Apolipoprotein (a) isoform size determination, relevance and limits of high resolution phenotyping by agarose gel electrophoresis

ARTICLE

La lipoprotéine (a) (Lp (a)) est une lipoprotéine plasmatique formée par l'association d'une particule de type LDL avec une glycoprotéine appelée apolipoprotéine (a) (apo (a)). Les études de populations ont révélé l'extrême variabilité des concentrations plasmatiques de Lp (a), de 0 à plus de 2 000 mg/l, et une grande hétérogénéité de la taille des molécules d'apo (a), de 280 à 800 kDa. La taille de l'apo (a) est directement liée au nombre de répétitions d'une séquence nucléotidique présente sur le gène de l'apo (a), codant pour un motif protéique appelé kringle 4 [1]. Ces structures sont fréquemment rencontrées dans les protéases à sérine impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse comme le plasminogène avec lequel l'apo (a), bien que dépourvue d'activité protéasique, présente beaucoup d'homologies [2].

Des données aussi bien épidémiologiques qu'expérimentales montrent que non seulement un taux de Lp (a) plasmatique élevé mais aussi la présence d'une isoforme de petite taille de l'apo (a) sont associés à une fréquence accrue de maladies cardiovasculaires [3, 4]. L'appréciation du risque athérogène et thrombogène lié à la Lp (a) nécessite donc la détermination de la taille des isoformes de l'apo (a). Cette mesure est réalisée soit par génotypage soit plus fréquemment par phénotypage. Le choix répond essentiellement à des considérations pratiques mais le phénotypage présente l'avantage de renseigner sur le niveau d'expression des allèles. Celui-ci est en grande partie déterminé génétiquement mais les éléments régulateurs sont encore imparfaitement connus et une proportion variable d'isoformes n'est pas détectée. Différents facteurs au niveau de l'expression du gène ou du métabolisme de l'apo (a) peuvent expliquer que, malgré l'apparition de méthodes très résolutives et sensibles [5], le produit de certains allèles ne soit pas détecté dans le plasma.

Le travail présenté a pour but de valider un protocole de phénotypage des isoformes de l'apo (a) accessible à un grand nombre de laboratoires et un mode reproductible d'expression des résultats.

Matériel et méthodes

La méthode utilisée est dérivée de celles de Kamboh [5] et Marcovina [6].

Détermination de la taille des isoformes de l'apo (a)

* Traitement des échantillons. Les échantillons de sérum sont obtenus à partir d'un prélèvement sanguin chez des volontaires sains des deux sexes âgés de 18 à 60 ans. Ils sont divisés dès réception en parties aliquotes de 30 µl et congelés à - 20 °C jusqu'au moment de la détermination (dans un délai de 1 mois). Pour l'électrophorèse, les échantillons sont dilués avec le tampon de dépôt : Tris 45 mM pH 8,2, EDTA 2 mM, SDS 6 %, glycérol 2 %, 1-thioglycérol 10 %, bleu de bromophénol 0,2 %, de façon à obtenir une concentration en Lp (a) voisine de 7 µg/ml. L'étalonnage est réalisé avec un standard contenant cinq isoformes (Immuno-France) de 14, 19, 23, 27 et 35 kringle 4 [7], dilué au 1/10^e avec le tampon de dépôt. Les échantillons et le standard dilués sont portés à 100 °C au bain-marie pendant 5 minutes.

* Électrophorèse et transfert sur membrane de nitrocellulose. On dépose 4,5 µl de standard et 3 et 7 µl de chacun des échantillons. La migration s'effectue dans un gel d'agarose (Agarose ultrapure, Electrophoresis grade, Gibco) à 1,5 % de 20 x 20 x 0,4 cm en « sous-marin » dans le tampon Tris 45 mM pH 8,3, acide borique 45 mM, EDTA 2 mM, SDS 0,1 % pendant 18 h à 65 V et à 4 °C (cuve Pharmacia GN 200). A la fin de la migration les isoformes de l'apo (a) se trouvent dans la moitié anodique du gel et seule cette partie est utilisée pour le transfert. Les protéines sont transférées par capillarité sur une membrane de nitrocellulose de porosité 0,45 µm (Schleicher et Schuell) à l'aide d'un appareil Turbo-blotter (Schleicher et Schuell), en tampon Tris 25 mM, glycine 192 mM pH 8,3, méthanol 10 %, SDS 0,1 % pendant 1 h à température ambiante [8].

