ARTICLE
Auteur(s) : Patrick Vincourt
UMR 441-2594 (INRA-CNRS), Équipe « génétique et génomique
des réponses du tournesol Helianthus annuus
aux stress biotiques et abiotiques », Laboratoire
des interactions plante-micro-organismes, BP 52627, chemin
de Borde-Rouge, Auzeville, 31326 Castanet-Tolosan, France
Avec 7 millions de tonnes de graines, l'Union européenne (27)
occupe, au coude à coude avec la Russie et l'Ukraine, l'une des
toutes premières places pour la production mondiale de tournesol
(source USDA). Au sein de l'Union européenne, la France, avec la
meilleure productivité à l'hectare (23 q/ha, moyenne
2005-2008, source AGRESTE), partage la première place selon les
années avec la Roumanie et la Bulgarie. Malgré des fluctuations de
cours importantes, au cours de ces dernières années, la valeur de
la production française « à la sortie du champ » peut être estimée
à 1 milliard d'€, et de la valeur ajoutée ainsi que des emplois en
recherche et en production de semences sont engendrés par les
firmes installées en France qui déploient leur activité à
destination du marché mondial. Tandis que le déficit commercial
français atteignait un record en 2008, le commerce international
des semences affichait la même année un excédent de 447 M€
dont 87 % étaient imputables aux semences de tournesol (Seedquest,
octobre 2008). C'est dans ce contexte que l'INRA a décidé
d'amplifier son effort dans le domaine de la génétique d'une espèce
cultivée qui est par ailleurs devenue symbolique, à l'heure du
projet Écophyto 2018. En effet, cette culture est peu gourmande en
eau, en engrais azotés et en produits phytosanitaires, notamment du
fait des efforts consentis à l'INRA (Vear et al. 2003, 2008)
et ailleurs dans le domaine de la résistance aux pathogènes.
Cet article se propose d'exposer en quoi le développement de
ressources génétiques, génomiques et bio-informatiques peut
permettre à des projets de recherche finalisée de progresser de
façon compétitive dans l'identification de solutions pour la
filière économique du tournesol.
Quelles cibles prioritaires ?
Si la compétitivité dans la démarche de recherche poursuivie est
largement dépendante de l'existence des ressources
scientifiques disponibles, le choix des cibles d'une recherche
finalisée résulte de la conjonction d'un besoin exprimé par la
filière et d'une opportunité engendrée par l'état des connaissances
sur l'espèce d'intérêt et sur les espèces modèles.
À l'échelle de l'Europe géographique au sens large, la culture
du tournesol souffre d'un déficit de productivité significatif (30
% environ) par rapport à son seul concurrent notable sur ce
territoire, le colza d'hiver. Cette comparaison ne peut évidemment
être faite « toutes choses égales par ailleurs », car les
adaptations pédoclimatiques et les niveaux des intrants requis pour
que cet écart s'exprime sont sensiblement différents. Cependant,
pour les débouchés alimentaires ou non alimentaires, la viabilité
économique de la filière du tournesol est étroitement liée à une
augmentation de la productivité et de sa régularité. Notre
équipe1 a donc choisi de développer deux thématiques
prioritaires de recherche : la tolérance aux stress abiotiques
comme voie d'amélioration de la régularité de productivité de la
culture et l'amélioration de la durabilité de la résistance au
mildiou causé par l'oomycète obligatoire Plasmopara halstedii,
qui est un enjeu durable pour la sécurisation de la culture.
Les différents mécanismes mis en œuvre par la plante pour
répondre aux stress abiotiques ont fait l'objet de nombreux travaux
sur l'espèce modèle Arabidopsis thaliana (Hirayama et
Shinosaki, 2010), mais également sur le tournesol (Manavella
et al., 2006 ; Dezar et al., 2005 ; Giacomelli
et al., 2010,). Ces résultats fournissent à la fois une
référence pour la conception des expériences et une liste de «
gènes candidats » dont l'implication a été démontrée dans les
espèces modèles : mécanismes dépendant ou non de la signalisation
par l'hormone ABA, effecteurs impliqués dans la régulation de
l'ouverture stomatique ou du potentiel osmotique par l'accumulation
des osmolytes, la protection des protéines membranaires, la
réparation des dommages liés à l'oxydation consécutive aux stress
(Ramanjulu et Bartels, 2004).
