Dynamic study of anti-VIH antibodies avidity with cellular immune restoration under Haart

ARTICLE

La mesure de l'avidité des anticorps est utilisée depuis quelques années comme paramètre complémentaire de l'analyse sérologique des immunoglobulines (Ig) G, A et M. Elle est très utile au diagnostic des primo-infections virales [1], parasitaires [2] et bactériennes [3] dans le cadre des pathologies infectieuses persistantes ou résurgentes. Elle sert à apprécier l'ancienneté de l'infection et donc à distinguer les primo-infections des réinfections ou des réactivations dont l'interprétation, à la seule vue des IgM et des IgG et en l'absence de résultats antérieurs, reste délicate. Seule la séroconversion permet en effet de confirmer la primo-infection. La mesure de l'avidité a été décrite pour les infections qui présentent un risque de transmission maternofœtale telles que la rubéole [4-6] et la toxoplasmose [7, 8], mais aussi des infections chroniques virales à cytomégalovirus (CMV) [9], au virus de l'immunodéficience acquise humaine [10] et au virus de l'hépatite C [11].

L'étude de l'avidité des anticorps permet aussi d'évaluer la qualité de la maturation de la réponse humorale à un stimulus vaccinal (virus de la rubéole) [12]. D'autres études ont été effectuées chez des patients immunodéprimés après transplantation d'organes (CMV) [13], en comparaison avec des sujets immunocompétents en réponse à une infection naturelle. Elles ont permis d'observer un retard de la maturation de la réponse humorale (6 à 12 mois versus 3 à 6 mois), voire une absence de maturation. Chez les sujets infectés par le VIH, une diminution de l'avidité des anti-p24 est observée lors de l'immunodépression en stade sida [14].

Nous avons étudié sur une période de quatre ans l'évolution de l'avidité des anticorps anti-VIH de patients infectés au stade de sida sévère, en relation avec un gain de lymphocytes CD4 observé sous trithérapie antirétrovirale efficace (Haart). La réponse immunitaire évolue avec une réduction transitoire de l'avidité de ces anticorps anti-VIH (IgG), quelques mois après la mise sous Haart.

Matériels et méthodes

Patients

L'étude a porté de manière rétrospective sur 14 patients infectés par le VIH. Onze patients étaient sévèrement immunodéprimés en stade sida (C3), selon la classification du CDC d'Atlanta, sous trithérapie (ou Haart pour highly active antiretroviral therapy) comprenant deux analogues nucléosidiques et une antiprotéase : saquinavir (6), ritonavir (8) ou indinavir (2). Ces patients ont été sélectionnés selon leur immunité (taux initial de CD4 inférieur à 100 cellules/mm³) et les critères d'efficacité thérapeutique : augmentation du taux des lymphocytes CD4 sous Haart (gain de 200 à 300 cellules/mm³) et diminution de la charge virale et stabilisation à une virémie basse (inférieure à 2 log/ml). Les trois autres patients, constituant notre groupe témoin, étaient modérément immunodéprimés et non traités (2 en stade A2 et 1 en stade B2) et ils présentaient une charge virale modérée de 4 log/ml et un nombre de lymphocytes CD4 stable, entre 300 à 400 par mm³. Le suivi bioclinique a été effectué : trimestriellement pour la numération des lymphocytes CD4 et la mesure de la charge virale, tous les 3 à 6 mois pour la mesure de l'avidité. Tous les prélèvements de sang sur EDTA, réalisés pour les mesures de la charge virale prospectives et rétrospectives de l'avidité des anticorps anti-VIH, ont été rapidement centrifugés, puis aliquotés à 1 ou 2 ml de plasma pour congélation à ­ 80 °C.

