ARTICLE
L'utilisation de particules de latex (shell/core polymer particles)
sensibilisées par des anticorps monoclonaux a permis d'obtenir
une sensibilité suffisante pour effectuer le dosage néphélémétrique
de protéines présentes à des concentrations de l'ordre
du µg/l dans le sérum, seulement réalisable jusqu'alors
par des techniques radio-immunologiques ou immunoenzymatiques.
Nous avons étudié une nouvelle technique immunonéphélémétrique
permettant de réaliser les dosages de l'alpha-fœtoprotéine
(AFP) et de l'antigène carcinoembryonnaire (ACE) sur un appareil
totalement automatique : le BN II de Behring Diagnostic [1].
Matériel
et méthode
Matériel : le BN II
Le dernier développement des néphélémètres
Behring propose un système totalement automatique offrant : identification
des patients et des réactifs par code à barres, mesures
à 37 °C, rinçage des cuvettes de mesure, dilution automatique
des sérums hors du domaine de mesure, contrôle de qualité,
validité très longue de l'étalonnage, cadence de
150 tests à l'heure.
Méthode
En milieu très dilué, des particules de polystyrène
recouvertes d'anticorps s'agglutinent en présence d'un échantillon
contenant l'antigène correspondant. L'intensité de la lumière
infrarouge (longueur d'onde : 840 nm) dispersée par les agglutinats
est une fonction de la concentration en antigène. Les anticorps
utilisés pour les dosages d'AFP et d'ACE sont des anticorps monoclonaux
de souris anti-AFP ou anti-ACE humains de spécificité très
étroite.
Le risque de réaction non spécifique est prévenu
par une préincubation avec un réactif contenant des immunoglobulines
de souris et un détergent permettant d'éliminer les interférences
dues aux lipides et à des anticorps hétérophiles.
Le risque d'excès d'antigène pour l'AFP est prévenu
par une pré-réaction effectuée sur une très
faible quantité d'échantillon qui produit un signal permettant
de détecter l'excès d'antigène. La lecture au point
final de la réaction évite le risque d'interférence
de la turbidité propre de l'échantillon.
Les standards sont des pools de sérums humains enrichis en AFP
(ou ACE) humains. Ils sont étalonnés par rapport à
de l'AFP (ou ACE) humaine hautement purifiée, selon les recommandations
de l'International Federation of Clinical Chemistry. Il en est de même
des contrôles bas et haut. L'étalonnage est effectué
sur 6 points sur les domaines de mesure de 5 à 170 µg/l pour
l'AFP, de 1 à 105 µg/l pour l'ACE, avec des domaines de fiabilité
de 5 à 1,7 x 106 µg/l pour l'AFP et de 1 à
1,6 x 105 µg/l pour l'ACE.
Évaluation analytique
Nous avons respecté un protocole établi en accord avec
la société Behring et conforme aux recommandations de la
commission de validation de techniques de la SFBC [2]. Ont été
étudiées répétabilité et reproductibilité,
linéarité, spécificité analytique, contamination
inter-échantillons, influence des anticoagulants. Une étude
de corrélation a été réalisée avec
la technique immunoenzymatique microparticulaire mise en œuvre sur
IMx Abbott [3].
Résultats
Répétabilité et reproductibilité
La précision intrasérie a été étudiée
en mesurant la concentration en AFP ou ACE 20 fois sur 3 pools de sérums
de malades et 3 témoins titrés (Behring et Abbott). Pour
des valeurs moyennes de 15 µg/l et 355 µg/l d'AFP, les coefficients
de variation intrasérie sont respectivement de 6,8 % et 5 %. De
même pour l'ACE, pour des valeurs moyennes respectivement de 16
µg/l et 73 µg/l, ils sont de 3,9 % et 2 %.
La précision intersérie a été établie
avec 3 pools de sérums de malades et 2 témoins titrés
(Behring) mesurés matin et après-midi pendant 5 jours consécutifs
(soit 10 séries différentes). Les coefficients de variation
interséries sont de 6 % et 5,3 % pour des taux d'AFP de 21 µg/l
et 380 µg/l, et de 5,9 % et 4,6 % pour des taux d'ACE de 10 µg/l
et 53 µg/l.
Linéarité
Nous avons dilué 3 pools de sérums de 3 concentrations
différentes (AFP : 200, 350, 495 µg/l, ACE : 17, 24, 55 µg/l)
à l'aide du diluant de la trousse (10 dilutions pour chaque pool).
La figure 1 montre les
droites obtenues avec les résultats des dosages effectués
sur les dilutions des pools 55 µg/l pour l'ACE et 495 µg/l pour
l'AFP.
Spécificité analytique
La recherche d'interférences a été effectuée
en diluant un échantillon de concentration élevée
en AFP ou en ACE avec des échantillons très hémolysés,
ictériques, hyperlipémiques ou recueillis en dehors du jeûne,
positifs en latex et Waaler-Rose, et contenant des immunoglobulines monoclonales
(sérums de concentration très faible ou nulle en AFP ou
en ACE). Les corrélations entre la valeur mesurée et la
valeur calculée dans chacune de ces dilutions sont rapportées
dans le tableau 1.
Contamination inter-échantillons
La contamination pouvant être apportée par un échantillon
de très forte concentration sur des échantillons de concentration
faible ou nulle a été mesurée en réalisant
des séries nul-fort-faible-fort-fort-nul-nul-faible. Aucune contamination
significative entre les échantillons n'a été observée.
