Antimutagenic effects of natural compounds evidenced by micronucleus test

ARTICLE

Parmi tous les facteurs impliqués dans la transformation tumorale des cellules, les radicaux libres produits de façon physiologique ou par des xénobiotiques sont le plus souvent mis en cause. Ces composés exercent leur action toxique en causant des lésions à l'ADN, par activation de procarcinogène ou par altération des systèmes antioxydants de défense cellulaire. La prévention de la cancérogenèse chimique nécessite la connaissance des facteurs environnementaux génotoxiques. En ce qui concerne le cancer, de nombreux facteurs carcinogènes ont été identifiés, qu'ils soient physiques (radiations ionisantes), chimiques (dérivés du benzène, goudrons, amiante,...), viraux ou même toxiques (toxine d'Aspergillus flavus). En dehors de ces types particuliers de carcinogènes, la constatation de grandes variations d'incidences de certains cancers entre les différentes régions du globe a fait rechercher des facteurs moins évidents pouvant expliquer ces disparités [1]. L'alimentation est le domaine où l'organisme entre en étroit contact avec son environnement. Dans la masse des nutriments, les vitamines représentent une faible proportion pondérale, mais leur importance physiologique est attestée par les différentes affections liées à leur carence. Les vitamines sont des acteurs non seulement impliqués dans le fonctionnement du métabolisme cellulaire, mais aussi dans les processus cellulaires complexes tels que la prolifération et la différenciation. Dès lors, il est séduisant de penser qu'elles pourraient jouer un rôle protecteur vis-à-vis de l'agression radicalaire.

Certaines molécules susceptibles de libérer des radicaux libres inducteurs de lésions chromosomiques [2] sont bien étudiées. Il s'agit de générateurs de radicaux libres oxydants, tels que le peroxyde de benzoyle, les perbenzoates d'alkyle, les peroxydicarbonates de dialkyle. Les molécules composées de 3 à 4 atomes de carbone, notamment le peroxydicarbonate de diisopropyle, le 2,2'-azobis (2-amidinopropane) et leurs éventuels sels, tels que les chlorhydrates, sont les plus utilisées en toxicologie expérimentale. Le 2,2'-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH) a été choisi dans cette étude comme initiateur radicalaire hydrosoluble, en accord avec les travaux de Niki et al. [3]. Une étude précédente [4] a mis en évidence la production de micronoyaux dans les lymphocytes T cultivés en sang total et incubés en présence de ce générateur. L'objectif de ce travail est la mise en évidence des effets antimutagènes (anticlastogènes, antianeugènes) de substances naturelles antioxydantes telles que l'acide ascorbique, le beta-carotène et la 5-hydroxyquinoline connues pour leurs propriétés antiradicalaires.

Le test des micronoyaux a été proposé par Countryman et Heddle [5] pour détecter les dommages génétiques chimio- ou radio-induits. Ce test est basé sur la numération d'entités nucléaires, les micronoyaux, présents dans le cytoplasme des cellules en interphase et dont le diamètre est inférieur au tiers du diamètre du noyau principal [6]. Les micronoyaux sont constitués de fragments de chromosomes ou de chromosomes entiers qui, lorsqu'ils ne sont pas inclus dans les noyaux interphasiques, forment un noyau distinct. Ces entités chromosomiques sont des fragments acentriques ou des chromosomes entiers non rattachés au fuseau mitotique par le centromère et perdus au cours de la mitose. Les mécanismes d'apparition des micronoyaux peuvent être regroupés en effet clastogène d'une part et effet aneugène d'autre part. La clastogenèse est associée à la production de fragments acentriques, l'aneugenèse est associée à la perte de chromosomes, le plus souvent par altération de l'appareil mitotique.

Matériel et méthode

Les échantillons de sang ont été collectés dans des tubes en plastique héparinés et conservés pendant moins de 24 heures à température ambiante et à l'abri de la lumière. Ces échantillons provenaient de volontaires sains adultes, indemnes de toute maladie, non fumeurs et non exposés à des substances génotoxiques connues.

Chaque échantillon est mis en culture selon la procédure classiquement utilisée [7] lors de ce type d'étude : 0,7 ml de sang hépariné, 0,1 ml de phytohémagglutinine (Biochem-Seromed), 0,1 ml de pénicilline-streptomycine 10³ U/ml (ATGC), et 2,5 ml de sérum de veau fœtal (Biochem-Seromed) sont additionnés à 6,5 ml de milieu 199 (Institut Pasteur). Ces cultures sont réalisées dans des flascs de 50 cm² de type Nunc^® et incubées à 37 °C sous une atmosphère enrichie à 5 % de CO₂.

À la 24^e heure, le 2,2'-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride a été incorporé selon une dose prédéterminée de 43,2 µg.ml^{- 1}, en accord avec l'étude antérieure [4], ainsi que trois doses croissantes d'acide ascorbique, de beta-carotène ou de 5-hydroxyquinoline. La cytochalasine B, à la concentration de 5 µg.ml^{- 1}, est additionnée à la 44^e heure. En fin d'incubation, les cellules sont centrifugées, soumises à un choc hypotonique doux (KCl 0,075 M durant 3 mn) et fixées (acide acétique-méthanol 3-1). Les cellules fixées sont étalées par projection de gouttes sur des lames de microscope préalablement dégraissées et humides. Les lames sont ensuite séchées à l'air ambiant pendant 24 heures, puis colorées pendant 12 min au Giemsa.

