ARTICLE
La maladie de Willebrand est la pathologie hémorragique héréditaire
la plus fréquente avec une prévalence mondiale supérieure
à 1 % [1]. Elle est due à un déficit en facteur Willebrand
(vWF), protéine multimérique complexe qui joue un rôle
clé à la fois dans l'hémostase primaire et dans la
coagulation : d'une part, le vWF est le médiateur de l'adhésion
des plaquettes au sous-endothélium et de leur agrégation
à taux de cisaillement élevés, d'autre part, il est
le transporteur plasmatique du facteur VIII de la coagulation [2]. La
classification de la maladie de Willebrand [3] oppose deux types de déficits
en vWF : un déficit quantitatif qui peut être partiel (type
1) ou total (type 3) et un déficit qualitatif (variants de type
2) regroupant plusieurs anomalies fonctionnelles. Dans de très
rares cas, la maladie de Willebrand n'est pas héréditaire
mais acquise, le plus souvent dans un contexte de pathologie immunologique
et/ou néoplasique [4].
L'extrême hétérogénéité clinique
de la maladie de Willebrand rend indispensable un diagnostic biologique
précis du déficit afin d'adapter au mieux la prise en charge
thérapeutique. Même s'il est clairement établi que
la concentration plasmatique de l'antigène du vWF (vWFAg) est soumise
à de nombreuses variations physiopathologiques (ethnie, âge,
statut hormonal, inflammation, groupe sanguin [5]...), sa mesure reste,
en association avec le dosage de l'activité co-facteur de la ristocétine
(vWFRCo), un test spécifique indispensable au diagnostic biologique
de la maladie de Willebrand. Le taux de vWFAg est diminué dans
les déficits quantitatifs (variable dans le type 1 et indétectable
dans le type 3) ; il peut être dans les limites de la normale dans
le type 2. Le dosage du vWFAg est classiquement réalisé
grâce à des méthodes immuno-enzymatiques (Elisa) [6,
7]. Ces méthodes conventionnelles nécessitent une calibration
pour chaque série et des incubations de plusieurs heures, et ne
sont par conséquent adaptées ni au dosage unitaire ni à
l'urgence. Pour pallier ces inconvénients, de nouvelles méthodes
ont été décrites : l'immunofluorescence (Elfa) et
l'immunoturbidimétrie (Liatest). La technique STA®-Liatest®
vWF (Diagnostica Stago) est basée sur l'agglutination de microparticules
de latex recouvertes d'anticorps polyclonaux spécifiques en présence
du vWF du plasma, mesurée par turbidimétrie sur l'automate
STA.
Nous avons évalué les performances analytiques de la méthode
STA®-Liatest® vWF et l'avons comparée
à la méthode de référence Elisa (Asserachrom®
vWF).
Matériel et méthodes
Sujets testés
Tous les sujets testés ont été inclus dans cette
étude après consentement éclairé, conformément
à la déclaration d'Helsinski et trois groupes principaux
ont été étudiés : 50 sujets normaux (volontaires
sains), 13 hémophiles A et 100 patients atteints de différents
types de maladie de Willebrand, héréditaire (n = 86) ou
acquise (n = 14). Les principales caractéristiques phénotypiques
des patients atteints d'une forme héréditaire sont résumées
dans le tableau 1 : 43
patients ont un déficit quantitatif en vWF (36 type 1 et 6 type
3) et 44 un déficit qualitatif (14 type 2A, 9 type 2M, 10 type
2B et 11 type 2N). Parmi les 14 cas de maladie de Willebrand acquise,
10 sont associés à une pathologie identifiée : 4
gammapathies monoclonales bénignes, 1 myélome, 3 maladies
de Waldenström, 1 leucémie lymphoïde chronique et 1 leucémie
myéloïde chronique.
Le sang a été prélevé au pli du coude par
ponction veineuse sur citrate de sodium 3,8 %. Le plasma pauvre en plaquettes
a été obtenu après deux centrifugations consécutives
à 2 500 g pendant 15 min et des aliquotes ont été
conservées à 20 °C jusqu'au dosage.
