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Capillary electrophoresis with the Paragon CZE 2000® : evaluation and comparison with the gel electrophoresis system Hydrasys Hyrys® for serum protein electrophoresis and monoclonal component typing


Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Number 3, 337-44, Mai - Juin 1999, Articles originaux


Résumé  

Author(s) : F. Godey, M. Ropert, A. Bouasria, C. Lucas-Clerc, L. Guenet, N. Savoure, A. Le Treut.

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ARTICLE

L'électrophorèse capillaire est une technique de séparation électrocinétique dans un tube de faible diamètre interne (< 100 microns) rempli d'un électrolyte. Par de nombreux aspects elle se présente comme un intermédiaire entre l'électrophorèse classique et la chromatographie liquide [1]. Initialement réservée aux laboratoires de recherche, cette technique analytique très performante a suscité un intérêt dans le domaine de l'analyse biologique [2-4]. Le Paragon CZE 2000® (Beckman France) qui utilise le principe de l'électrophorèse capillaire en zone libre est un système entièrement automatisé depuis le prélèvement de l'échantillon (en tube primaire ou en godet) jusqu'à l'édition des résultats. Il permet actuellement de réaliser les électrophorèses des protéines sériques, et le typage des immunoglobulines monoclonales sériques, selon un procédé d'immunosoustraction.

Dans ce travail, nous exposons les performances, les avantages et les inconvénients observés lors de l'utilisation du Paragon CZE 2000 pour la réalisation des électrophorèses des protéines sériques et le typage des immunoglobulines monoclonales sériques. Les résultats obtenus sont comparés avec ceux fournis par le système Hydrasys Hyrys® (Sébia, Issy-les-Moulineaux) dont l'évaluation a déjà montré qu'il s'agit d'un système fiable, qui standardise la réalisation d'électrophorèse sur gel d'agarose [5].

Matériels et méthodes

Appareillage

* Le système Paragon CZE 2000

Les principaux éléments du système sont la tour, le carrousel et la console de travail. La tour qui correspond à la partie analytique du système comprend 7 capillaires de 40 mm de diamètre interne et de 20 cm de longueur, 7 faisceaux de fibres optiques avec détecteurs UV, des barrettes de tampon et de lavage. Chaque extrémité de capillaire plonge dans une cupule remplie de tampon basique. L'échantillon préalablement dilué est injecté à l'extrémité anodique. Les protéines sont séparées dans le capillaire soumis à une tension de 8 à 10 kV, puis sont directement détectées à 214 nm lors du passage dans la fenêtre de lecture. Le carrousel a une capacité de 10 secteurs échantillons (avec 7 tubes par secteurs) soit une capacité de chargement de 70 électrophorèses ou de 10 immunosoustractions. La cadence de l'automate est de 60 électrophorèses par heure ou 6 à 8 immunosoustractions par heure.

Un logiciel avec menu sous environnement Windows Microsoft permet l'exploitation des résultats du Paragon CZE 2000 et propose au choix soit l'électrophorèse des protéines sériques, soit l'immunosoustraction, le logiciel Stripe permet le traitement des résultats.

La séparation électrophorétique des protéines sériques réalisée dans le capillaire individualise les 5 fractions : albumine, alpha-1-globulines, alpha-2-globulines, bêtaglobulines (en séparant les bêta-1 et bêta-2) et les gammaglobulines. Le Paragon CZE 2000 réalise le typage des immunoglobulines monoclonales selon le principe de l'immunosoustraction, qui reprend celui de l'immunofixation mais en inversant les étapes. Il comporte d'abord une immunoprécipitation de l'échantillon dans 5 cupules remplies de billes de sépharose, supportant respectivement les spécificités anti-gamma, anti-alpha, anti-mu, anti-kappa et anti-lambda. Après 4 mn d'incubation du mélange échantillon-sépharose-immunsérum, le complexe antigène-anticorps formé précipite au fond de la cupule par sédimentation et les 5 surnageants plus une dilution de l'échantillon servant de référence sont prélevés et injectés dans 6 capillaires différents, où se font simultanément les séparations électrophorétiques. De l'examen des 6 électrophorégrammes de l'échantillon traité, on peut déduire le typage de l'immunoglobuline monoclonale. Sa spécificité correspond en effet à celle de l'immunsérum ayant entraîné la disparition du pic monoclonal par le processus d'immunosoustraction. L'utilisation de barrettes prêtes à l'emploi contenant les antisérums spécifiques contribue à l'automatisation complète du typage des dysglobulinémies sur le Paragon CZE 2000.