* Immuno-révélation et détermination de la taille des isoformes de l'apo (a). Après saturation de la membrane avec une solution de blocage composée de lait écrémé en poudre à 5 % et de Tween 20 à 0,05 % dans du PBS pH 7,4, la membrane est incubée à 4 °C pendant une nuit avec l'un des antisérums suivants :

- antisérum 610221, anti Lp (a) polyclonal couplé à la peroxydase (Biopool) dilué au 1/50^e ;

- antisérum KO7 + KO9, mélange de 2 anticorps Ig G1 monoclonaux anti-apo (a) (Biosys) dilué au 1/100^e, suivi d'une incubation avec une immunoglobuline marquée à la peroxydase (Dako) diluée au 1/1 000^e ;

- antisérum QO23 (Dako) polyclonal anti-Lp (a) dilué au 1/1 000^e, suivi d'une incubation de 1 h à température ambiante avec la protéine A marquée à la peroxydase (Bio-rad) diluée au 1/2 500^e.

Après lavages avec un tampon PBS pH 7,4 contenant 0,05 % de Tween 20, les complexes immuns sont révélés avec un substrat luminescent de la peroxydase (kit ECL, Amersham). La distance de migration et la surface des bandes sont mesurées par densitométrie des films à 420 nm (Desaga CD60).

Il est possible de réutiliser la même membrane pour tester un autre antisérum après élimination du premier anticorps. La « deshybridation » nécessite l'incubation de la membrane pendant 30 min à 50 °C dans un tampon Tris-HCl 60 mM pH 6,8, contenant 2 % de SDS et du 1-thioglycérol 0,1 M.

Autres méthodes

La concentration plasmatique de la Lp (a) a été mesurée par une méthode immuno-enzymatique Elisa, et la taille des fragments d'ADN codant pour les motifs kringle 4 a été déterminée par électrophorèse en champ pulsé des fragments de restriction Kpn1 comme décrit par Lackner et al. [9].

Résultats

Mesure de la taille

* Précision. Nous avons utilisé un mélange de cinq isoformes dont les tailles sont exprimées en nombre de kringles. La courbe d'étalonnage est tracée en portant la distance de migration de chaque isoforme du standard en fonction du nombre de kringles correspondant, et en prenant pour origine la migration de l'isoforme la plus cathodique. La courbe qui en résulte est exprimée sous la forme d'une fonction polynomiale d'ordre 2 (figure 1a). Cette procédure est validée par la bonne corrélation avec les résultats obtenus par génotypage [10].

L'équation proposée récemment par Marcovina et al. [11] a été appliquée à 22 isoformes de notre échantillonage choisis de façon à couvrir une large gamme de tailles entre 12 et 41 kringles. La relation linéaire entre le logarithme népérien du nombre de kringle et la mobilité relative des isoformes est vérifiée et l'équation de la droite est comparable à celle qui est donnée par les auteurs (figure 1b).

* Reproductibilité. Deux échantillons exprimant chacun deux isoformes ont été déposés sur 13 gels pour le premier et 21 pour le second. Le nombre de kringles mesuré était en moyenne de 27,8 (26,7 à 29,0) et 19,4 (18,2 à 20,3) pour le premier et de 23,5 (22,5 à 24,4) et 33,1 (32,0 à 33,8) pour le second. Lorsque le nombre de kringles est ramené à la valeur entière la plus proche, l'écart-type observé est de ± 1 kringle, indépendamment de la taille de l'isoforme.

* Sensibilité. La proportion d'allèles qui produisent une isoforme détectée est très variable et résulte de choix méthodologiques tels que : quantité déposée, anticorps utilisé et mode de révélation. Étant donné la grande étendue des concentrations plasmatiques de Lp (a), et du fait que la concentration relative de chaque isoforme n'est pas prévisible, il est nécessaire de réaliser au moins deux dépôts par échantillon. Deux dépôts, correspondant à 20 et 50 ng de Lp (a), sont adaptés à la plupart des cas.