Description de la méthode STA®-Liatest®
vWF
La technique STA®-Liatest® vWF est une
méthode immunoturbidimétrique adaptée sur les appareils
de la ligne STA (STA® et STA® compact) et
son principe est le suivant : des microparticules de latex sur lesquelles
sont fixés des anticorps polyclonaux de lapin anti-vWF humain (immunoglobulines
entières) sont incubées en présence du plasma à
tester. L'agglutination des particules de latex augmente la turbidimétrie
du mélange réactionnel de façon proportionnelle à
la concentration de vWFAg présent dans l'échantillon. La
variation d'absorbance est mesurée à 540 nm pendant 260
s.
La calibration est réalisée automatiquement sur le STA
à l'aide de 4 dilutions du STA®-vWF Calibrator titré
contre le 3e Etalon Standard International [8]. Le tampon seul
et la dilution au 1/2 du standard correspondent respectivement aux points
0 et 100 %. La calibration est validée à chaque série
par le passage de 2 contrôles de qualité multiparamétriques
STA®-Liatest® : Control N (vWFAg : 73-85
UI/dl) et Control P (vWFAg : 29-36 IU/dl).
La procédure utilisée est celle préconisée
par le fabricant : les échantillons à tester sont déposés
purs dans le STA® (version 6) qui adapte la dilution en
fonction de la gamme de linéarité. Le taux de vWFAg des
échantillons s'affiche en temps réel en %, correspondant
à une concentration exprimée en UI/dl. Les réactifs
du coffret STA®-Liatest® vWF sont conservés
à + 4 °C.
Évaluation analytique de la méthode
STA®-Liatest® vWF
Cette évaluation a été réalisée selon
les recommandations de la SFBC. Ont été étudiées
: reproductibilité intra- et inter-essais, stabilité de
la calibration, limite de détection ainsi que sensibilité
et spécificité analytiques. La reproductibilité intra-essai
a été étudiée à 4 concentrations différentes
de vWFAg obtenues à partir d'un même plasma normal utilisé
pur et dilué en plasma immunodéplété en facteur
VIII et en vWF (déficient VIII Stago). Chaque concentration a été
mesurée en simple détermination, 21 fois consécutives
le même jour. La reproductibilité inter-essais a été
étudiée à 2 concentrations différentes de
vWFAg correspondant aux contrôles STA®-Liatest®
N et P testés en simple détermination en 8 mesures quotidiennes,
pendant 10 jours consécutifs. La stabilité de la calibration
a été évaluée de manière rétrospective
par recalcul des valeurs des contrôles N et P obtenues dans le cadre
de l'étude de la reproductibilité inter-essais (sur 10 jours),
par rapport à l'étalonnage du premier jour. La limite de
détection de la méthode est établie à partir
de mesures répétitives du tampon. La sensibilité
est définie par le rapport de la variation du signal mesuré
par unité de taux de vWFAg.
La méthode STA®-Liatest® vWF a
été comparée à la technique immuno-enzymatique
de référence réalisée à l'aide du coffret
Elisa Asserachrom® vWF (Diagnostica Stago) dont les plaques
de microtitration sont sensibilisées avec des fragments F(ab')2
d'anticorps polyclonaux de lapin anti-vWF humain similaires à ceux
utilisés dans la technique Liatest. Les échantillons plasmatiques
(sujets normaux, hémophiles A et patients atteints de maladie de
Willebrand) ont été testés en double par les deux
méthodes, réalisées le même jour à partir
du même aliquote.
Résultats
Performances analytiques de la méthode
STA®-Liatest® vWF
Le tableau 2 synthétise
les différentes valeurs témoignant de la reproductibilité
de la méthode STA®-Liatest® vWF.
La reproductibilité intra-essai montre un coefficient de variation
(CV) compris entre 2 et 9,6 %. Les CV de la reproductibilité inter-essais
sont respectivement de 3,1 et de 5,8 % pour les contrôles N et P.
La stabilité de la calibration évaluée avec un
recul de 10 jours montre un CV de 3,1 % pour le contrôle N (vWFAg
: 75-85 UI/dl, moyenne ± DS : 78,6 ± 2,4) et de 2,7 % pour le
contrôle P (vWFAg : 30-33 UI/dl, moyenne ± DS : 31 ± 0,8).
