ARTICLE
Les candidoses profondes représentent une pathologie de plus en
plus fréquemment rapportée chez les patients immunodéprimés,
en particulier neutropéniques [1, 2]. Cette pathologie n'épargne
pas les sujets immunocompétents, lorsque de multiples facteurs
de risque sont associés (antibiothérapie à large
spectre, cathéter central, alimentation parentérale, chirurgie
digestive...) [3].
Quel que soit le terrain, le diagnostic des candidoses profondes demeure
difficile dans la majorité des cas. En effet, le tableau clinique
ne présente généralement pas de symptomatologie spécifique
et se résume le plus souvent à un état fébrile
isolé résistant à une antibiothérapie chez
un patient à risque. L'isolement de colonies de Candida
à partir de sites fermés, normalement stériles, constitue
un argument de grande valeur mais les résultats faussement négatifs
sont loin d'être exceptionnels. La mise en évidence de levures
et filaments mycéliens lors d'un examen anatomopathologique constitue
la meilleure preuve de candidose invasive, mais elle n'est que rarement
obtenue pour diverses raisons (absence de signes de localisation orientant
vers un organe donné, fréquente contre-indication à
pratiquer une biopsie, risque de prélever en dehors de la lésion...).
Toutes ces difficultés expliquent l'intérêt porté
depuis ces dernières années aux examens autres que l'isolement
de l'agent pathogène [4, 5]. Pour tenter d'améliorer le
diagnostic des candidoses systémiques, diverses approches ont été
développées dans trois directions : la recherche d'anticorps,
d'antigènes et de leurs métabolites, et plus récemment
d'ADN candidosique par amplification génique [6-9]. Les tests de
détection d'antigènes circulants manquent de sensibilité
et de spécificité et les tests de biologie moléculaire
doivent être encore simplifiés avant de pouvoir être
appliqués en pratique quotidienne.
Ces raisons expliquent le grand nombre de techniques proposées
visant à mettre en évidence les anticorps anti-Candida.
Certaines d'entre elles portent sur la recherche d'anticorps anticytoplasmiques
et d'autres sur celle d'anticorps antimannane (constituants antigéniques
polysaccharidiques majeurs de la paroi de Candida [10]). Bien qu'ayant
fait l'objet de critiques, l'intérêt de leur détection
est démontré [11]. La co-immunoélectrodiffusion (Co-IED)
sur acétate de cellulose permet de révéler les anticorps
antimannane dans une population de patients atteints de candidose systémique
démontrée ou hautement probable avec de bonnes spécificité
et sensibilité [12, 13]. Par ailleurs, la détermination
des isotypes spécifiques G, M, A et E anti-Candida par diverses
méthodes quantitatives (enzyme linked immuno sorbent assay ou Elisa,
immunocapture, hémagglutination passive...) a fait précédemment
l'objet d'études démontrant que la réponse humorale
est polyisotypique, illustrant l'intérêt que pourrait constituer
cette détermination dans le diagnostic des candidoses [14, 15].
Toutefois, ces techniques quantitatives ne permettent pas toujours de
discriminer les candidoses profondes des candidoses superficielles et
leur spécificité peut être inférieure à
celles des techniques qualitatives. Il nous a donc paru intéressant
d'évaluer l'intérêt d'une recherche des différents
isotypes des anticorps antimannane, grâce à une technique
qualitative. Pour ce faire, nous avons complété la Co-IED
par la technique de filtration immunoenzymatique ou enzyme linked immunofiltration
assay (Elifa) développée sur acétate de cellulose
[16].
Matériels et méthodes
Sérums
Cette étude rétrospective porte sur 201 sérums
provenant de 126 individus appartenant à 4 groupes. Les échantillons
ont été conservés à - 20 °C.
Le groupe I (candidoses profondes) comprend 54 sérums prélevés
chez 21 malades. Les critères d'inclusion dans ce groupe ont été
soit la positivité d'au moins deux hémocultures prélevées
le même jour en deux sites veineux différents, soit l'isolement
de Candida à partir d'un site fermé normalement stérile
(liquide céphalo-rachidien, liquide péritonéal...)
ou encore à partir d'urines chez des patients présentant
un tableau de pyélonéphrite avec isolement de plus de 106
colonies de levures par millilitre d'urines sans bactéries associées.
Le groupe II (patients « colonisés ») comprend 48 sérums
de 37 patients. Ces patients, colonisés par Candida, ne
présentaient pas de symptomatologie pouvant faire évoquer
une candidose profonde. Un ou plusieurs prélèvements avaient
permis d'isoler des levures à partir du tractus digestif ou des
urines.