Numération des lymphocytes CD4 et CD8

Le nombre de lymphocytes CD4 et CD8 est déterminé par cytométrie en flux. Un échantillon de 100 mul de prélèvement sanguin sur EDTA est incubé pendant 20 min avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti-CD4 marqués au FITC et anti-CD8 conjugués à la phycoérythrine (Beckman-Coulter, Villepinte, France). Après lyse acide, neutralisation et fixation à l'aide d'un préparateur Q-Prep (Beckman-Coulter), les cellules sont analysées par un cytomètre en flux Facscan (Becton-Dickinson, Le Pont-de-Claix, France). Les résultats sont exprimés en nombre de cellules CD4⁺ CD8^­ (lymphocytes CD4⁺) et CD4^­ CD8⁺ (lymphocytes CD8⁺) présentes par microlitre de sang.

Quantification de l'ARN du VIH1 ou mesure de la charge virale plasmatique

L'ARN viral est quantifié après extraction automatique et amplification-détection avec le kit Nuclisens HIV-RNA QT selon les recommandations du fabricant (Organon Teknika, Fresnes, France). En bref, 2 ml de plasma sont lysés pendant 10 min et l'ARN en est extrait sur colonne de silice. L'ARN est coamplifié avec trois ARN utilisés comme témoins internes à des concentrations croissantes, chacun étant hybridé à des sondes spécifiques marquées dont le signal est mesuré par électrochimioluminescence. Ce signal est rapporté à la courbe obtenue par les trois calibrateurs internes et exprimé en nombre logarithmique de copies d'ARN par millilitre de plasma. Le seuil de détection varie selon le volume de plasma à analyser (seuil à 1,6 log/ml pour 2 ml de plasma).

Détermination de l'avidité des anticorps anti-VIH

Le test de mesure de l'avidité est basé sur l'action d'un agent dénaturant des protéines (la guanidine à 1 M) qui, à concentration prédéfinie, inhibe la formation de la liaison antigène-anticorps de faible avidité. Cette inhibition sera d'autant plus importante que l'avidité des liaisons est faible. La détermination de l'avidité des anticorps utilise un test de détection des anticorps de type IgG anti-VIH1 et 2 (Axsym HIV 1 + 2, Abbott Diagnostics, Rungis, France), avec une procédure de traitement préalable du sérum. Chaque sérum est dilué au 1/10^e, soit en présence de la guanidine 1 M (dosage des anticorps selon leur avidité), soit dans un tampon PBS (dosage des anticorps totaux) et incubé 10 min à température ambiante. Les deux mesures sont réalisées en parallèle sur l'automate Axsym, selon les recommandations du fabricant. Les signaux obtenus sur l'Axsym permettent de calculer un index d'avidité (AI), exprimé en pourcentage. Cet index est égal au rapport des densités optiques de l'échantillon (e) en présence du dénaturant d (DO_{e + d}) et en l'absence du dénaturant (DO_e), selon la formule suivante : AI = (DO_{e + d}/DO_e) x 100. Plus ce pourcentage est bas, plus l'avidité des anticorps est faible. En effet, une DO_{e + d} basse est le reflet d'une faible formation de complexes antigène-anticorps en présence de dénaturant et donc d'une faible avidité des anticorps pour les antigènes testés.

Analyses statistiques

Nous avons utilisé la méthode de Wilcoxon pour l'étude comparative de faible échantillonnage. Ce test a été appliqué à l'étude des variations de l'avidité en prenant compte, pour chacun des patients, de la valeur initiale la plus haute et la valeur ultérieure la plus basse. Ce test est significatif pour une valeur de p inférieure à 0,05.

Résultats

Critères initiaux des patients étudiés

Les valeurs moyennes prennent en compte une valeur par patient tous les 4 mois la première année du traitement et tous les 6 mois pour les trois années suivantes. Les caractéristiques moyennes initiales des 11 patients en immunodépression sévère avant la mise sous Haart sont décrites dans le tableau 1 et des 3 patients en immunodépression modéré du groupe témoin, dans le tableau 2. L'avidité avant la mise sous traitement apparaît en peu plus faible dans le groupe des patients très immunodéprimés (sida) par apport au groupe témoin (84 % versus 100 %). Cette différence est probablement due à la présence de 2 patients au stade sida ayant une avidité basse (39 et 57 %).

