A standardized method for HLA B27 typing by flow cytometry : validation and comparison with microlymphocytotoxicity

ARTICLE

L'une des plus fortes associations connues entre un phénotype HLA (human leukocyte antigen) et une pathologie est celle de l'antigène (Ag) HLA B27 avec la spondylarthrite ankylosante [1, 2]. La fréquence de ce dernier chez les patients atteints de spondylarthrite ankylosante est de l'ordre de 90 % tandis qu'elle est inférieure à 10 % dans l'ensemble de la population caucasienne [3]. Ainsi, la recherche de l'Ag HLA B27 fait partie d'un ensemble d'arguments cliniques, radiologiques et biologiques utiles au diagnostic de spondylarthrite ankylosante [4, 5]. Dans la classification d'Amor, la présence de l'Ag HLA B27 compte pour 2 points sur les 6 permettant d'établir un diagnostic de spondylarthropathie [5, 6].

Actuellement, deux techniques font référence en matière de typage HLA. Il s'agit de la microlymphocytotoxicité [7] et des techniques utilisant la biologie moléculaire [8, 9]. Cependant, ces analyses spécialisées, longues et coûteuses, sont pratiquées par des laboratoires disposant d'un recrutement important focalisé sur ce type d'analyse. À l'inverse, elles ne sont pas adaptées au fonctionnement de routine d'un laboratoire hospitalier d'immunologie biologique. En effet, ce dernier répond souvent à une demande d'analyse ponctuelle au « coup par coup » qui est fonction de la prescription lors de la consultation en rhumatologie.

Le développement de la cytofluorimétrie offre une alternative à ces techniques. Depuis les premiers travaux consacrés à ce sujet [10], plusieurs études ont confirmé la fiabilité d'une telle approche [11-14]. Cependant, la mise en route d'une technique de cytofluorimétrie implique une importante phase de validation propre à chaque laboratoire [11, 12, 14]. En effet, quelques contraintes existent ; certaines sont liées à un manque de standardisation de la cytofluorimétrie proprement dite, d'autres sont dues plus spécifiquement à son application au typage HLA B27 : un nombre limité de prélèvements positifs dans un recrutement tout venant (B27-positifs < 10 %), l'absence de contrôle de qualité utilisable dans ce contexte et, enfin, l'existence de réactions croisées avec les autres antigènes du CREG B7 (cross reactive group B7) dues à un manque de spécificité des anticorps utilisés.

Le but de notre travail était d'introduire et de valider une technique de cytofluorimétrie pour le typage HLA B27 dans notre laboratoire. Afin de s'affranchir des contraintes citées précédemment, celle-ci devait associer automatisation et simplicité d'utilisation (analyse au coup par coup) dans un protocole le plus standardisé possible (seuils d'interprétation) conforme au Guide de bonne exécution des analyses. Notre choix s'est porté sur une méthode utilisant : l'anticorps monoclonal (FD 705) décrit comme le plus spécifique de l'Ag HLA B27 [13, 15-16], une technique sans séparation cellulaire avec lyse automatique des érythrocytes [15, 16] et un réglage automatique du photomultiplicateur [11, 12, 17]. Après définition du protocole opératoire et d'un arbre décisionnel, nous avons validé notre technique par comparaison à la microlymphocytotoxicité.

Matériel et méthodes

Notre étude s'est déroulée en trois phases principales. La première consistait à établir les paramètres du réglage automatique du cytomètre. La deuxième consistait à définir les seuils de positivité et de négativité éventuellement séparés par une « zone grise ». La troisième consistait en la validation de notre protocole en comparant nos résultats à la microlymphocytotoxicité.

Patients

La population étudiée est issue de différents services cliniques de l'hôpital : chirurgie, endocrinologie, hépato-gastro-entérologie, gériatrie, gynéco-obstétrique, médecine interne, néphrologie, pneumologie, rhumatologie. Onze sujets faisant partie du personnel du laboratoire ont également été inclus. Le ratio homme/femme est de 0,81. L'âge moyen est de 46 ans.

Pour les deux premières étapes, nous avons analysé des échantillons dont le phénotypage B27 était connu. Nous avons bénéficié des prélèvements de 122 patients négatifs et de 104 patients positifs (Dr Couprie, Centre de biologie médicale, Fondation Marcel-Mérieux, Lyon). Par la suite, nous avons analysé 100 échantillons choisis au hasard dans l'activité de routine du laboratoire d'immunologie du CH Lyon-Sud en évitant toutefois les biais de recrutement (ratio hommes/ femmes, services cliniques, pathologies) afin d'avoir une population la plus représentative possible de la population de patients de notre hôpital.