Il est toujours délicat de justifier le choix d'une priorité
parmi les différentes agressions biotiques auxquelles est soumise
une culture. En France, le tournesol est affecté principalement par
le mildiou, le sclérotinia, le phomopsis et plus récemment par
la « maladie du pied sec » associée à Phoma macdonaldii
(Seassau et al., 2010). Les problèmes associés à la
présence du mildiou dans les cultures de tournesol ne sont pas
ressentis aujourd'hui comme particulièrement critiques malgré les
contournements successifs de gènes de résistances (Delmotte
et al., 2008). L'espèce sauvage Helianthus annuus et le
mildiou P. halstedii sont originaires tous deux du continent
nord-américain et y poursuivent leur coévolution, tandis que
l'expansion mondiale continue de la zone de culture constitue
de nouveaux environnements pour l'interaction au sein du couple
hôte-pathogène. Nous avons donc estimé que l'identification de
solutions plus durables – par la mise en œuvre éventuelle
d'une résistance quantitative en cours d'étude comme par
l'élaboration d'outils d'analyse du polymorphisme génétique de
l'agent pathogène – était une réponse adéquate aux difficultés
durables que la sensibilité spécifique du tournesol au mildiou est
susceptible de poser. Par ailleurs, la recherche sur les effecteurs
du pouvoir pathogène des oomycètes est depuis quelques années en
pleine effervescence (Schornack et al., 2009), et les
connaissances développées sur des couples hôte-pathogène modèles
tels que Solanum tuberosum-Phytophthora infestans,
Medicago truncatula-Aphanomyces euteiches ou
A. thaliana-Hyaloperonospora arabidopsidis sont
susceptibles d'alimenter cette démarche.
Bien que plus complexe à aborder au plan expérimental, la
question de l'interaction entre stress abiotiques et biotiques
méritera d'être abordée : à l'échelle de la réaction individuelle
de la plante, parce que certaines voies de signalisation, notamment
hormonale, se trouvent impliquées dans les deux types de stress
(Ton et al., 2009), et à l'échelle de la parcelle agricole
dont la conduite culturale (fertilisation, disponibilité en eau)
peut influencer le développement de la maladie (Debaeke et Moinard,
2010 ; Seassau et al., 2010).
Ressources génétiques : un patrimoine que les outils
de l’« ère génomique » nous donneront davantage
la possibilité d'exploiter
Les stations de génétique et d'amélioration des plantes de l'INRA
ont collecté ou développé depuis plus de 40 ans, à Montpellier
et à Clermont-Ferrand, des ressources génétiques qui représentent
un patrimoine majeur au niveau mondial : accessions sauvages du
genre Helianthus, populations cultivées avant l'avènement des
hybrides, pools interspécifiques, lignées de type cultivé,
populations de lignées recombinantes (RIL) pour l'analyse
génétique des caractères. Ce type de ressources a toujours été
considéré par les sélectionneurs comme une réserve de caractères
d'intérêt pour l'espèce cultivée, mais il est clair que l'avènement
des outils de cartographie génétique puis de description fine du
polymorphisme de séquence nucléotidique leur confère maintenant une
plus grande valeur, par la possibilité offerte de ne transférer,
par sélection assistée par marqueurs, que les allèles favorables
aux cultivars. Afin de rendre effectif ce processus, des
sous-ensembles de lignées rassemblant une fraction importante de la
variabilité présente au sein de ces collections ont été constitués
(Coque et al., 2008) dans la perspective de développer la «
génétique d'association ». Par ailleurs, dans le cadre du projet
OLEOSOL2, sont en cours de développement :
- – une population de lignées d'introgression (Nested
Association Mapping) dans la lignée de référence XRQ d'une
dizaine d'écotypes sauvages d’H. annuus provenant
d'environnements contrastés d'Amérique du Nord, afin d'analyser
dans un fond génétique commun les caractères apportés par les
fragments de type sauvage ;
- – une population de mutants EMS, également construite à
partir de la lignée XRQ, afin d'aborder l'étude fonctionnelle par
une démarche de génétique réverse – de la séquence au
phénotype associé par TILLING3.