Influence des anticoagulants
Les dosages d'AFP et d'ACE sur des échantillons prélevés
en même temps sur tube sec, héparine et EDTA n'ont pas montré
de différence significative.
Corrélation avec la technique immunoenzymatique
sur IMx
L'analyse par régression linéaire des résultats
obtenus avec 100 sérums de malades par les deux techniques a donné
les résultats suivants :
- pour l'ACE, l'équation de la droite de régression est
y = 0,998 x + 0,415 avec un coefficient de corrélation r = 0,967
(figure 2),
- pour l'AFP, 84 % des dosages effectués ont donné des
résultats inférieurs à 6 µg/l par les 2 techniques.
Pour les 16 autres sérums (concentrations de 7 à 1 500 µg/l),
l'équation de la droite de régression est y = 1,01 x + 0,869
avec un coefficient de corrélation r = 0,999.
Commentaires
L'alpha-fœtoprotéine est une glycoprotéine de poids
moléculaire 70 kDa, dont le dosage est d'un grand intérêt
chez la femme enceinte pour le diagnostic précoce d'anomalies ou
de souffrance fœtales (augmentation ou diminution [4]), et chez l'adulte
pour l'établissement du diagnostic, le suivi et le contrôle
thérapeutique de tumeurs productrices d'AFP (carcinomes hépatiques
primitifs, tumeurs du testicule, de l'ovaire, du tractus gastro-intestinal
[5]). Les valeurs fréquentes dans le sérum des sujets sains
sont inférieures à 15 µg/l. Elles peuvent atteindre
500 µg/l à la 36e semaine de grossesse. Dans les
carcinomes, on peut trouver des concentrations allant jusqu'à 107
µg/l.
L'antigène carcinoembryonnaire est une glycoprotéine de
poids moléculaire 200 kDa [6], appartenant au groupe des antigènes
oncofœtaux. Des taux augmentés sont surtout mis en évidence
chez les sujets atteints de tumeurs du tractus gastro-intestinal, du poumon
et du sein. Une augmentation persistant après exérèse
chirurgicale et traitement est un signe de la présence de fragments
résiduels de tumeur ou de métastases [7]. Les valeurs usuelles
chez les sujets sains non fumeurs sont inférieures à 5 µg/l.
Chez les gros fumeurs, elles peuvent atteindre 40 µg/l.
Les dosages d'AFP et d'ACE sont habituellement effectués par
techniques immunologiques : RIA, Irma, Elisa, Immunoenzymologie [5, 7].
Une technique immunonéphélémétrique est actuellement
disponible. L'évaluation analytique des dosages de l'AFP et de
l'ACE avec cette méthode nous a paru très satisfaisante.
Les précisions intra- et interséries sont bonnes. L'étude
de la spécificité analytique montre que cette méthode
ne présente pas de risque d'interférence si l'on doit travailler
sur des prélèvements hémolysés, ictériques,
ou contenant des immunoglobulines monoclonales ou des facteurs rhumatoïdes.
Les prélèvements hyperlipémiques donnent peu ou pas
d'interférence, mais le mode opératoire préconise
de les centrifuger 10 min à 15 000 g s'ils sont très troubles.
La corrélation avec la technique IMx Abbott est très satisfaisante.
Pour le dosage de l'ACE, la pente de la droite de régression de
0,998 et l'ordonnée à l'origine de 0,415 µg/l, montrent
qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux techniques.
Pour le dosage de l'AFP, les résultats ne sont pas exprimables
statistiquement puisque 84 % d'entre eux sont rendus inférieurs
à 6 µg/l par la technique néphélémétrique.
Cependant, la concordance est bonne et, pour les valeurs fortes, la régression
linéaire est très bonne (pente de la droite : 1,001, ordonnée
à l'origine : 0,869 µg/l).
REFERENCES
1. Kapmeyer WH, Pauly HE, Tuengler P. Automated nephelometric
immunoassays with novel shell/core particles. J Clin Lab Anal 1988
; 2 : 76-83.
2. Vassault A, Grafmeyer D, Naudin Cl, et al. Commission
« Validation de technniques ». Protocole de validation de techniques
(document B, stade 3). Ann Biol Clin 1986 ; 44 : 686-745.
3. The Abbott IMx automated benchtop imunochemistry analyzer
system. Clin Chem 1988 ; 34 : 1726-32.
4. Adams MJ, Windham GC, Greenberg LM. Clinical interpretation
of maternal serum alpha-fœtoproteine concentrations. Am J Ostet
Gynecol 1984 ; 148 : 241-54.
5. Wepsic HT. Alphafoetoprotein: its quantitation and relation-ship
to neoplasic disease. In : Kirkpatrick A, Nakamura R. Alphafoetoproteine,
laboratory procedures and clinical applications. New York, Masson
publishing, 1981 : 115-29
6. Krupey J, Gold P, Freedmann SO. Physicochemicals studies of
the carcinoembryonic antigens of the human digestive system. J Exp
Med 1968 ; 128 : 387-98.
7. Fritsche HA. Serum tumor markers for patient monitoring :
a case-oriented approach illustrated with carcinoembryonic antigen. Clin
Chem 1993 ; 39 : 2431-4.
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