* Le système Hydrasys Hyrys

Il se compose d'un dispositif de migration (Hydrasys) et d'un intégrateur (Hyrys). Le dispositif de migration comprend un module de migration/séchage ou incubation, un module de coloration/séchage, un écran avec clavier de commande. La distribution des échantillons est réalisée manuellement sur un masque applicateur ; les échantillons sont ensuite déposés sur un gel d'agarose placé au préalable dans le module de migration. Pour la réalisation des immunofixations, la migration est suivie du dépôt manuel des antisérums spécifiques. Une fois séché, le gel est transféré dans le module de coloration puis intégré dans le lecteur Hyrys.

Répétabilité et reproductibilité

Afin d'étudier la répétabilité du Paragon CZE 2000, cinq sérums ont été aliquotés. Le sérum n° 1 avait un tracé électrophorétique normal, le sérum n° 2 présentait une augmentation des alpha-1-globulines, le sérum n° 3 une augmentation des alpha-2 et bêtaglobulines, le sérum n° 4 une hypoalbuminémie et une augmentation polyclonale des gammaglobulines, le sérum n° 5 un pic monoclonal dans les gammaglobulines.

Deux sérums (n° 6 et n° 7) ont été aliquotés et congelés à ­ 20 °C. Une électrophorèse du même échantillon a été réalisée chaque jour pendant 9 jours à partir d'une aliquote décongelée afin d'étudier la reproductibilité du système.

Sensibilité analytique

Nous avons choisi 3 sérums avec des pics monoclonaux : sérum A avec un pic au niveau des bêtaglobulines se superposant au bêta-2-globulines ; sérum B avec un pic monoclonal entre les bêta-et gammaglobulines, dans cette zone le fond polyclonal est peu intense car la migration des IgG polyclonales est plus cathodique ; sérum C avec un pic au niveau des gammaglobulines sur un fond polyclonal normal. Ces trois sérums ont été dilués du 1/2 au 1/128e dans un sérum normal, puis une électrophorèse a été réalisée sur chacune des dilutions avec le Paragon CZE 2000 et avec un gel d'agarose 30 positions sur Hydrasys.

Étude comparative des tracés électrophorétiques sur gel d'agarose et en électrophorèse capillaire

Nous avons comparé les résultats obtenus en électrophorèse capillaire et sur gel d'agarose pour une série de 75 échantillons, 58 pris au hasard dans la série du jour, et 17 échantillons avec un ou plusieurs pics d'allure monoclonale dans les gammaglobulines. Pour ces derniers, se répartissant en 10 immunoglobulines monoclonales, 5 biclonales et 2 profils oligoclonaux des gammaglobulines, une immunosoustraction et une immunofixation ont été réalisées.

Statistiques

Le logiciel Stat View a permis l'exploitation de l'ensemble des résultats.

Résultats

Répétabilité, reproductibilité

Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Pour l'albumine, les tests de répétabilité et de reproductibilité retrouvent des CV inférieurs à 1,8 %. Les résultats de ces mêmes tests sont moins bons pour les autres fractions, les CV restent toutefois inférieurs à 10 %, à l'exception du sérum n° 6 où le CV obtenu pour la reproductibilité sur la fraction alpha-1-globuline est de 20 %. Cependant pour 7 aliquotes du sérum, le pourcentage de la fraction alpha-1-globuline était compris entre 4 et 5 %, et pour 2 aliquotes à 6,8 %. En excluant ces deux derniers résultats, le CV obtenu est de 9,9 %.