Ressources génomiques : le tournesol s'apprête
à rejoindre le peloton de tête des espèces
cultivées
Séquençage du génome du tournesol
En janvier 2010, était annoncé4 le lancement du
programme de séquençage génomique du tournesol par un
consortium international financé principalement par Génome Canada
avec le soutien notamment de l'INRA. Le Centre national de
ressources génomiques végétales5 y est impliqué par la
création des banques BAC6 utilisées pour le séquençage
et a, d'ores et déjà, mis à la disposition du projet une banque
HindIII à la profondeur de 5,7 X et avec une longueur moyenne
d'insertion de 140 Kb. Afin d'assurer une couverture plus
complète du génome, une deuxième banque BamHI est en cours de
construction. Une troisième banque construite avec l'enzyme de
restriction EcoRI sera mobilisée si nécessaire. Pour sa part, le
LIPM apportera sa contribution dans le domaine bio-informatique et
pour l'intégration des cartes physiques et génétiques.
Le tournesol fera ainsi partie, vraisemblablement en 2012, des
espèces cultivées dont le génome a été entièrement séquencé.
Séquençage et étude du transcriptome
Avant cette initiative, la génomique du tournesol avait bénéficié
d'un effort important de séquençage d'EST7,
principalement par le Compositae Genome Project8 et,
avant lui, quoiqu'à un degré moindre, par Génoplante. En septembre
2007, était accessible dans le domaine public un ensemble d'environ
284 000 séquences d'EST provenant de sept espèces du genre
Helianthus et principalement de l'espèce H. annuus.
Ces EST ont été assemblés par M. Barker, et les
assemblages9ainsi obtenus ont été utilisés par un
consortium rassemblant l'université de Colombie britannique (UBC,
Canada, L. Rieseberg), l'université de Géorgie, Athens (UGA,
États-Unis, S. Knapp), Biogemma, Syngenta et l'INRA pour confier à
la société Affymetrix la construction d'une puce (2,6 millions
de sondes couvrant environ 87 237 assemblages, figure 1) dont la
destination première est l'analyse d'expression, mais qui pourra
également être utilisée pour la cartographie à haute densité.
Ainsi, dans le cadre du projet ANR SUNYFUEL10, en
collaboration avec l'URGV11 et les écophysiologistes
d'AGIR12, nous analysons les réponses différentielles, à
la fois sur le plan physiologique et sur le plan de l'expression
des gènes dans les feuilles (Rengel et al., 2010), de huit
génotypes (lignées ou hybrides) soumis à une gamme de stress
hydriques variés et caractérisés. En parallèle, des échantillons
ont également été prélevés au champ pour analyser les conditions de
répétabilité de ce type de mesure dans un environnement plus
variable. Cette puce est également utilisée dans le cadre du projet
de recherche sur la résistance au mildiou. Dans ce cas, nous
souhaitons analyser les différences d'expression entre plantules de
tournesol possédant ou non un gène de résistance race spécifique ou
l'allèle favorable pour le QTL de résistance quantitative, et
soumises à des infections avec différentes races de mildiou. Cela
nous permettra de répondre à la question de savoir quels gènes sont
exprimés ou réprimés de façon corrélative aux phénotypes de
résistance ou de sensibilité.
Le tournesol prend le virage des nouvelles techniques
de séquençage
Avec l'avènement des technologies de séquençage à très haut débit
(454 Roche, Illumina GA), se sont décuplées les possibilités
d'accéder au polymorphisme de gènes exprimés ou de l'ADN génomique,
et même tout simplement de produire à des conditions financières
plus acceptables de nouvelles données de séquence. Ainsi, dans
le cadre du projet de recherche sur la résistance au mildiou, nous
avons, en collaboration avec l'équipe EPGV (Versailles, Évry),
cherché à augmenter le nombre d'EST de l'agent pathogène
P. halstedii disponible à la communauté internationale, qui
est à ce jour très faible (145), notamment du fait qu'il s'agit
d'un parasite obligatoire strict. Nous avons donc soumis à un
séquençage « 454 » deux échantillons de plantules de tournesol
infectées par le mildiou et correspondant à deux interactions de
type compatible ou non. Au sein de chaque échantillon, sont donc
exprimés, en même temps et dans le cadre de l'interaction
hôte-pathogène, des gènes du tournesol et des gènes du mildiou, et
nous avons fait appel à des filtres bio-informatiques pour allouer
les séquences à l'hôte ou au pathogène (As Sadi et al., 2010). Dans
le cadre de la démarche de génétique d'association conduite au sein
du projet OLEOSOL, nous utilisons la technologie Illumina GA pour
découvrir le polymorphisme SNP13 au sein d'un ensemble
de 48 lignées et pour plusieurs centaines de gènes candidats. Dans
les deux cas, la valorisation des très nombreuses données de
séquence repose entièrement sur l'accès à des compétences en
bio-informatique et à des outils de calculs et de stockage très
puissants.