Le groupe III (candidose profonde probable) comprend 52 sérums
prélevés chez 21 malades hautement suspects de candidose
profonde, pour lesquels la recherche de Candida avait été
positive à partir de plusieurs sites ouverts (gorge, selles, expectorations,
urines). Pour ces patients, l'isolement de Candida à partir
d'un site profond n'avait pu être réalisé.
Le groupe IV (témoins) comprend 47 sérums obtenus de 25
donneurs de sang et de 22 malades hospitalisés, non suspects de
candidose et pour lesquels un prélèvement nous avait été
adressé pour diverses sérologies parasitaires.
Sérum de référence
Le sérum de référence utilisé pour la mise
en évidence de l'arc mannane dans les sérums testés
est un sérum humain préalablement sélectionné
par Co-IED avec un sérum de lapin hyperimmunisé antimannane
[12].
Antigènes
Une préparation d'antigène métabolique de Candida
albicans (Sanofi Pasteur) à la concentration de 2,3 mg/ml a
été utilisée pour la Co-IED et l'Elifa. La souche
de Candida albicans utilisée pour la réaction d'immunofluorescence
indirecte (IFI) est le clone VW32 de sérotype
A choisi en raison de sa bonne réactivité avec les sérums
d'animaux hyperimmuns [17].
Méthodes
La co-immunoélectrodiffusion (Co-IED) sur membrane d'acétate
de cellulose consiste à faire migrer rapidement, les uns vers les
autres, sérums et antigènes puis à révéler
par coloration au bleu de Coomassie les différents arcs formés
par les complexes antigènes-anticorps précipitants. Les
bandes d'acétate de cellulose (Sartorius IEN 112000,25 x 160),
après avoir été imprégnées en tampon
Tris-glycine 0,2 M pH 9, sont disposées dans des cuves de migration
(Sebia). Quinze microlitres d'antigène sont déposés
linéairement du côté cathodique de la membrane. Du
côté anodique, 3 sérums sont placés côte
à côte sous forme de gouttes de 15 µl chacune. Après
2 heures 15 minutes de migration électrophorétique sous
une tension de 140 volts (générateur Sebia 500), les membranes
sont découpées et lavées en tampon Tris-Nacl 0,15
M.
En général, la Co-IED consiste à faire migrer,
conjointement sur une même bande, deux sérums à étudier
déposés de part et d'autre d'un sérum de référence
sélectionné pour la spécificité connue de
ses anticorps. Les réactions d'identité (coalescence) qui
s'établissent avec les arcs du sérum de référence
permettent alors de repérer les systèmes identiques présents
dans les sérums testés, et en particulier le système
précipitant mannane antimannane. Lorsque l'on veut réaliser
une étude cinétique comparative entre deux prélèvements
successifs d'un même patient, ces deux sérums seront alors
déposés côte à côte. L'augmentation de
la concentration des anticorps antimannane dans un sérum se traduit
par l'intensification et le déplacement de l'arc mannane vers le
dépôt antigène (figure
1). Inversement, une diminution des anticorps est appréciée
par son déplacement vers le dépôt du sérum.
Dans le test Elifa, les systèmes précipitants sont révélés
et caractérisés par immunofiltration avec des anticorps
marqués par une enzyme et spécifiques de chacun des quatre
isotypes IgG, M, A ou E. Pour cela, après Co-IED, quatre bandes
identiques sont découpées, montées dans des cellules
de filtration conçues pour l'Elifa (Bioblock France) et soumises
à une filtration qui se déroule à un débit
constant (1 ml/minute) en trois étapes :
- 5 minutes de lavage en tampon PBS-Tween 20 (1 ‰)-albumine bovine
(1 ‰) ;
- 15 minutes de marquage par des anticorps de chèvre ou de mouton
anti-IgG, IgM, IgA ou IgE humaines marqués à la phosphatase
alcaline (Biosys réf BI 2515 C ; BI 2519, BI 2516 C, Caltag réf
M 15708). Ces anticorps sont dilués (1/1 000 à 1/10 000)
en PBS-Tween-Albumine ;
- 5 minutes de lavage en PBS pH 7,2.
Ces différentes étapes de filtration peuvent être
réalisées de façon automatique grâce à
un module contrôlant pompes et électrovannes (Bioblock France).
Les membranes sont alors retirées des cellules de filtration et
immergées dans le tampon de révélation (40 ml de
tampon amino-2 méthyl-2 propanol-1 pH 10,15 + 1,6 g de MgCl2).
Le révélateur [5bromo 4chloro 3indolyl phosphate (10 mg)
dissous dans 1 ml de N,N diméthylformamide] est ajouté.
Dès que la révélation des arcs de précipitation
est obtenue, les bandes sont rincées en eau distillée, puis
la réaction est stoppée à 4 °C par une solution
d'acide acétique à 5 %.