Il a été observé une différence significative de la virémie mesurée avant la mise sous Haart et celle mesurée à la fin du suivi bioclinique sous Haart dans le groupe des patients en stade sida (DELTACV de 3,2 log/ml). Une variation parallèle du nombre de lymphocytes a été observée (DELTACD4 270 cellules/mm³ et DELTACD8 440 cellules/mm³), alors que l'avidité n'est pas modifiée (DELTAAI 1 %). En effet, la population des lymphocytes CD8 a doublé pendant cette période et celle des lymphocytes CD4 décuplé. En revanche, les populations lymphocytaires tendent à diminuer dans le groupe témoin et l'avidité n'est pas modifiée dans ce groupe.

Cinétiques de l'ARN du VIH et des cellules CD4 comparées à celle de l'avidité des anticorps anti-VIH (figure 1)

Il est observé un profil cinétique général montrant une diminution nette et rapide de la charge virale, une remontée rapide (M1-M4), et puis progressive (M5-M42) du nombre de cellules lymphocytaires CD4 et une diminution secondaire et transitoire de l'avidité (­ 20 %) après 5 à 8 mois pour l'ensemble des 11 patients en stade sida sévère, y compris les deux patients ayant une avidité initialement basse (11 et 34 %). Cette diminution est statistiquement très significative pour chacun des patients (p < 0,0001). En revanche, le groupe témoin de 3 patients non traités montre une avidité stabilisée à 100 %, un nombre de lymphocytes CD4 relativement stable (allant de 300 à 400 cellules/mm³ de sang) et une charge virale variant peu au cours du temps (autour de 3 à 4 log/ml). Dans les deux groupes, nous n'observons pas de variation significative du taux d'anticorps lors du suivi des patients, indépendamment de celle de l'avidité.

Discussion

Nous observons dans cette étude une réduction transitoire de l'avidité des anticorps anti-VIH sous traitement antirétroviral efficace (Haart). Nous pensons que ce phénomène humoral est la traduction d'une réponse immunitaire fonctionnelle anti-VIH. Le développement de la réponse immunitaire humorale spécifique d'un antigène protéique est conditionné par le déroulement correct d'un dialogue entre la population lymphocytaire B et T auxiliaire capables de reconnaître l'antigène. Ce dialogue est médié par des relations directes telles que la liaison du CD40 de la cellule lymphocytaire B avec son ligand apparu sur le lymphocyte auxiliaire, et par les médiateurs chimiques solubles, les cytokines. Ils conduisent à la prolifération et à la différenciation des clones lymphocytai-res B [15], qui aboutissent à la sécrétion en quantité importante d'immunoglobulines (les anticorps) et à la mise en place d'une mémoire immunitaire. L'efficacité de la réponse humorale s'accroît au cours du temps par des mécanismes de maturation qui vont affiner de façon parallèle et indépendante les propriétés effectrices et de reconnaissance des anticorps. La commutation isotypique, qui permet le passage des IgM vers les IgG, IgA et IgE de même spécificité antigénique, correspond au phénomène étudié lors de la recherche d'une séroconversion. D'autre part, l'apparition de mutations somatiques dans la région variable de ces anticorps va en modifier l'affinité vis-à-vis de l'antigène. Seuls seront préservés de l'apoptose les clones B dont les immunoglobulines sont toujours ou encore capables de reconnaître l'antigène ; il se produit ainsi une sélection qui tend à accroître l'avidité de la réponse des anticorps [16]. Depuis quelques années, cet aspect de la maturation de la réponse humorale est l'objet d'un intérêt croissant dans le suivi sérologique des patients.