Cytométrie en flux

* Réglage du photomultiplicateur

Nous avons utilisé les prélèvements de 5 patients connus pour leur positivité vis-à-vis de l'Ag HLA B27. Chaque prélèvement a donné lieu à deux marquages : l'un avec l'anticorps anti-B27 couplé FITC (fluorescein isothiocyanate, clone FD 705, One Lambda, États-Unis), l'autre avec son contrôle isotypique (One Lambda, États-Unis). La fenêtre d'acquisition cellulaire était positionnée sur la population lymphocytaire (histogramme taille/structure). Cette dernière présente, à la différence des populations monocytaires et polynucléaires, une expression plus homogène des Ag HLA [16], et donc adaptée à un traitement des résultats en moyennes de fluorescence. Nous avons réglé arbitrairement le voltage du photomultiplicateur de manière à obtenir pour les marquages isotypiques une moyenne de fluorescence égale à 1. Avec ce même réglage, les cinq marquages anti-B27 FITC ont été immédiatement analysés. La moyenne des cinq valeurs de moyennes de fluorescence obtenues est alors devenue la valeur cible pour la calibration automatique de l'appareil. Pour la réalisation de cette dernière, nous utilisons des microbilles de calibration Flow-Set (Beckman Coulter, Miami, États-Unis) qui sont des billes de polystyrène revêtues d'un fluorochrome stable dans le temps. Ainsi, l'utilisation quotidienne des billes permet d'adapter le réglage du PMT par rapport à la valeur cible. Celle-ci peut alors être considérée comme une valeur de référence arbitraire qui devient une constante au cours du temps permettant donc de comparer des moyennes de fluorescence à des périodes différentes et ainsi de définir des seuils d'interprétation stables indépendamment des fluctuations inhérentes à la cytofluorimétrie.

* Définition des seuils de positivité et de négativité

Nous avons analysé 122 échantillons négatifs et 99 échantillons positifs. Compte tenu de la fréquence de l'Ag HLA B27 dans la population caucasienne, de tels effectifs permettaient d'obtenir des résultats statistiquement représentatifs [11] et d'établir des panels de moyennes de fluorescence représentatifs des populations négatives et positives vis-à-vis de l'Ag HLA B27. Ainsi, nous avons pu définir les seuils d'interprétation : le seuil de positivité est égal à la plus faible valeur des moyennes de fluorescence des échantillons connus positifs, le seuil de négativité est égal à la plus haute valeur des échantillons connus négatifs, entre ces deux valeurs est définie une « zone grise » ne permettant pas de définir le statut B27.

* Préparation des échantillons

Dix microlitres de l'anticorps monoclonal anti-B27 humain sont ajoutés à 100 mul de sang total prélevé indifféremment sur EDTA ou héparine (le marquage est réalisé dans les 48 heures qui suivent le prélèvement). Après incubation (30 min, 4 °C, à l'abri de la lumière), une lyse automatique des hématies (Immunoprep, Coulter) est réalisée suivie d'une fixation des cellules par le formol (Q-Prep, Beckman Coulter). Les échantillons sont analysés avec un cytomètre Epics XL (Beckman Coulter). Les cellules étant fixées, il est possible de différer l'analyse proprement dite de 24 à 48 heures.

Microlymphocytotoxicité

Nous avons utilisé la trousse Lymphocytes HLA B27 Special (Biotest AG, Dreieich, Allemagne) permettant la mise en évidence de l'Ag HLA B27 et également celle de l'Ag HLA B7. Il s'agit de la technique sérologique en microplaque initialement décrite par Térazaki [7].

Résultats

Détermination des seuils de décision

La distribution des valeurs individuelles des 221 échantillons analysés (122 négatifs et 99 positifs) est présentée dans la figure 1a. Les moyennes de fluorescence, moyennes ± DS, et valeurs extrêmes sont les suivantes : 2,0 ± 1,3 [0,5-8,7] pour la population négative et 25,7 ± 6,3 [14,4-49,8] pour la population positive. Les seuils d'interprétation ont donc été ainsi définis : un échantillon dont la moyenne de fluorescence est inférieure à 8,7 est considéré comme HLA B27-négatif, un échantillon dont la moyenne de fluorescence est supérieure à 14,4 est considéré comme HLA B27-positif, un échantillon dont la moyenne de fluorescence est comprise entre 8,7 et 14,4 est considéré comme douteux et nécessite une détermination par microlymphocytotoxité.