La limite de détection est de 2 UI/dl et la sensibilité
de 6 UI/dl. La méthode est linéaire jusqu'à 105 UI/dl.
L'étude de la spécificité analytique met en évidence
une surestimation du taux de vWF en présence de titres élevés
de facteur rhumatoïde dans le plasma (cf. infra).
Corrélation à la méthode
Elisa Asserachrom® vWF
Le tableau 3 résume
les valeurs extrêmes, les moyennes, les écarts-types (DS)
et l'analyse par régression linéaire des résultats
obtenus avec les 163 plasmas par les deux techniques de dosage du vWFAg.
Chez les sujets normaux et les hémophiles A (n = 63), les valeurs
du vWFAg plasmatique sont similaires en Elisa et en Liatest montrant,
pour des valeurs normales et élevées, une droite de corrélation
d'équation y = 0,94 x + 11,89 (r = 0,95).
Chez les patients atteints de maladie de Willebrand tous types confondus
(n = 100), les deux méthodes sont bien corrélées
dans la majorité des cas. Cependant, compte tenu du seuil de détection
(2 UI/dl), la technique Liatest ne permet pas de quantifier exactement
le taux de vWFAg chez les patients de type 3 : le taux mesuré dans
notre étude chez 6 patients est évalué entre 2 et
6 UI/dl alors qu'il est inférieur à 1 UI/dl en Elisa (tableau
3). De plus, chez trois patients (un type 1 et deux formes acquises
de maladie de Willebrand), le dosage du vWFAg est nettement surestimé
en Liatest (respectivement 135, 83 et 81 UI/dl) par rapport à l'Elisa
(respectivement 30, 16 et 35 UI/dl). Ces trois patients ont un titre élevé
de facteur rhumatoïde (respectivement 50, 100 et 80 UI/dl), associé
soit à une hépatite C chronique post-transfusionnelle avec
cryoglobulinémie, soit à une gammapathie monoclonale (tableau
4). En excluant les six patients de type 3 et les trois patients
« discordants » de l'analyse statistique, la corrélation
entre l'Elisa Asserachrom® vWF et le STA®-Liatest®
vWF est définie par une droite de regression d'équation
y = 0,90 x + 3,00 ; r = 0,97 chez les patients atteints de maladie de
Willebrand (n = 91) (tableau 3)
et y = 1,01 x + 0,70 ; r = 0,98 chez l'ensemble des sujets normaux et
des patients atteints de maladie de Willebrand ou d'hémophilie
A (n = 154) (figure 1).
Commentaires
Historiquement, plusieurs techniques immunologiques permettent de mesurer
le vWFAg plasmatique : l'électro-immunodiffusion (Laurell) [9],
peu sensible et surestimant le taux de vWFAg dans les types 2, a été
remplacée par l'immunoradiométrie (Irma) [10] et l'immuno-enzymologie
(Elisa) [7]. Cette dernière est la technique la plus pratiquée
dans les laboratoires de routine et reste la méthode de référence.
L'Elisa est une technique sensible et spécifique mais elle présente
trois principaux inconvénients : elle est de réalisation
longue, non automatisée et son mode de conditionnement n'est pas
adapté aux dosages unitaires ce qui en limite l'utilisation dans
un contexte d'urgence. Pour pallier ces inconvénients, Biomérieux
a développé un système Elfa rapide et automatisé,
le VIDAS® vWF, qui permet des dosages unitaires du vWFAg
en 35 min [11]. Plus récemment, une technique d'immunoagglutination,
le STA®-Liatest® vWF, a été
commercialisée par Diagnostica Stago. Cette nouvelle méthode
également adaptée aux dosages unitaires, présente
l'avantage d'être encore plus rapide (8 min) et surtout d'être
utilisable sur des automates d'hémostase de routine multiparamétriques
(STA® et STA® compact).
La reproductibilité intra- et inter-essais est excellente pour
des concentrations plasmatiques de vWFAg normales et pathologiques et
la stabilité de la calibration autorisera prochainement l'utilisation
de réactifs précalibrés. Des études préliminaires
réalisées par le fabricant ont montré qu'il n'y avait
pas d'effet de zone jusqu'à 800 UI/dl, ni d'interférence
avec l'hémoglobine, la bilirubine et les héparines jusqu'à
des concentrations respectives de 5 g/l, 150 mg/l et 2 UI/ ml. Dans la
fiche technique, il y a une mise en garde en cas de plasma particulièrement
turbide où le taux de vWFAg peut être sous-estimé
ou de plasma contenant un facteur rhumatoïde où le taux de
vWFAg est au contraire surestimé, ce que notre étude met
bien en évidence.