Les anticorps ont été testés soit sur différentes parties d'un même gel, soit successivement sur la même membrane après deshybridation. Les anticorps monoclonaux K07 et K09 n'ont donné de signal détectable avec aucun des échantillons. Utilisés pour le dosage de la Lp (a) par Elisa, il est possible qu'ils ne reconnaissent pas l'apo (a) sous forme dénaturée. L'anticorps Q023 améliore la sensibilité de la méthode (figure 2) puisque, sur un total de 80 échantillons, il a mis en évidence 14 bandes qui n'étaient pas détectées avec les anticorps WTW et 610221. La spécificité de ces bandes a été confirmée par le génotype.

Pour la révélation nous avons comparé deux méthodes parmi les plus sensibles : la chemiluminescence avec un anticorps secondaire ou la protéine A marqués à la peroxydase, et un marquage radioactif avec la protéine A marquée avec ¹²⁵I. Nous avons retenu la luminescence plus rapide, plus sensible, facile à analyser par densitométrie, et qui évite l'utilisation d'un marqueur radioactif. Le seuil de détection est de 1 ng de Lp (a) pour un temps d'exposition du film de 5 à 10 minutes.

* Spécificité des bandes observées. Des quantités de Lp (a) supérieures à 50 ng ont été déposées pour tenter de détecter un plus grand nombre d'isoformes. Parmi les bandes supplémentaires révélées dans ces conditions, 15 avaient une taille s'écartant de plus de 4 kringles de la taille déterminée par le génotype. Dans tous les cas il s'agissait de bandes de faible intensité qui représentaient moins de 5 % de la surface des bandes de l'échantillon et dans 12 cas sur 15 le dépôt était supérieur à 60 ng. Ces bandes ont été considérées comme des artéfacts.

Évaluation semi-quantitative de l'expression des allèles

L'expression relative des deux allèles d'un sujet donné est souvent très différente ; dans 75 % des cas une des isoformes représente à elle seule plus de 88 % de l'apo (a) de l'échantillon. La quantité de Lp (a) associée à chaque isoforme est estimée par intégration de la surface des bandes après révélation du film.

* Reproductibilité. Les variations dans l'intensité des bandes lorsqu'un échantillon est phénotypé à plusieurs reprises sont importantes. Elles représentent la somme des imprécisions sur des paramètres tels que le volume déposé, le rendement de transfert et les conditions d'exposition du film. Des résultats reproductibles sont obtenus en rapportant la valeur relative des deux isoformes à la concentration plasmatique de Lp (a). Les trois anticorps testés de cette façon ont montré une réactivité identique vis-à-vis de tous les échantillons même pour les très faibles concentrations de Lp (a) (tableau 1).

* Linéarité. La figure 3 montre que lorsque le dépôt ne dépasse pas 50 ng, le film n'est pas saturé même lorsqu'une seule isoforme est présente.

Discussion

Les résultats présentés montrent que le phénotypage de l'apo (a) permet de mesurer à 1 kringle près la taille de la plupart des isoformes avec une sensibilité de l'ordre du nanogramme. Des résultats analogues ont été obtenus par d'autres groupes, mais notre travail visait à valider un mode d'expression des résultats qui soit transposable dans d'autres laboratoires sans recours au génotypage, et à définir des conditions opératoires qui améliorent la sensibilité de la méthode tout en préservant la spécificité de la détection.

La détermination de la masse moléculaire se heurte au manque d'étalon fiable dans la zone comprise entre 200 et 800 kDa. D'autre part, les résultats diffèrent selon la nature du gel (agarose ou acrylamide) et selon la concentration de l'acrylamide [12]. L'expression des résultats en nombre de kringles 4 repose sur la détermination préalable du génotype des échantillons qui serviront à étalonner le phénotypage. Or le génotypage lui-même donne un résultat en kilobases et la conversion en kringles est basée sur le travail de Lackner et al. [9] qui ont établi par séquençage qu'un allèle comportant 12 séquences codant pour le kringle 4 donne un fragment de restriction KpnI de 45 kb. L'expression directe des résultats en kringles, grâce à l'utilisation d'un standard commercial permet une comparaison facile des données du phénotypage avec celles du génotypage [11].