Validation des seuils, comparaison à la microlymphocytotoxicité

Cent échantillons ont été analysés en parallèle : par cytofluorimétrie selon le protocole décrit ci-dessus et par microlymphocytotoxicité ffigure 1b). Nous obtenons une parfaite concordance pour 99 d'entre eux : 93 résultats négatifs (parmi lesquels 13 sont HLA B7) et 6 résultats positifs. Un échantillon HLA B27-positif par microlymphocytotoxicité a été trouvé douteux par cytofluorimétrie (moyenne de fluorescence = 12).

La présence de l'antigène HLA B7 n'induit pas de faux positif. En effet, la plus forte moyenne de fluorescence obtenue avec les échantillons HLA B27^­/HLA B7⁺ (moyenne de fluorescence = 4,26) n'est pas située dans la zone grise et la moyenne (± DS) des valeurs obtenues chez ces 13 patients HLA B7-positifs (moyenne de fluorescence = 2,0 ± 0,5) n'est pas statistiquement différente (test de Mann-Whitney) de celle obtenue dans la population B27/B7-négative (moyenne de fluorescence = 1,2 ± 0,6).

Discussion

L'antigène HLA B27 est associé à des affections rhumatismales, principalement la spondylarthrite ankylosante pour laquelle 90 % de patients atteints sont porteurs de l'Ag HLA B27 [3], mais aussi les arthrites réactionnelles [18], le rhumatisme psoriasique [2, 19] et les uvéites antérieures [20]. Sans avoir de caractère ni spécifique ni pathognomonique, sa recherche fait partie d'un faisceau d'arguments utiles au diagnostic ou au pronostic de ces affections [4-6].

La microlymphocytotoxicité et la biologie moléculaire, considérées comme techniques de référence, sont des techniques très performantes mais peu adaptées au fonctionnement de routine d'un laboratoire non spécialisé dans le typage HLA [14-16]. Les techniques par cytofluorimétrie, plus rapides d'utilisation, ont été développées dès la fin des années 1980 [10] et offrent actuellement une fiabilité très satisfaisante [11-16]. Cependant, leur mise en place implique une phase de validation importante qui a constitué le but de notre travail.

Concernant le choix de l'anticorps monoclonal, plusieurs études comparatives démontrent la supériorité du clone FD 705 en termes de sensibilité et de spécificité [13, 15-16]. En effet, cet anticorps reconnaît tous les sous-types de B27 [21] et présente un faible taux de réactions croisées [13, 15]. Ward et al. ont montré que pour 1 091 échantillons testés avec l'anticorps FD 705 seulement 6 patients (0,5 %) donnaient un résultat indéterminé. Ces patients étaient B7-positifs et aucune réaction croisée avec un autre groupe HLA n'était décelée [16]. Notre expérience permet d'arriver aux mêmes conclusions sur un type de recrutement similaire.

L'effectif de notre population, en accord avec les exigences de représentativité décrites dans la littérature [11], nous a permis de définir pour seuil de négativité la plus forte valeur obtenue au sein de la population négative et pour seuil de positivité la plus faible valeur de la population positive. Les résultats obtenus lors de la seconde phase de notre étude
valident ces seuils d'interprétation. De plus, les 100 patients testés semblent représentatifs de la population générale puisque nous obtenons 7 % de prélèvements HLA B27-positifs pour une moyenne de 8 à 10 % décrite au sein de la population caucasienne [1, 2] ; et 13 % de prélèvements HLA B7-positifs pour une moyenne décrite de 8 à 22 % en fonction des auteurs et des ethnies [22]. Au total, ces résultats, obtenus sur plus de 300 patients, illustrent la fiabilité de la méthode. Seul un échantillon présente une discordance d'interprétation entre cytofluorimétrie et microlymphocytotoxicité. Pour ce patient, la moyenne de fluorescence se trouve dans la zone grise et fait conclure à un test douteux, tandis que la microlymphocytotoxicité donne un résultat positif. Afin d'exclure un problème de marquage, nous avons renouvelé celui-ci, mais les résultats sont restés identiques. La cause de cette discordance demeure inexpliquée. Il est possible qu'il s'agisse d'une conséquence de la variation de l'expression des antigènes HLA, diminuée dans certaines circonstances, comme par exemple lors d'infections virales ou bactériennes [8, 23]. Il faut toutefois noter que cet échantillon ne peut pas être considéré comme un réel faux négatif. Selon l'arbre décisionnel, l'échantillon, rendu douteux en cytofluorimétrie, aurait été analysé et rendu positif par microlymphocytotoxicité. De la même manière, le travail de Pei et al. n'avait montré aucun cas de faux négatif [21].