La corrélation de la méthode STA®-Liatest®
vWF à la technique Elisa de référence est globalement
excellente pour une gamme de vWFAg allant de 7 à plus de 200 UI/dl
(n = 154), puisque la droite de régression montre une pente de
l'ordre de 1, une ordonnée à l'origine presque nulle et
un r à 0,98. Dans la zone des valeurs basses (majorité des
patients atteints de maladie de Willebrand), la corrélation est
également très satisfaisante dans les types 1 et 2 de maladie
de Willebrand. Fait intéressant, la technique Liatest ne semble
pas influencée par la structure multimérique du vWF puisque
les variants de type 2A (n = 14) et 2B (n = 10), déficitaires en
multimères de haut poids moléculaire du vWF, ont des résultats
concordants avec l'Elisa.
Notre étude met cependant en évidence deux limites au
dosage du vWFAg par la technique STA®-Liatest®
vWF : d'une part, sa sensibilité de 6 UI/dl est inférieure
à celle de l'Elisa (0,5 UI/dl) et ne permet donc pas l'étude
des rares déficits sévères en vWF (type 3 de maladie
de Willebrand). D'autre part, l'interférence des facteurs rhumatoïdes
qui réagissent avec le fragment Fc des immunoglobulines totales
du Liatest et non avec les fragments F(ab')2 de l'Elisa pouvant entraîner
une surestimation importante du vWFAg.
CONCLUSION
Notre étude montre que le STA®-Liatest®
vWF est une nouvelle technique de dosage du vWFAg reproductible et parfaitement
corrélée à la méthode Elisa de référence.
Elle présente, de plus, l'avantage d'être automatisée
sur les appareils multiparamétriques de la ligne STA ce qui permet
une rapidité d'exécution et un dosage unitaire adaptés
à l'urgence. Néanmoins, sa sensibilité inférieure
à celle de l'Elisa en limite l'intérêt dans l'étude
des rares déficits sévères en vWF (type 3). De même,
sa moindre spécificité requiert une vigilance particulière
en présence d'auto-anticorps de type facteur rhumatoïde. Dans
tous les cas, la confrontation du vWFAg au vWFRCo demeure indispensable
et impose, en cas de discordance, de contrôler le vWFAg à
l'aide d'une technique Elisa ou Elfa.
Remerciements. Les auteurs tiennent à remercier
Christine Thirion (Diagnostica Stago) ainsi que Sylvaine Savigny (Laboratoire
d'hématologie, Clamart) et Catherine Badaud (Laboratoire d'hématologie,
Nantes) pour l'aide qu'elles ont apportée à cette étude.
Article reçu le 16 janvier 1999, accepté le 20 février
1999.
REFERENCES
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au traitement. Hématologie 1995 ; 3 : 199-208.
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4. Tifferi A, Nichols WL. Acquired von Willebrand disease : concise
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1997 ; 103 : 536-40.
5. Gill JC, Endres-Brooks J, Bauer PJ, Marks WJ, Montgomery RR.
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Blood 1987 ; 69 : 1691-5.
6. Mazurier C, Parquet-Gernez A, Goudemand M. The assay of factor
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7. Ingerslev J. A sensitive Elisa for von Willebrand factor (vWF
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VIII-related activities. Thromb Haemost 1983 ; 50 : 690-6.
9. Zimmerman TS, Ratnoff OD, Powell AE. Immunologic differenciation
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J Clin Invest 1971 ; 50 : 244-54.
10. Girma JP, Ardaillou N, Meyer D, Lavergne JM, Larrieu MJ.
Fluid phase immunoradiometric assay for the detection of qualitative abnormalities
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11. Pittet JL, Barbalat V, Sanvert M, Villard C, Jorieux S, Mazurier
C. Evaluation of a new atomated Elisa test for von Willebrand factor using
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