Le second point concerne la fréquence de l'allèle nul qui varie de 10 à 35 % selon les auteurs. Des différences ethniques sont souvent invoquées pour expliquer ces variations, mais le choix de l'anticorps primaire peut être déterminant puisque parmi les quatre que nous avons testés, l'anticorps QO23 détecte environ 15 % d'isoformes supplémentaires. Dans certains cas des bandes n'ont pas été confirmées par le génotypage. En fait, ces bandes artéfactuelles sont toujours de faible intensité (moins de 5 % de l'expression totale) et elles peuvent être évitées si la quantité de Lp (a) déposée n'excède pas 50 ng. Une publication récente fait état de fragments d'apo (a) circulant dans le plasma [13]. Il serait donc possible qu'en cas de surcharge ces fragments soient mis en évidence. Dans une optique de prévention des maladies cardiovasculaires et dans l'état actuel de nos connaissances, on peut se demander si l'identification d'isoformes très faiblement concentrées est utile et le cas échéant, le génotypage constitue la méthode de choix pour détecter tous les allèles.

CONCLUSION

REFERENCES

1. Scanu AM, Edelstein C. Kringle-dependent structural and functional polymorphism of apoprotein (a). Biochim Biophys Acta 1995 ; 1256 : 1-12.

2. Chapman MJ, Huby T, Nigon F, Thillet J. Lipoprotein (a) : implication in atherosclerosis. Atherosclerosis 1994 ; 110 : S69-75.

3. Sandholzer C, Saha N, Kark JD, et al. Apo (a) isoforms predict risk for coronary heart disease. A study in six populations. Arterioscler Thromb 1992 ; 12 : 1214-26.

4. Kronenberg F, Kathrein H, König P, et al. Apolipoprotein (a) phenotypes predict the risk for atherosclerosis in patients with end-stage renal disease. Arterioscler Thromb 1994 ; 14 : 1405-11.

5. Kamboh MI, Ferrell RE, Kottkep BA. Expressed hypervariable polymorphism of apolipoprotein (a). Am J Hum Genet 1991 ; 49 : 1063-74.

6. Marcovina SM, Zhang ZH, Gaur VP, Albers JJ. Identification of 34 apolipoprotein (a) isoforms : differential expression of apolipoprotein (a) alleles between american blacks and whites. Biochem Biophys Res Commun 1993 ; 191 : 1192-6.

7. Kraft HJ, Köchl S, Menzel HJ, Sandholzer C, Utermann G. The apolipoprotein (a) gene : a transcribed hypervariable locus controlling plasma lipoprotein (a) concentration. Hum Genet 1992 ; 90 : 220-30.

8. Nagy B, Costello R, Csako G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Anal Biochem 1995 ; 231 : 40-5.

9. Lackner C, Cohen JC, Hobbs HH. Molecular definition of the extreme size polymorphism in apolipoprotein(a). Hum Mol Genet 1993 ; 2 : 933-40.

10. Valenti K, Aveynier E, Laporte F, Hadjian AJ. Evaluation of the genotyping and phenotyping approaches in the investigation of apolipoprotein (a) size polymorphism. Clin Chim Acta 1997 ; 263 : 249-60.

11. Marcovina SM, Hobbs HH, Albers JJ. Relation between number of apolipoprotein (a) kringle 4 repeats and mobility of isoforms in agarose gel : basis for a standardized isoform nomenclature. Clin Chem 1996 ; 42 : 436-9.

12. Furbee JW, Fless GM. Evaluation of common electrophoretic methods in determining the molecular weight of apolipoprotein(a) polymorphs. Anal Biochem 1996 ; 234 : 66-73.

13. Mooser V, Marcovina SM, White AL, Hobbs HH. Kringle-containing fragments of Apolipoprotein (a) circulate in human plasma and are excreted into the urine. J Clin Invest 1996 ; 98 : 2414-24.