Concernant la praticabilité de la méthode, plusieurs points sont à discuter. Le choix de l'héparinate de lithium comme anticoagulant a été dicté par la microlymphocytotoxicité qui impose une viabilité cellulaire. Les résultats de la cytofluorimétrie ne sont pas influencés par la nature de l'anticoagulant [11, 15]. Certaines études multicentriques ont même utilisé des anticoagulants différents en fonction des sites [11, 16]. De plus, c'est avec l'héparinate de lithium que sont obtenus les histogrammes les plus stables au cours du temps [15]. À plus long terme pour notre activité de routine, l'héparinate de lithium présente l'avantage de pouvoir réaliser, sur le même prélèvement, la CMF puis la microlymphocytotoxicité en cas de résultat douteux. Dans un but de standardisation et de diminution des interventions humaines pouvant induire des biais (séparation des cellules, lyse manuelle, lavage cellulaire), nous avons utilisé une technique sur sang total couplée à un système de lyse automatique. Le réglage du cytofluorimètre est également automatique à l'aide de billes fluorescentes de calibration. Ce principe est décrit par plusieurs auteurs [11, 12, 17].

Au total, la réalisation du typage B27 nécessite le dépôt manuel de 100 mul de sang total et de 10 mul d'anticorps. Le reste de la manipulation est automatique, l'interprétation du résultat est faite en 30 min par rapport à des seuils d'interprétation constants au cours du temps. La technique peut être insérée, au coup par coup, à n'importe quel moment dans l'activité du laboratoire. De plus, une fois les cellules marquées et fixées, l'analyse peut être différée de 24 à 48 heures. En termes de praticabilité et de standardisation, le typage HLA B27 par cytofluorimétrie semble très supérieur aux deux techniques de reférence. Cependant, l'ensemble des auteurs s'accordent sur l'importance de l'étape de validation. Elle est à conduire dans chaque laboratoire qui doit établir et tester ses propres seuils d'interprétation. Ces derniers dépendent de l'anticorps monoclonal, des réactifs de lyse et des instruments utilisés. Toutefois en utilisant un même lot de billes de calibration et le même protocole, il doit être possible de transférer nos résultats dans d'autres laboratoires.

Enfin, il faut souligner, la nécessité de disposer d'une technique de référence. Que ce soit la microlymphocytotoxicité ou la biologie moléculaire, elle sera utilisée comme confirmation en cas de prélèvement douteux. L'association la plus pertinente semble être constituée par le couplage cytofluorimétrie et biologie moléculaire [14]. Cette dernière est le véritable gold standard puisqu'il s'agit d'un génotypage. Cependant, si les seuils d'interprétation en cytofluorimétrie sont correctement établis les échantillons douteux sont finalement peu nombreux : inférieurs à 1 % dans notre étude en accord avec d'autres travaux [11, 16].

CONCLUSION

En conclusion, outre l'intérêt lié à la réalisation du typage B27, le principal résultat de cette étude illustre la possibilité de s'orienter vers une standardisation des analyses par cytofluorimétrie. En effet, à l'heure actuelle en immunologie, la seule analyse réalisée par cytofluorimétrie, « standardisée » et inscrite à la nomenclature est la numération des sous-populations lymphocytaires T. Il est donc logique et nécessaire d'envisager pour l'avenir de nombreux développements en immunologie cellulaire par cytofluorimétrie : niveaux d'activation cellulaires, tests fonctionnels in vitro, tests de prolifération. Autant de protocoles qu'il sera obligatoire de standardiser pour fournir des résultats exploitables par le clinicien indépendamment des variables liées à la cytofluorimétrie.

REFERENCES

1. Brewerton DA, Caffey M, Ahrt FD, James DCO, Nichols A, Sturroch RD. Ankylosing spondylitis and HLA B27. Lancet 1973 ; 1 : 904-7.

