ARTICLE
L'hémoglobine glyquée, et plus particulièrement
la fraction A1c, est reconnue depuis une vingtaine d'années comme
le paramètre le plus objectif du contrôle glycémique
à moyen terme [1]. En effet, l'hémoglobine A1c, fraction
glyquée de l'hémoglobine, est le résultat d'une réaction
de fixation non enzymatique, lente et irréversible de glucose sur
au moins une extrémité N-terminale (résidu valine)
des chaînes beta de l'hémoglobine. Elle s'accumule dans les
hématies au cours de leur vie ; sa valeur constitue donc un reflet
de la glycémie pendant les 2 à 3 mois qui précèdent
le prélèvement.
L'HbA1c est dosée au laboratoire de biochimie selon une technique
de chromatographie liquide haute pression (CLHP) en échange d'ions
depuis juillet 1996. Ce dosage, fréquemment prescrit, entraîne
un recrutement important et permet, de ce fait, de mettre en évidence
fortuitement des anomalies de l'hémoglobine.
L'observation porte sur les anomalies de l'hémoglobine dépistées
sur les chromatogrammes réalisés lors du dosage de l'HbA1c
de patients diabétiques. Le laboratoire, dans ce cas précis,
n'a qu'un rôle de détection de ces anomalies ; cependant,
dans certains cas, une telle découverte impose d'adapter les tests
proposés pour le suivi du diabète.
Patients et méthodes
Patients
L'étude a porté sur tous les prélèvements
pour lesquels était prescrit un dosage de routine d'HbA1c pendant
ces deux dernières années, prélèvements provenant
de l'ensemble des services et principalement des services de diabétologie
adulte et pédiatrique.
Méthode de dosage de l'HbA1c
Le dosage est effectué sur un appareil Variant®
(Bio-Rad, Hercules, USA), à partir de sang hémolysé
et traité pour éliminer la fraction labile de l'hémoglobine
glyquée. L'appareil utilise le principe de la chromatographie liquide
haute pression en échange d'ions permettant un isolement de la
fraction A1c et d'autres fractions normales de l'hémoglobine (HbA1a,
HbA1b, HbF, HbAo) en fonction de leur pH isoélectrique. La quantification
des hémoglobines est réalisée par intégration
de la surface des pics mesurés à 415 nm, le bruit de fond
étant corrigé par une lecture à 690 nm. Un exemple
de chromatogramme normal est présenté sur la figure
1A.
L'HbA1c est exprimée en pourcentage de l'hémoglobine totale
selon la formule :
% HbA1c = Aire de l'HbA1c x fr x 100
[Aire HbA1a + aire A1b + aire HbF + (aire HbA1c x fr) + aire HbAo]
où fr est le facteur de réponse de l'appareil, calculé
à partir de la calibration effectuée en début d'analyse.
Identification des variants de l'hémoglobine
Pour chaque anomalie constatée sur le chromatogramme, une étude
complète de l'hémoglobine a été effectuée
: isofocalisation sur gel de polyacrylamide, dosage des hémoglobines
normales et des variants (par densitométrie ou chromatographie
sur colonne selon les fractions), électrophorèse sur agar
acide et test d'Itano. Les variants non reconnus ont fait l'objet d'une
identification par le service de biochimie génétique de
l'hôpital Henri-Mondor.
Résultats
Sur 6 636 dosages réalisés, 76 chromatogrammes (48 patients)
présentaient des anomalies correspondant (figure
1) soit à une augmentation de la surface du pic d'hémoglobine
fœtale (27 patients), soit à un pic surnuméraire suggérant
la présence d'un variant de l'hémoglobine (21 patients).
Augmentation de l'HbF
Usuellement, et pour un adulte sain, l'HbF représente moins de
1 % de l'hémoglobine totale. Dans ce travail, seules ont été
prises en compte les valeurs d'HbF supérieures à 2 %. La
plus forte augmentation observée (27 %) correspondait à
un cas de persistance héréditaire de l'hémoglobine
fœtale (figure 1, B et C).
Dans 4 autres cas, une étiologie a pu être retrouvée
pour expliquer cette augmentation : beta-thalassémie (1 cas), régénération
médullaire (1 cas) ou traitement par l'acide valproïque (Dépakine®)
(2 cas) comme rapportée par Collins et al. [2]. Il est important
de signaler que d'autres médicaments sont susceptibles d'entraîner
une augmentation de l'HbF tels que l'hydroxyurée (Hydréa®)
[3], l'arabino-cytosine (AraC®) [4]. Dans les autres cas,
l'étiologie n'a pu être précisée ; chez ces
patients, l'anomalie observée persistait lors des dosages ultérieurs.
Dans tous ces cas, la mise en évidence de l'HbF était
confirmée par électrophorèse et sa quantification
effectuée par la méthode de Betke. Pour deux patients, une
étude complète de l'hémoglobine a conduit, en raison
d'une légère augmentation de l'HbF, à mettre en évidence
l'existence d'un variant de type Les Andelys dans un cas et Lepore dans
l'autre cas (figure 1, C).
Présence d'un pic surnuméraire
Dans notre expérience, la présence d'un pic surnuméraire
correspondait toujours à l'existence de formes mutées de
l'hémoglobine (21 cas). Si l'on ajoute les 3 cas de mutations détectées
en raison d'une augmentation de l'HbF, le nombre de variants identifiés
est de 24 (tableau 1),
dont 16 étaient restés jusque-là méconnus.