C'est ainsi qu'a été observé un retard de la maturation des anticorps anti-CMV en cas de primo-infection chez des patients immunodéprimés après une greffe de moelle [13] ; le déficit cellulaire T CD4⁺ induit ne permettrait pas d'apporter l'aide nécessaire à l'accroissement de l'affinité des clones B spécifiques du CMV. Dans le cas du VIH, les études précédentes [14, 17] font apparaître deux données essentielles : une augmentation progressive cellulaire et un maintien stable de l'avidité des anticorps anti-p41 chez quelques patients testés au début de la maladie ; une diminution de l'affinité des anti-p24 et des anti-p17 amorçant l'immunodépression du stade sida, la maturation des anticorps étant par ailleurs très inégale d'un individu à l'autre au cours des phases précédant l'infection chronique. Au-delà des valeurs globales indiquées dans le tableau 1, l'échantillonnage des 11 patients que nous avons étudiés se répartit en 9 sujets présentant une forte avidité anti-VIH et 2 plus faibles. Notre test étant global, il ne permet pas de distinguer les différents antigènes précisément reconnus, mais la réponse des deux derniers patients pourrait être dirigée de façon prédominante contre l'antigène p24, qui montre la plus forte baisse d'avidité lors du stade sida [14]. Cependant, l'évolution des données biologiques étant chez ces 2 patients similaires aux 9 autres, il n'a pas été jugé nécessaire de les dissocier de l'ensemble.

L'amélioration des patients sous trithérapie est mise en évidence par la diminution de la charge virale, le gain de lymphocytes CD4⁺ et, en parallèle, celui des lymphocytes CD8⁺. La trithérapie n'agit pas seulement en réduisant la virémie, mais elle permet aussi une restauration immunitaire par un gain cellulaire. Cependant, en dehors des cellules CD4⁺ qui continuent à progresser, cette amélioration apparaît principalement acquise dans la première moitié de la période d'observation ; se pose ensuite la question de l'éventuelle installation progressive d'un nouvel état d'équilibre entre le virus et les lymphocytes. Les variations de l'avidité doivent être interprétées dans ce contexte. La baisse transitoire de l'avidité observée au cours de la première année du traitement peut surprendre dans la mesure où l'émergence d'anticorps de forte affinité est habituellement assimilée à une évolution favorable de l'infection [13]. Dans le cas de l'infection par le VIH, cette diminution globale de l'avidité ne correspond pas à une évolution naturelle de la maladie qui est dans cette étude freinée par le traitement. De fait, les 3 patients non traités conservent une avidité maximale. Si l'on se réfère à la physiologie explicitée au début de cette discussion, il apparaît en réalité que cette diminution de l'affinité des anticorps anti-VIH ne peut traduire qu'une modification ou un élargissement du répertoire lymphocytaire B au profit des clones naïfs. Elle s'accorde ainsi naturellement avec les données récapitulées par
Roederer : une augmentation du nombre de cellules B et un élargissement du répertoire T avec accroissement des cellules naïves [18]. Cependant, cette diminution n'est pas permanente. La remontée de l'avidité est associée dans cette étude à la baisse de la virémie et donc à une réduction antigénique favorisant la sélection de clones lymphocytaires B les plus affins. Dans ces conditions, c'est surtout le caractère transitoire de cette diminution de l'avidité des anticorps anti-VIH qui doit être exploré au regard du caractère fonctionnel des lymphocytes CD4 à reconnaître l'infection par le VIH. Ainsi, la mesure de l'avidité anti-VIH permettrait d'apprécier cette activité fonctionnelle lors de la restauration des cellules CD4 chez les patients sous Haart. Cependant, les données dont nous disposons ici sont insuffisantes pour étayer une quelconque hypothèse. Elles nécessitent d'être complétées par une étude des marqueurs membranaires présents sur les cellules B pour en approcher le statut, l'exploration de leur capacité à reconnaître les antigènes du VIH et l'analyse du rôle des lymphocytes T CD4⁺, au travers notamment de leur production de cytokines.

CONCLUSION

Remerciements. Nous remercions O. Blanchet pour sa participation à l'étude lymphocytaire, J.-M. Senet pour son aide précieuse à la discussion de cette étude, B. Vielle pour sa collaboration à l'étude statistique et Mmes Baillou-Beaufils et Juhel des Laboratoires Abbott pour leur soutien logistique.

Article reçu le 20 mai 2000, accepté le 11 juillet 2000.

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