Sensibilité analytique

La sensibilité analytique pour la détection d'un pic monoclonal a été établie à partir de 3 sérums connus pour avoir une immunoglobuline monoclonale. La concentration de l'immunoglobuline monoclonale étant déterminée par un dosage immunonéphélémétrique sur Array 360 CE (Beckman), la dilution notée dans le tableau 2 correspond à la dernière dilution pour laquelle était détectée la présence d'une bande monoclonale à l'électrophorèse. Les résultats font apparaître une sensibilité du Paragon CZE 2000 légèrement supérieure à celle de l'Hydrasys au niveau de la zone bêta-gammaglobulines quand le fond polyclonal est peu intense, et en revanche un peu moins bonne pour la détection d'un contingent monoclonal en gammaglobulines lorsqu'il existe un fond polyclonal qui rend plus difficile la distinction d'une faible bande.

Étude comparative des tracés électrophorétiques sur gel d'agarose et en électrophorèse capillaire

Il existe une bonne corrélation entre les deux techniques (p < 0,01 à p < 0,0005) sauf pour les bêtaglobulines en raison d'une grande dispersion des valeurs (figure 1).

Cependant les pourcentages d'albumine et d'alpha-2-globulines obtenus par électrophorèse capillaire sont inférieurs à ceux obtenus après intégration sur gel, surtout pour les valeurs basses. Pour les alpha-1-globulines les valeurs obtenues par électrophorèse capillaire sont deux fois plus élevées que celles obtenues après intégration sur gel.

Typage des dysglobulinémies par immunosoustraction.
Comparaison des résultats obtenus avec ceux de l'immunofixation sérique sur Hydrasys

La figure 2 illustre les profils obtenus pour 4 des 17 échantillons analysés.

* Immunoglobulines monoclonales

Les 10 échantillons étaient composés de 4 IgG monoclonales (3 IgG kappa, 1 IgG lambda) de concentrations variables : l'une d'entre elle migrait en bêtaglobulines, les autres en gammaglobulines, et de 6 IgM monoclonales (5 IgM kappa, 1 IgM lambda) de concentrations variables qui migraient toutes en gammaglobulines.

Le typage de ces 10 immunoglobulines monoclonales n'a pas posé de problème, les deux techniques donnant les mêmes conclusions. Sur gel d'agarose, une IgM kappa polymérisée a perturbé l'interprétation de l'immunofixation, mais la dépolymérisation de l'échantillon par le bêta-mercapto-éthanol a permis de conclure. Aucune difficulté liée à la polymérisation d'une IgM n'a été observée avec le Paragon CZE 2000.

* Dysglobulinémies biclonales

Pour 3 des 5 échantillons l'immunofixation et l'immunosoustraction sont illustrées dans la figure 2. Pour le sérum n° 2 (IgG kappa et IgM kappa), avec le procédé d'immunosoustraction l'IgG de forte concentration nous empêche de voir la soustraction d'un faible pic d'IgM ou d'IgA. Afin de typer la chaîne lourde de l'IgM monoclonale, il aurait fallu préalablement précipiter l'IgG kappa de forte intensité (incubation du sérum avec de l'anti-gamma) et refaire une immunosoustraction sur le surnageant. Inversement, pour les sérums n° 3 (IgG kappa et IgG lambda) et n° 4 (IgM kappa et IgM lambda), les deux immunoglobulines monoclonales sont de mobilités électrophorétiques très proches, l'immunosoustraction permet de conclure en soustrayant successivement les deux pics, en revanche, en immunofixation les trois bandes sont au même niveau. Il faut pour pouvoir conclure soit précipiter l'une des deux immunoglobulines monoclonales par un antisérum spécifique de sa chaîne lourde ou légère et réaliser une immunofixation sur le surnageant, soit faire une immunofixation en utilisant des anticorps anti-kappa et -lambda libres.

Pour les deux autres sérums, les résultats obtenus étaient identiques quelle que soit la technique utilisée (immunosoustraction ou immunofixation).

* Profils oligoclonaux

Pour les deux sérums testés, l'immunofixation détecte de faibles bandes non visualisées à l'électrophorèse, et précise quelle classe d'immunoglobulines présente un profil oligoclonal. L'immunosoustraction n'est pas plus résolutive que l'électrophorèse capillaire dans le cas des profil oligoclonaux, l'analyse de plusieurs faibles pics est en effet extrêmement difficile (figure 3).