Commentaires
La probabilité de rencontrer une hémoglobinopathie lors
du dosage de l'HbA1c n'est pas exceptionnelle puisqu'elle représente,
dans notre expérience, un peu plus de 1 % des dosages effectués.
L'utilisation d'une méthode reposant sur une séparation
et une visualisation des différentes formes de l'hémoglobine
permet, dans la plupart des cas, de détecter l'anomalie [5] et
d'éviter ainsi de rendre une valeur éventuellement erronée
du taux d'HbA1c. Il est à noter que cette possibilité est
limitée aux seules techniques de chromatographie ou d'électrophorèse,
qui ne représentent qu'un tiers des techniques actuellement utilisées
[6].
L'augmentation de l'HbF, lorsqu'elle reste modérée (inférieure
à 3 %), ne nécessite pas l'invalidation du résultat
de l'HbA1c et ce marqueur peut alors être utilisé de façon
fiable dans la surveillance du diabète. À l'opposé,
la découverte de l'existence d'une hémoglobine anormale
impose d'informer le prescripteur sur la difficulté d'interprétation
du taux de l'HbA1c obtenu et conduit, très souvent, à l'invalidation
du résultat. En effet, l'existence d'un variant peut potentiellement
entraîner une modification de la durée de vie des hématies
; c'est le cas par exemple si l'hémoglobine anormale induit une
hémolyse. De plus, on ne connaît pas la capacité de
glycation de ces variants [7] et il n'est pas exclu qu'il puisse exister
entre eux des phénomènes de compétition pour la fixation
du glucose. Enfin, sur un plan analytique, l'individualisation des formes
mutées et de leurs fractions glyquées est parfois difficile.
Par exemple, on peut observer la présence d'un second pic surnuméraire
correspondant sans doute à la forme glyquée du variant (figure
1, D), en l'absence d'un tel pic (figure
1, E), la forme glyquée est vraisemblablement intégrée
à la fraction Ao, sous-estimant le résultat d'hémoglobine
glyquée. En présence d'une hémoglobine D (figure
1, F), le résultat est même franchement erroné,
la séparation entre Ao et D étant insuffisante.
Ces problèmes rendent très difficile l'interprétation
des résultats, même si l'on peut considérer que l'utilisation
d'une technique identique dans un même laboratoire permet de comparer
entre eux les résultats d'un même patient. Le dosage des
fructosamines [8, 9], reflet de la glycation des protéines circulantes,
peut être alors proposé pour le suivi de la maladie diabétique.
En effet, la concentration des fructosamines n'est pas modifiée
par l'existence d'une hémoglobinopathie [10, 11]. Cependant, les
fructosamines reflètent l'équilibre glycémique d'une
période plus courte que celle reflétée par l'HbA1c
(2 à 3 semaines au lieu de 2 à 3 mois) ; de plus, la prescription
de ce test est peu répandue et les cliniciens sont dans l'ensemble
peu familiarisés avec l'interprétation des résultats
rendus.
CONCLUSION
L'existence d'une élévation de l'HbF ou la présence
d'une hémoglobine anormale conduit à déconseiller
l'utilisation de l'HbA1c dans ces situations, et à proposer un
test de remplacement tel que le dosage des fructosamines. Dans quelques
très rares cas, ces deux approches complémentaires sont
prises en défaut. La surveillance de la maladie diabétique
devient alors un réel problème.
Remerciements. Nous remercions F. Galacteros et son
équipe pour l'identification des variants rares (Service de biochimie
de M. Goossens, Hôpital Henri-Mondor).
Article reçu le 15 mai 1999, accepté le 18 août 1999.
REFERENCES
1. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.
The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression
of long term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N
Engl J Med 1993 ; 977-86.
2. Collins AF, Dover GJ, Luban NL. Increased fetal hemoglobin
production in patients receiving valproic acid for epilepsy. Blood
1994 ; 84 : 1690-1.
3. Olivieri NF, Rees DC, Ginder GD, et al. Treatment of
thalassemia major with phenylbutyrate and hydroxyurea. Lancet 1997
; 350 : 491-2.
4. DeSimone J, Heller P, Hall L, Zwiers D. 5-azacytidine stimulates
fetal hemoglobin synthesis in anemic baboons. Prod Natl Acad Sci USA
1982 ; 79 : 4428-31.
5. Weykamp CW, Penders TJ, Muskiet FAJ, van der Slick W. Influence
of hemoglobins variants and derivatives on glycohemoglobin determinations,
as investigated by 102 laboratories using 16 differents methods. Clin
Chem 1993 ; 39 : 1717-23.
6. Hémoglobines. Cahiers de formation Bioforma
1997 : 8.
7. Serjeant GR. Sickle cell disease. Oxford, UK : Oxford
University Press, 1992 ; Vol. 1, 2nd ed.
8. Delattre J, Gillery P. Dosage de la fructosamine et
son intérêt dans la surveillance du diabète sucré
(commission « protéines glyquées »). Option
/Bio 1993 ; 104.
9. Gillery P. Valeurs de référence des fructosamines
plasmatiques chez des sujets sains. Option/Bio 1993 ; 89.
10. Pileire B, Moutet JP, Bangou J, Ragoucy-Sengler CM. Marqueurs
de la glycation des protéines dans le dépistage du diabète.
Ann Biol Clin 1988 ; 46 : 719-21.
11. Martina WV, Martjin EG, Van der Molen M, Schermer JG, Muskiet
FAJ. beta-N-terminal glycohemoglobins in subjects with commons hemoglobinopathies
: relation with fructosamine and mean erythrocyte age. Clin Chem
1993 ; 39 : 2259-65.
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