ARTICLE
L'hémoglobine glyquée HbA1c est
une fraction de l'hémoglobine totale circulante, issue de la glycation
de l'hémoglobine HbA [1, 2]. Cette synthèse se fait en deux
étapes [1]. La première, rapide, réversible et dépendante
de la concentration plasmatique de glucose, conduit à un composé
labile appelé Hb pré-A1c. La seconde étape, lente,
irréversible, conduit par réarrangement d'Amadori à
l'hémoglobine HbA1c. Cette réaction a lieu à l'intérieur
des globules rouges tout au long de leur vie. Le taux de HbA1c reflète
l'équilibre glycémique des quatre à six semaines
précédentes [3] et est donc un paramètre de la surveillance
biologique des patients diabétiques [4]. La chromatographie liquide
haute performance (CLHP), en permettant la séparation spécifique
et le dosage quantitatif de l'hémoglobine A1c [5], est considérée
comme la technique de référence du dosage de HbA1c [6].
Le but de ce travail a été d'adapter la technique CLHP
habituellement utilisée au laboratoire à des prélèvements
capillaires tels que réalisés pour les autocontrôles
glycémiques [7], et d'en valider les performances analytiques selon
les recommandations de la Société française de biologie
clinique [8].
Matériel
et méthodes
* Méthode. Le dosage de l'HbA1c est réalisé
sur l'automate HI-Auto A1C, type HA-8121 (Kyoto Daiichi Kagaku, distribué
par Menarini Diagnostics) par séparation par CLHP des fractions
HbA1c, HbA1 et HbF sur colonnes Micronex AICHS2 de billes de copolymères
d'acide métacrylique - ester d'acide métacrylique recouvertes
de groupes hydrophobes et de groupes d'échangeurs de cations. Les
fractions éluées sont détectées par un photomètre
bi-chromatique. Les solvants et réactifs (Menarini Diagnostics)
comportent une solution de lavage et d'hémolyse à base de
tétrapolyphosphate pour éliminer la fraction labile de l'hémoglobine
A1c (ou pré-A1c) [9], la transformant en hémoglobine A et
glucose. Deux échantillons de contrôle fournis (Menarini
Diagnostics) sont utilisés avec valeurs : 4,4 à 6,6 % d'HbA1c
pour le premier et 9,9 à 11,1 % pour le second, aucun calibrateur
n'ayant été retenu pour le dosage de l'HbA1c [10].
* Prélèvements. Il a été pratiqué
simultanément chez 40 patients hospitalisés dans le service
d'endocrinologie-diabétologie (J.P. Louvet) : un prélèvement
veineux de 5 ml sur tube contenant un agent anticoagulant (EDTA, héparine...)
et un recueil de sang capillaire par micropiqûre de l'extrémité
distale d'un doigt au moyen de l'appareil Penlet II (Laboratoire Lifescan).
Le sang est recueilli dans un capillaire de verre de 5 µl, lui-même
placé dans un tube contenant 1 ml de solution hémolysante.
* Traitement des échantillons. La première étape
du dosage réalise le lavage et l'hémolyse du sang prélevé
grâce à la solution de tétrapolyphosphate. Cette étape
est automatisée pour les prélèvements veineux «
traditionnels » et consiste en l'hémolyse de 3 µl dans
450 µl de la solution de lavage et d'hémolyse. Pour les prélèvements
capillaires, cette étape est effectuée manuellement au moment
même du prélèvement. À ce stade, les hémolysats
sont traités de façon identique et automatique, 100 µl
sont prélevés pour permettre la séparation et l'identification
des fractions.
* Protocole et analyse statistique. L'étude a été
réalisée selon les recommandations de la Société
française de biologie clinique concernant la validation des techniques,
dans le cadre d'un protocole d'adaptation de technique [8]. Les méthodes
étant basées sur le même principe technique, déjà
validé [11], les résultats de la microméthode sont
comparés à ceux de la macrométhode, sur des séries
de mesures appariées [12].
Résultats
* Linéarité. Un test de dilution a été
réalisé en utilisant deux échantillons contenant
4,9 % et 13,6 % d'HbA1c (macrométhode). Les dilutions ont été
dosées 3 fois, 2 jours de suite. Les résultats (tableau
1) indiquent une bonne linéarité entre 4,9 % et
13,6 % d'HbA1c (r = 0,998), intervalle correspondant aux valeurs habituellement
rencontrées.
* Répétabilité. Pour la répétabilité,
un pool sanguin a permis de réaliser une série de 20 dosages
consécutifs avec un coefficient de variation de 1,23 %. Pour évaluer
la répétabilité moyenne, nous avons dosé en
double l'hémoglobine A1c dans des échantillons sanguins
distincts, répartis en trois groupes de 20. Le coefficient de variation
est dans tous les cas inférieur à 1,5 % (tableau
2).