Discussion

Performances du système

Les tests de répétabilité donnent de bons résultats : les CV sont inférieurs à 1,8 % pour l'albumine, et inférieurs à 5 % pour toutes les autres fractions, sauf pour la fraction alpha-1-globulines qui est la moins abondante (sérum n° 3, tableau 1). Concernant les tests de reproductibilité, les résultats obtenus pour deux sérums sont inférieurs à 1,8 % pour la fraction albumine, et inférieurs à 10 % pour les autres fractions, sauf pour la fraction alpha-1-globulines (sérum n° 6, tableau 1, CV = 20 %). Ce résultat reflète vraisemblablement une standardisation imparfaite entre les 7 capillaires, en effet les résultats obtenus sur le P/ACE® (Beckman) qui ne comporte qu'un seul capillaire sont meilleurs [6].

La fraction albumine déterminée par électrophorèse capillaire est inférieure à celle obtenue après intégration du gel d'agarose sur Hyrys. Nous avons établi au cours d'une autre étude la corrélation existant entre l'albumine (g/l) dosée par méthode néphélémétrique sur Array 360 CE Beckman et le résultat déduit du système Hydrasys Hyrys ; le dosage néphélémétrique donne des résultats inférieurs (y (Array) = 1,0384 x (Hydrasys) ­ 3,6922). La corrélation directe entre le Paragon CZE 2000® et le dosage sur Array 360 CE n'a pas été réalisée dans ce travail. Toutefois, considérant les corrélations albumine Hydrasys Hyrys versus albumine Array et albumine Hydrasys Hyrys versus albumine Paragon CZE 2000®, nous pouvons penser que l'albumine quantifiée par le Paragon CZE 2000® est proche du dosage néphélémétrique. D'autres auteurs ont déjà montré que l'albumine quantifiée avec le Paragon CZE 2000® est beaucoup mieux corrélée au dosage immunonéphélémétrique que l'albumine quantifiée à partir d'une électrophorèse sur acétate de cellulose [7].

L'orosomucoïde et l'alpha-1-antitrypsine sont mal révélées par les techniques colorimétriques, mais par contre très bien détectées à 214 nm [8], d'où la nette différence observée pour la fraction alpha-1-globuline entre le Paragon CZE 2000® et le système Hydrasys Hyrys. Concernant la fraction bêtaglobulines, l'absence de corrélation claire entre les deux techniques traduit principalement le manque de précision pour matérialiser le début des bêtaglobulines.

Compte tenu des résultats de notre étude, la sensibilité analytique pour la détection d'un contingent monoclonal avec l'électrophorèse capillaire ou l'électrophorèse sur gel d'agarose paraît relativement comparable. D'autres études qui incluent un plus grand nombre de dysglobulinémies monoclonales montrent que pour la détection d'un pic monoclonal, l'électrophorèse capillaire sur Paragon CZE 2000® est au moins aussi sensible que l'électrophorèse sur gel d'agarose [9], et plus sensible que l'électrophorèse sur acétate de cellulose [10].

Pour le typage des dysglobulinémies, l'immunofixation et l'immunosoustraction donnent des résultats tout à fait cohérents dans notre travail, et présentent chacune leurs avantages et leurs inconvénients. L'interprétation d'une immunosoustraction exige un nouveau mode de raisonnement qui s'acquiert rapidement avec l'entraînement, toutefois la caractérisation d'un faible pic monoclonal est extrêmement difficile. Contrairement à l'immunofixation qui est plus sensible que l'électrophorèse sur agarose pour la détection d'une faible bande monoclonale, l'immunosoustraction permet de caractériser un pic détecté par électrophorèse, mais n'est pas plus sensible que l'électrophorèse capillaire pour la détection d'un faible pic monoclonal. En effet l'électrophorèse capillaire est réalisée à partir d'une dilution au 1/20e du sérum, ainsi les artefacts vraisemblablement liés à la présence en faible concentration dans le sérum de substances détectées à 214 nm sont supprimés, en revanche, pour l'immunosoustraction le sérum est classiquement dilué au 1/7e, et de faibles pics liés à la détection de ces substances peuvent perturber l'analyse du profil électrophorétique. C'est pourquoi un faible pic détecté uniquement en immunosoustraction est difficilement interprétable, et ne permet pas d'affirmer qu'il s'agit d'une immunoglobuline monoclonale en faible concentration. L'immunosoustraction est pour cette même raison mal adaptée à l'analyse de multiples bandes faibles dans les gammaglobulines liées à un profil oligoclonal.