La lecture est effectuée au microscope optique (X 500) par le même opérateur et seuls les lymphocytes binucléés sont observés pour la détection des micronoyaux. Les critères de reconnaissance des micronoyaux sont strictement définis : entités nucléaires indépendantes des noyaux principaux et de même coloration que les noyaux principaux, la taille doit être comprise entre le seizième et le tiers du plus petit des deux noyaux principaux [6]. Pour chaque lame, 1 000 lymphocytes binucléés sont examinés et, parmi ceux-ci, les cellules portant au moins un micronoyau sont comptabilisées. Les résultats sont ainsi exprimés en nombre de lymphocytes micronucléés pour 1 000 lymphocytes binucléés observés.

L'interprétation des résultats fait appel à la détermination d'un indice R_MN validé lors d'une étude précédente [7] (réduction du taux de micronoyaux par l'antimutagène) calculé suivant la formule :

On considère que la substance testée a des propriétés fortement antimutagènes si R_MN < 0,75, faiblement antimutagènes si R_MN est compris entre 0,75 et 0,85 et non mutagènes si R_MN > 0,85.

L'étude du taux de variation des micronoyaux a été effectuée par une analyse de variance (Anova) qui permet de comparer entre elles plusieurs moyennes. Cette étude statistique a été menée grâce à l'utilisation du logiciel de traitement des données Stat View^® student.

Résultats

Pour chaque substance naturelle testée, deux séries de cultures ont été réalisées, comprenant un témoin négatif, le composé antiradicalaire seul, le générateur de radicaux libres à la concentration de 43,2 µg.ml^{- 1} seul, l'association générateur-antiradicalaire à trois concentrations différentes en antiradicalaire pour une même concentration en générateur (43,2 µg.ml^{- 1}). Enfin, un témoin positif a été réalisé par addition d'un mutagène standard, la doxorubicine à la concentration de 0,003 µg.ml^{- 1}.

Les résultats concernant l'acide ascorbique utilisé aux concentrations de 25, 50, 75 µM sont regroupés dans la première partie du tableau 1. Ils permettent de mettre en évidence une variation significative entre le taux de cellules micronucléées obtenu après incubation avec le générateur de radicaux libres seul et en association avec l'acide ascorbique (analyse de variance p < 0,005). Dès la première dose d'acide ascorbique, on obtient un indice de réduction du taux de micronoyaux inférieur à 0,75.

La 5-hydroxyquinoline, utilisée à la concentration 25, 50, 75 µM, a été additionnée aux cultures cellulaires à la 24^e heure, en même temps que le générateur de radicaux libres (deuxième partie du tableau 1). L'analyse de variance met en évidence une différence statistiquement significative entre les taux de cellules micronucléées obtenues d'une part après incubation des cellules en présence du générateur de radicaux libres seul et d'autre part exposition des cellules au générateur de radicaux libres associé à la 5-hydroxyquinoline, quelle que soit la concentration utilisée (p < 0,005). Cette étude permet de mettre en évidence des propriétés fortement antimutagènes de la 5-hydroxyquinoline dès la première dose avec un indice de réduction du taux des micronoyaux toujours inférieur à 0,5.

Le beta-carotène, utilisé à la concentration 27, 54, 81 µl/ml, a été rajouté dans les cultures cellulaires à la 24^e heure, en même temps que le générateur de radicaux libres (troisième partie du tableau 1). L'analyse de variance met en évidence une différence statistiquement significative entre le taux de cellules micronucléées obtenu après incubation au générateur de radicaux libres seul et après association au beta-carotène (p < 0,005). Comme pour les autres substances, l'indice de réduction du taux de micronoyaux est toujours inférieur à 0,5.

Discussion

Les résultats obtenus par la présente étude confirment le rôle antimutagène des trois composés étudiés. Ces propriétés avaient été envisagées dès 1984 par Burton et Ingold, ainsi que Krinsky en 1989 et De Flora et al. en 1990 [8-10]. Dans des études plus récentes, il a été démontré que l'acide ascorbique et le beta-carotène étaient capables de réduire le pouvoir clastogène de la bléomycine aussi bien chez l'animal que chez l'homme [11, 12].