L'immunofluorescence indirecte (IFI), systématiquement associée
à la Co-IED et à l'Elifa, est réalisée selon
une technique précédemment décrite [18]. Ce test
est considéré comme significatif quand la réaction
est au moins positive à la dilution 1/3200.
Résultats
Recherche d'anticorps anti-Candida (Co-IED
et IFI)
Les résultats obtenus par Co-IED et IFI sont exposés dans
le tableau 1.
Dans le groupe I (candidoses profondes certaines), le premier sérum
prélevé simultanément ou après l'isolement
de Candida en site profond est positif par Co-IED dans 18 cas sur
21 (85,7 %). L'IFI n'est positive dès ce premier prélèvement
que dans 9 cas, mais se positive plus tardivement dans 5 autres cas. Dans
aucun cas, l'IFI n'anticipe la Co-IED. Dans 3 cas de septicémies,
la sérologie est négative par les deux techniques. Il s'agit,
dans 2 cas (n° 19 et 20), de patients leucémiques en aplasie
et dans le troisième (n° 21) d'un enfant prématuré
âgé de 3 semaines (tableau
2).
Dans le groupe II (sujets colonisés), la Co-IED est positive
chez 3 patients sur 37 (8,1 %). Pour deux d'entre eux, l'IFI est également
positive. Un des trois patients, porteur d'une sonde urinaire, présente
des urines positives à C. albicans. Le second cas concerne
une patiente opérée d'un cancer colique et pour laquelle
C. albicans a été isolé d'un prélèvement
de selles. Le troisième cas est celui d'un patient ayant présenté
une mycose buccale après antibiothérapie.
Les 21 patients du groupe III (candidose profonde probable) présentent
tous une Co-IED positive, l'IFI est positive dans 9 cas (42,9 %) sur le
premier sérum étudié contemporain ou postérieur
à l'isolement de Candida et se positive plus tardivement
dans 6 autres cas.
Parmi les 47 patients du groupe IV (témoins), un seul présente
à la fois un arc mannane de faible intensité et une IFI
positive. Il s'agit d'un donneur de sang pour lequel il n'a pas été
possible d'obtenir de renseignements complémentaires. Pour un autre
patient, la Co-IED seule est positive. Il s'agit d'un patient suspect
de syndrome de larva migrans viscérale et chez qui aucun élément
en faveur d'une candidose n'a été décelé.
Caractérisation des isotypes par Elifa
La caractérisation des isotypes par Elifa a été
appliquée à chaque sérum des quatre groupes de patients
présentant un arc mannane par Co-IED.
Les résultats de l'Elifa pour le groupe I (candidoses profondes
certaines) sont exposés dans le tableau
2. Pour les sérums prélevés à la date
la plus proche de celle de l'isolement de Candida, l'association
des quatre isotypes G, M, A et E est présente chez 15 des 18 patients
(83,3 %) présentant un arc mannane, mais l'arc IgE antimannane,
est souvent de faible intensité. Dans deux cas (nos
9 et 13), les isotypes décelés sont seulement G, M et A
et dans un cas, G et M (n° 3).
Les examens répétés chez 16 patients de ce groupe
I montrent que les différents isotypes sont généralement
décelés dès le premier sérum étudié
contemporain de l'infection. L'association des 4 isotypes chez les 13
patients est en effet présente d'emblée sur ce sérum.
Pour un isotype considéré, une intensification du marquage
avec déplacement de l'arc mannane est parfois notée mais
l'apparition de nouveaux isotypes n'est pas décelée sur
ces prélèvements.
Pour 4 patients (cas nos 5, 9, 15 et 17), nous avons disposé
d'un sérum prélevé avant l'isolement de Candida.
Dans 2 cas (nos 5 et 15), seul l'isotype G a été
détecté sur ce prélèvement. Chez les 4 malades,
les isotypes M et A apparaissent sur le prélèvement ultérieur
contemporain du diagnostic de l'infection.
L'étude de la cinétique de régression des anticorps
montre que, généralement, celle des IgG est plus lente que
celle des autres isotypes. La cinétique de régression des
anticorps de classe M, A et E est variable selon les patients. Il n'a
pas été noté de corrélation entre cette cinétique
et le pronostic de la candidose.
Chez les 3 patients du groupe II présentant des anticorps antimannane
en Co-IED, l'Elifa met en évidence des IgG antimannane chez un
patient et l'association IgG-IgM spécifiques chez les deux autres.
L'étude des patients du groupe III montre la présence
des quatre isotypes G, M, A et E chez 15 des 21 patients (71,4 %) (tableau
3). Les trois isotypes G, M et A apparaissent dans 7 des 8 séroconversions
observées.
Pour le groupe témoin, les anticorps antimannane détectés
chez 2 patients sont de classe IgG et IgM.
