette technique par rapport aux méthodes conventionnelles. La PCR quantitative en temps réel s’est également révélée d’un grand intérêt pour la titration de virus (virus VIH1 et VIH2 du sida, virus VHB et VHC des hépatites B et C...) dans les phases précoces de la maladie, mais aussi dans le suivi des sujets infectés et en particulier le suivi des traitements antiviraux. C’est dans ce domaine que la connaissance du nombre « absolu » de particules virales est utile. Des trousses de quantification « absolue » dédiées à la quantification d’une charge virale et utilisant des standards internationaux OMS (Organisation mondiale de la santé) calibrés ont été récemment commercialisées [27].
Les applications de la PCR en microbiologie clinique présentent cependant des limitations importantes à considérer : 1) la plupart des agents infectieux sont caractérisés par une grande variabilité génétique susceptible d’affecter de façon significative l’estimation de la charge en agents pathogènes, d’où la nécessité de développer des essais spécifiques de sous-classes ; 2) le risque de résultats faussement positifs par contamination mais aussi de résultats faussement négatifs liés à la présence d’inhibiteurs de PCR dans le liquide biologique considéré impose l’utilisation d’un contrôle interne positif qui sera analysé en parallèle pour chaque échantillon.

Oncologie clinique

Les applications sont très nombreuses, les principales étant : 1) la quantification des transcrits de fusion, comme BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique, avant ou après autogreffe ou pour évaluer la réponse au traitement [34] ; 2) la quantification des transcrits de fusion TEL-AML1 spécifiques de la leucémie aige lymphoblastique pour prédire une rechute ou évaluer la maladie résiduelle minimale [34] ; 3) la quantification d’oncogènes comme le gène HER-2/neu, l’amplification génique étant un critère de sélection pour une indication de thérapie ciblée par l’Herceptin^® (anticorps monoclonaux anti-HER-2/neu) chez les patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique [35].

Expression génique

Les techniques de quantification relative par RT-PCR en temps réel sont largement utilisées pour : 1) estimer le niveau d’expression de gènes d’intérêt comme les gènes de cytokines par exemple [36] ; 2) analyser l’expression des variants d’épissage génique ; 3) et plus récemment valider les profils d’expression obtenus à l’aide des puces à ADN [37].

Conclusion

La technologie de PCR en temps réel est aujourd’hui l’outil de choix qui a permis de simplifier et de quantifier le nombre de molécules ou de copies d’un gène ou d’un messager d’intérêt dans un échantillon donné.
Ses performances peuvent se résumer en quatre mots : spécificité, sensibililité, bonne reproductibilité et linéarité sur une gamme dynamique comprise entre 10 et 10⁸ copies. Enfin, il faut ajouter à ses nombreuses qualités, la rapidité de la technique sans nécessité d’une étape post-PCR. La méthode est automatisable, et par conséquent parfaitement adaptée à une analyse de routine. Par ailleurs, la réaction s’effectuant en tube fermé, le risque de contamination est faible.
La technologie de PCR en temps réel représente un progrès important et prend un essor considérable dans le domaine de la biologie médicale. Les applications sont très vastes et ne se limitent pas qu’à la quantification des acides nucléiques. La détection de mutations ponctuelles et de polymorphismes ainsi que la recherche de délétions géniques à l’état hétérozygote sont les autres grandes applications de la PCR en temps réel.

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