* Reproductibilité. Le dosage de l'HbA1c a été
réalisé pour trois groupes de 20 spécimens à
24 heures d'intervalle. Les séries ont été effectuées
par des opérateurs différents. Le coefficient de variation
est dans tous les cas inférieur à 1,5 % (tableau
2).
* Comparaison avec la macrométhode. Pour cette évaluation,
on a comparé pour 40 patients les résultats obtenus par
microméthode à ceux obtenus en macrométhode (figure
1). On note une excellente corrélation entre les deux méthodes
(r = 0,998).
Un test de comparaison de séries appariées permet de montrer
une différence significative au seuil de 5 %, les résultats
obtenus par microméthode étant généralement
inférieurs à ceux obtenus en macrométhode de moins
de 1 %. Cela s'explique peut-être par l'action plus précoce
de la solution hémolysante au cours de la microméthode.
Discussion
Selon les critères habituels [8], cette microméthode de
dosage de l'hémoglobine glyquée A1c a des performances semblables
à celles de la macrométhode, avec en particulier :
- un domaine de linéarité couvrant celui des valeurs rencontrées
normalement en pathologie diabétique,
- des coefficients de variation pour la répétabilité
et la reproductibilité satisfaisants, inférieurs à
1,5 %,
- une bonne exactitude en comparaison avec la macrométhode ;
la sous-estimation inférieure à 1 %, bien que significative
au seuil de 5 %, est d'amplitude négligeable en pratique.
L'intérêt de cette microméthode réside dans
le mode et le volume de prélèvement. En effet, le suivi
de la pathologie diabétique nécessite le plus souvent de
multiples prélèvements de contrôle. Dans ce contexte,
le confort du malade peut être amélioré par la possibilité
de réaliser le dosage de l'HbA1c par microprélèvement.
De plus, ce geste peut être effectué au même moment
que le contrôle capillaire glycémique. Enfin cette démarche,
grâce au faible volume du prélèvement, rejoint la
miniaturisation des volumes analytiques rendue possible par l'automatisation
des techniques.
REFERENCES
1. Svendsen PA, Christiansen JS, Soegaard U. Rapid changes in
chromatographically determinated haemoglobin A1c induced by short-term
changes in glucose concentrations. Diabetologia 1980 ; 19 : 130-6.
2. Bunn HF, Haney DN, Gabbay KH, Gallop PM. Further identification
of the nature and linkage of the carbohydrate in haemoglobin A1c. Biochem
Biophys Res Commun 1975 ; 67 : 103-9.
3. Miedema K, Casparie T. Glycosated haemoglobin : biochemical
evaluation and clinical utility. Ann Clin Biochem 1984 ; 21 : 2-15.
4. Gebhart SS, Wheaton RN, Mullins RE, Austin GE. A comparison
of home glucose monitoring with determination of haemoglobin A1c, total
glycated haemoglobin, fructosamine, and random serum glucose in diabetic
patients. Arch Intern Med 1991 ; 151 (6) : 1133-7.
5. Eckerbom S, Bergqvist Y, Jeppson JO. Improved method for analysis
of glycated haemoglobin by ion exchange chromatography. Ann Clin Biochem
1994 ; 31 (4) : 355-60.
6. Gillery P, Delpech M, Garcia I, Vague P, Dezier JF, Perrier
C. Évaluation des méthodes de dosage de l'hémoglobine
glyquée : méthode et paramètre de référence.
Ann Biol Clin 1995 ; 53 : 395-8.
7. Hashiguchi Y, Sakakida M, Nishida K, Uemura T, Kajiwara K,
Shichiri M. Development of a miniaturized glucose monitoring system by
combining a needle-type glucose sensor with microdialysis sampling method.
Long-term subcutaneous tissue glucose monitoring in ambulatory diabetic
patients. Diabetes Care 1994 ; 17 : 387-96.
8. Vassault A, Azzedine MC, Bailly M, et al. Protocole
de validation de technique, Société française de
biologie clinique, commission « Validation de techniques ».
Ann Biol Clin 1986 ; 44 : 686-745.
9. Nakashima K, Hattori Y, Yamazaki K, Takechi M, Andoh Y, Miyaji
T. Immediate elimination of labile HbA1c with allosteric effectors of
haemoglobin. Diabetes 1990 ; 39 : 17-21.
10. Gillery P, Guillemin C, Delpech M. Hémoglobine glyquée
: méthodes de dosage et problèmes de standardisation. Ann
Biol Clin 1994 ; 52 : 157-63.
11. Furota A, Miyagawa T, Tsuda I, Tatsumi N. Correlation of
fasting blood glucose and haemoglobin A1c measured with an automated analyser.
J Autom Chem 1990 ; 12 : 17-21.
12. Doly M, Vennat JC, Cardot JM, Cardot P. Eléments
de statistique et de probabilité. InterEditions, Paris 1994.
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