Performances des tests
L'évaluation de tests immunologiques, en vue du diagnostic de
candidose profonde, comporte un obstacle majeur lié à la
difficulté de pouvoir confirmer ce diagnostic par une méthode
directe. Généralement, pour résoudre ce problème,
à un groupe de patients pour lesquels l'infection profonde est
certaine, est comparé un autre groupe de patients non suspects
de candidose profonde. Les résultats des patients des groupes I
et II ont ainsi permis les calculs de sensibilité, spécificité,
efficience et valeur prédictive positive de la Co-IED, de l'IFI,
de l'Elifa IgM et de l'Elifa IgA (tableau
4).
Discussion
Dans notre étude où la majorité des infections
candidosiques est due à C. albicans, la Co-IED est également
positive pour d'autres espèces (C. tropicalis, C.
krusei, C. parapsilosis, C. glabrata). Ces résultats
confirment l'importante réactivité croisée entre
les mannanes de différentes espèces de Candida [19].
La Co-IED nous a permis de détecter une réponse positive
chez la majorité des patients (85,7 %) du groupe I présentant
une candidose profonde certaine, alors que cette réponse n'est
détectée que chez seulement trois patients colonisés
(groupe II). Il est probable que la bonne sensibilité du test dans
le groupe I est liée au fait que la majorité des patients
n'étaient pas sévèrement immunodéprimés.
Les 3 patients pour lesquels la sérologie est négative présentaient
une profonde altération de la réponse immunitaire (hémopathie,
grande prématurité).
Ces résultats confirment l'intérêt diagnostique
de la Co-IED, mais cette technique ne permet pas d'évaluer le profil
isotypique (IgG, M, A et E spécifiques), sachant que la détection
d'IgG seules (en dehors d'une séroconversion) peut être le
reflet d'une infection antérieure.
En Elifa, tous les patients atteints de candidose et présentant
un arc mannane en Co-IED, possèdent au moins l'association des
isotypes spécifiques G et M. La grande majorité (15/18)
(83,3 %) possède les quatre isotypes G, M, A et E. La présence
des isotypes M et A spécifiques serait en faveur d'un épisode
évolutif récent. L'augmentation rapide de la concentration
de l'isotype G, accompagnée de l'apparition d'autres isotypes (notamment
IgA), paraît également confirmer l'évolutivité
de l'infection. Les IgA spécifiques n'ont été décelées
ni chez les patients colonisés ni chez les sujets témoins
non suspects de candidose. De plus, les résultats observés
chez des patients présentant une candidose profonde certaine (groupe
I) montrent la cinétique rapide de l'apparition et de la disparition
des IgA spécifiques, suggérant l'intérêt diagnostique
de cet isotype.
En revanche, les IgE spécifiques décelées par Elifa
nous paraissent d'intérêt moindre en raison de la faible
intensité du marquage et de la difficulté d'interprétation.
La réponse isotypique anti-Candida a été
étudiée par diverses équipes, à la fois chez
les patients colonisés et dans les candidoses profondes. Les résultats
en sont variables, probablement en raison des différences d'une
part dans les techniques, d'autre part dans les préparations antigéniques
utilisées. L'intérêt de la détection d'IgM
spécifiques a été rapporté à la fois
dans la précocité du diagnostic des candidoses profondes
et dans l'évaluation de l'efficacité du traitement [20,
21]. D'autres auteurs soulignent à l'inverse l'intérêt
diagnostique de la mise en évidence d'IgA anti-Candida [15,
22, 23]. Dans ces trois études, les IgA spécifiques sont
quantifiées par Elifa ou par immunocapture avec révélation
à l'aide d'hématies sensibilisées par une préparation
antigénique de Candida. Le test Elisa, d'une grande sensibilité,
permettrait de dépister parmi les patients transplantés
(moelle osseuse, foie) ceux qui sont colonisés et donc exposés
à développer une infection profonde. En ce qui concerne
l'étude de la réponse IgE anti-Candida, la majorité
des travaux porte sur des sujets atopiques [24]. Dans une étude
consacrée aux candidoses invasives post-opératoires, Savolainen
et al. [25] montrent l'intérêt de la détection
des IgE spécifiques (antimannane par radio-allergo-sorbent test
et antiprotéines par immunoblot), et en particulier la précocité
de la réponse IgE.
En résumé, l'étude de la réponse isotypique
par la méthode Elifa (utilisée dans ce travail) apporte
une information essentiellement diagnostique. Cette technique, couplée
à un test d'immunocapture, également simple à mettre
en œuvre, devrait permettre un suivi quantitatif des taux d'anticorps
sous et après traitement. Par ailleurs, l'Elifa devrait pouvoir
caractériser la réponse isotypique vis-à-vis d'autres
antigènes majeurs tels que les antigènes de PM 47 kD ou
29 kD [26, 27].
Article reçu le 18 décembre 1997, accepté le 30
janvier 1998.
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