Pour la détection d'une immunoglobuline monoclonale l'électrophorèse capillaire est aussi sensible que l'électrophorèse sur gel d'agarose. Selon certains auteurs la résolution avec l'électrophorèse capillaire est même meilleure pour une faible immunoglobuline monoclonale qui migre en bêtaglobuline, car on la distingue mieux de la transferrine [11]. En revanche, l'immunofixation reste la technique la plus sensible pour l'analyse d'un faible contingent monoclonal, et aussi la meilleure technique pour l'analyse d'un profil oligoclonal, puisque certaines bandes non détectées avec une électrophorèse (capillaire ou sur gel d'agarose) sont visibles seulement en immunofixation [10].

Praticabilité des automates

* Paragon CZE 2000®

Le Paragon CZE 2000® offre plusieurs avantages : le prélèvement direct de l'échantillon dans le tube primaire, qui minimise les erreurs et les risques de contamination ; l'utilisation de petits volumes de réactifs rendue possible par le faible diamètre des capillaires et l'absence de module de coloration ; une détection en ligne calée sur 214 nm des fractions protéiques et un traitement direct des données par le logiciel Stripe, qui restitue directement les résultats sous forme de courbes à 5 fractions ; une cadence élevée du fait de l'utilisation simultanée de 7 capillaires, mais la nécessité d'avoir une parfaite standardisation des migrations dans les différents capillaires, pour obtenir des résultats aussi performants qu'avec un seul capillaire [6].

La seule maintenance quotidienne du système consiste à rincer la sonde de prélèvement avec de l'eau distillée avant d'éteindre l'appareil.

* Hydrasys Hyrys

L'Hydrasys Hyrys est un système qui standardise très bien la réalisation des électrophorèses, toutefois le dépôt des échantillons sur le peigne applicateur expose à des risques d'erreurs et de contamination ; la coloration des protéines nécessite l'utilisation d'un bain de coloration recyclable pour 10 gels (soit amidoschwarz pour les électrophorèses, soit violet acide pour les immunofixations) et de 3 bains successifs de décoloration, cette étape est optimisée par l'automatisation mais consomme des réactifs ; la quantification des 5 fractions est réalisée par l'intégrateur Hyrys connecté à une imprimante qui édite les feuilles de résultats ; la cadence est comparable à celle du Paragon CZE 2000® si l'on utilise des gels pour 30 migrations simultanées, cependant tout n'est pas réalisé automatiquement et le technicien doit intervenir à plusieurs étapes.

Ce système est adapté au travail par séries (gel de 7,15 ou 30 positions), mais ne présente pas la souplesse du Paragon CZE 2000® qui offre également la possibilité de travailler au coup par coup.

CONCLUSION

L'électrophorèse capillaire, qui introduit un nouveau concept de séparation des protéines, est une technique d'avenir dans le domaine de la biologie clinique. Diverses études ont déjà montré l'intérêt de cette technique pour l'électrophorèse des protéines du liquide céphalo-rachidien et de l'urine [2, 4] ainsi que pour l'analyse des variants de l'hémoglobine [2, 12], la séparation des fragments d'ADN [4, 12], l'analyse des lipoprotéines sériques [4], le dosage de médicaments et de vitamines [12], l'analyse de métabolites urinaires [2, 4, 13, 14], l'analyse des cryoglobulines [15] et pour la séparation et la quantification d'isoenzymes [4, 12].

L'utilisation du Paragon CZE 2000® est toutefois limitée actuellement à l'électrophorèse des protéines sériques et au typage des immunoglobulines monoclonales sériques. C'est un automate fiable et adapté pour les laboratoires d'analyses médicales qui veulent gérer leurs électrophorèses au coup par coup sans générer un surcoût de réactifs, et/ou pour les laboratoires qui réalisent un nombre important d'électrophorèses justifiant l'emploi d'un système entièrement automatisé.

Remerciements. Nous remercions la société Beckman et la société Sébia qui ont mis leurs matériels à notre disposition pour la réalisation de cette étude.

Article reçu le 6 juillet 1998, accepté le 7 janvier 1999.

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