2. Gladman DD, Anhorn KAB, Schachter RK, Mervart H. HLA antigens in psoriasic arthritis. J Rheumatol 1986 ; 13 : 586-92.

3. Benjamin R, Parham P. Guilt by association and ankylosing spondylitis. Immunol Today 1990 ; 4 : 137-42.

4. Lopez de Castro JA. Structure, function, and disease association of HLA B27. Curr Opinion Rheumatol 1994 ; 6 : 371-7.

5. Schaeverbeke T. Spondylarthrite ankylosante. Rev Prat 1999 ; 49 : 1791-6.

6. Amor B, Dougados M, Mijiyawa M. Critères de classification des spondylarthropathies. Rev Rhum Mal Osteoartic 1990 ; 57 : 85-9.

7. Terasaki PI, McClelland JD. Microdroplet assay of human serum cytotoxins. Nature 1964 ; 204 : 998-1000.

8. Kirveskari J, Kellner H, Wuorela M, et al. False-negative serological HLA B27 typing results may be due to altered antigenic epitopes and can be detected by polymerase chain reaction. Br J Rheumatol 1997 ; 36 : 185-9.

9. Steffens-Nakken HM, Zwart G, Van den Bergh FAJTM. Validation of allele-specific polymerase chain reaction for DNA typing of HLA B27. Clin Chem 1995 ; 41 : 687-92.

10. Albrecht J, Müller HAG. HLA B27 typing by use of flow cytofluorometry. Clin Chem 1987 ; 33 : 1619-23.

11. Hulstaert F, Albrecht J, Hannet I, et al. An optimised method for routine HLA B27 screening using flow cytometry. Cytometry 1994 ; 18 : 21-9.

12. Lingenfelter B, Fuller TFC, Hartung L, Hunter J, Wittwer C. HLA B27 screening by flow cytometry. Cytometry 1995 ; 22 : 146-9.

13. Neumüller J, Schwartz DWM, Dauber E, Mayr WR. Evaluation of four monoclonal antibodies against HLA B27 for their reliability in HLA B27 typing with flow cytometry : comparison with the classic microlymphocytotoxic test. Cytometry 1996 ; 26 : 209-15.

14. Bonnaud G, Aupetit C, Preux PM, Cogné M, Drouet M. Optimisation of HLA B27 testing by association of flow cytometry and DNA typing. Clin Rheumatol 1999 ; 18 : 23-7.

15. Orr K, Thomson GTD, Alfa M. Utilization of commercial antisera and flow cytometry in HLA B27 typing. Cytometry 1994 ; 18 : 17-20.

16. Ward AM, Nikaein A. Comparison of monoclonal antibodies for flow cytometric analysis of HLA B27 antigen. Cytometry 1995 ; 22 : 65-9.

17. Reynolds WM, Evans PR, Wilson PJ, Wong WM, Darke C, Smith JL. Automated routine HLA B27 typing by flow cytometry. J Immunol Methods 1996 ; 197 : 1-5.

18. Nickerson CL, Luthra HS, David CS. Role of enterobacteria and HLA B27 in spondylarthropathies : studies with transgenic mice. Ann Rheum Dis 1990 ; 49 : 426-33.

19. Gladman DD, Brubacher B, Buskila D, Langevitz P, Farewell VT. Psoriatic spondylarthropathy in men and women : a clinical, radiographic, and HLA study. Clin Invest Med 1992 ; 15 : 371-5.

20. Feltkamp TEW. HLA B27 and acute anterior uveitis. Current Eye Res 1990 ; 9 : 213-8.

21. Pei R, Arjomand-Shamsai M, Deng CT, Cesbron A, Bignon JD, Lee JH. A monospecific HLA B27 fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal antibody for rapid simple and accurate HLA B27 typing. Tiss Antigens 1993 ; 41 : 200-3.

22. Colombani J. HLA, le complexe majeur de présentation et d'histocompatibilité humain, fonctions immunitaires et applications médicales. Colombani J Éd. John Libbey Eurotext, Paris, 1993.

23. Wuorela M, Jalkanen S, Kirveskari J, Laitio P, Granfors K. Yersinia enterocolitica serotype O : 3 alters expression of serologic HLA B27 epitopes on human monocytes. Infect Immun 1997 ; 65 : 2060-6.