L'intérêt de cette étude est en fait d'apporter des précisions concernant le mécanisme d'action de ces trois substances. En effet, ces composés sont capables de faire diminuer le taux de cellules micronucléées lorsqu'ils sont incorporés de façon simultanée avec l'agent mutagène, ne laissant pas le temps à ces antimutagènes d'être métabolisés ou de pénétrer à l'intérieur des cellules. En se référant à la classification de Bronzetti et al. [13], ces trois composés appartiennent à la classe des desmutagènes dont le mécanisme d'action est extracellulaire, exerçant une action directe sur les agents mutagènes avant que ces derniers n'atteignent leurs cellules cibles, c'est-à-dire avant que des dommages ne se soient produits à l'ADN. En effet, le terme antimutagène, utilisé au sens large, désigne toute substance ayant pour effet de réduire ou d'annuler le taux de mutations spontanées et/ou induites, sans tenir compte du mécanisme mis en jeu par la substance antimutagène. Le terme d'antimutagène a donc évolué et permet de distinguer, selon Bronzetti et al. [13], les desmutagènes qui exercent leur action directement sur les agents mutagènes avant que ces derniers n'atteignent leur cible cellulaire, et les bio-antimutagènes qui exercent leur action par des mécanismes intracellulaires en s'opposant à la fixation de mutations produites par un mutagène. De plus, étant donné l'originalité du mutagène utilisé, un générateur de radicaux libres, les trois composés étudiés ont présenté, in vitro, des propriétés antiradicalaires. Les radicaux libres formés dans le milieu de culture paraissent avoir été inactivés par ces substances naturelles. Toutefois, la vérification de ces hypothèses nécessite l'application du test de numération des micronoyaux à une population plus étendue de sujets. De même, la conception d'un nouveau protocole, en cours de réalisation, qui prendra en compte le moment de l'introduction de l'agent antimutagène (prétraitement, traitement simultané, post-traitement) pourra préciser le mécanisme d'action [7].

Enfin, cette étude a montré l'applicabilité du test des micronoyaux dans un protocole d'étude des antimutagènes. En effet, il permet la mise en évidence de mutations chromosomiques dans des délais satisfaisants, avec des conditions de mise en œuvre aisées et à un coût relativement peu élevé. Cependant, ce test ne permet pas de connaître le mécanisme intime de l'action génotoxique. Pour cela, il sera souhaitable d'associer au test des micronoyaux un protocole d'hybridation in situ fluorescente, permettant de détecter la présence ou l'absence de centromères dans les micronoyaux. Ainsi la distinction entre les effets clastogènes et aneugènes permettra de déterminer plus précisément le mécanisme d'action des toxiques [14].

Remerciements. Les auteurs remercient la Fondation Philippe Daher (Fondation de France) pour son aide généreuse et Mme Jocelyne Pompili pour sa précieuse collaboration.

REFERENCES

1. Vilkas M. Les vitamines, mécanismes d'action chimique. Herman : Paris, 1994.

2. Kasuyuki H, Hitoshi J, Ken-Ichi S, Kiyomi K. DNA breaking activity of the carbon-centered radical generated from 2,2'-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH) Free Radic. Res Commun 1993 ; 19 : 323-32.

3. Niki E, Kawakami A, Saito M, Yamamoto Y, Tsuchiyya J. Effect of phytyl side chain of vitamin E on its antioxidant activity. J Biol Biochem 1995 ; 260 : 2191-6.

4. Villani P, Orsière T, Duffaud F, Botta A. Cytotoxic and genotoxic effects of 2,2'-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH) in cultured human T lymphocytes. Med Sci Res 1996 ; 24 : 499-500.

5. Countryman PI, Heddle JA. The production of micronuclei from chromosome aberration in irradiated cultures of human lymphocytes. Mutat Res 1976 ; 41 : 321-32.

6. Fenech M. The cytokinesis-block micronucleus technique : a detailled description of the method and its application to genotoxicity studies in a human population. Mutat Res 1993 ; 285 : 35-44.

7. Aît-Amara-Mokrane Y, Lehucher-Michel MP, Balansard G, Duménil G, Botta A. Protective effect of alpha-hederin, chlorophyllin and ascorbic acid towards the induction of micronuclei by doxorubicin in cultured human lymphocytes. Mutagenesis 1996 ; 11 : 161-7.

8. Burton GW, Ingold KU. beta-carotène : an usual type of lipid antioxidant. Science 1984 ; 224 : 569-73.

9. Krinsky NI. Carotenoids and cancer in animals models. J Nutr 1989 ; 119 : 123-6.

10. De Flora S, Bronzetti G, Sobels FH. Assessement of antimutagenicity and anticarcinogenicity. Mutat Res 1992 ; 267 : 153-5.

11. Anderson D, Basaran N, Blowers SD, Edwards AJ. The effect of antioxidants on bleomycin treatment in vitro and in vivo genotoxicity assays. Mutat Res 1995 ; 329 : 37-47.

12. Salvadori D, Ribeiro L, Natarajan A. Effect of beta-carotene on clastogenic effects of mitomycin C, methyl methanesulphonate and bleomycin in chines hamster ovary cells. Mutagenesis 1994 ; 9 : 53-7.

13. Bronzetti G, Galli A, Della Croce C. Antimutagenic effect of chlorophyllin. In : Kuroda Y, Shankel DM, Waters MD, eds. Antimutagenesis and anticarcinogenesis mechanism II. Plenum, New York, 1990 : 463-8.

14. Fenech M, Morley A. Kinetochore detection in micronuclei : an alternative method for measuring chromosome loss. Mutagenesis 1989 ; 2 : 98-104.