Bio-informatique : s'appuyer sur l'expertise
et disposer d'outils orientés « utilisateurs »
Grâce à son ancrage au sein du LIPM, notre équipe a bénéficié
très vite du soutien de l'équipe de bio-informatique de ce
laboratoire14. Le portail HELIAGENE
(http://www.heliagene.org/) a été rapidement mis en place (Carrere
et al., 2008), produisant dans un premier temps différentes
analyses (prédiction de peptides, BLAST des séquences
nucléotidiques ou protéiques sur différentes bases de données,
annotations) à partir de l'assemblage nord-américain.
Ces données ont été très rapidement valorisées pour identifier
dans la base de séquences, avec un bon degré de confiance, les
homologues Helianthus de gènes d’Arabidopsis dont l'implication
dans la réponse au stress hydrique avait été rapportée de façon
fonctionnelle. Les données de séquence analysées dans
HELIAGENE étant les mêmes que celles qui avaient été utilisées pour
construire la puce Affymetrix, l'ensemble des sondes a été annoté
pour caractériser leur proximité avec les séquences constitutives
de l'assemblage qui pouvaient provenir d’une ou de plusieurs des
sept espèces Helianthus ; de cette façon, il devenait possible
d'éviter la prise en compte de défauts d'hybridation associés à des
polymorphismes de séquence interspécifiques, et donc une mauvaise
interprétation des données d'expression. Le logiciel SNP-Phage
(Matukumalli et al., 2006) a été intégré au portail afin de
gérer les données de polymorphisme SNP ou Indel ainsi que les
haplotypes produits dans le cadre des différents projets de
recherche (figure
2). Dans le cadre du projet de séquençage conjoint du
tournesol et du mildiou, un portail du même type et qui sera mis en
accès public au cours de l'année 2010 a été développé : y ont
été assemblées les données de séquences « 454 » et toutes les
séquences H. annuus présentes dans le domaine public en
janvier 2009. Les assemblages ainsi obtenus ont été ensuite
rapprochés, d'une part, des séquences de plantes et, d'autre part,
des séquences d'oomycètes. Différents filtres ont alors été mis en
place pour identifier avec suffisamment de confiance les séquences
putatives de P. halstedii.
Conclusion
L'accès aux ressources génétiques, génomiques et bio-informatiques
est une condition nécessaire pour le développement des programmes
de recherche à vocation finalisée ou fondamentale. L'élaboration de
ces ressources est consommatrice en moyens humains et financiers,
mais elles constituent en outre un atout important pour la
mise en place de collaborations internationales. La communauté
scientifique s'accorde pour considérer qu'un autre type de
ressource est en passe de devenir le facteur limitant pour la
prochaine décennie : il s'agit des outils de phénotypage, au champ
et en conditions contrôlées. Pour une espèce d'intérêt agronomique,
l'enjeu est double : il s'agit d'une part de caractériser finement,
en conditions contrôlées, la réponse phénotypique différentielle
d'un grand nombre de génotypes confrontés à des conditions
environnementales biotiques ou abiotiques – pour permettre
l'analyse génétique des caractères – et, d'autre part,
d'établir le lien entre ce type de réponse et le comportement au
champ. Ce deuxième enjeu s'appuiera sur la modélisation
(Debaeke et Moinard, 2010). Les collaborations étroites
développées entre notre équipe et l'équipe AGIR ont notamment pour
objectif de faire face à ces nouveaux enjeux.
Références
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561-70.
1
(http://www2.toulouse.inra.fr/centre/lipm/fr/interactions_pathogenes/pv_equipe.php).
2 Projet soutenu par la région
Midi-Pyrénées, le Fonds interministériel de soutien aux pôles de
compétitivité et le FEDER, associant Biogemma, Syngenta, Soltis,
RAGT et l'INRA, et labellisé par le pôle de compétitivité AgriMip
Innovations.
3 TILLING : targeting induced local lesions
in genomes.
4
http://www.intl-pag.org/18/abstracts/W22_PAGXVIII_170.html.
5 http://cnrgv.toulouse.inra.fr/.
6 BAC : bacterial artificial chromosomes ;
larges fragments d'ADN isolés individuellement et insérés dans un
génome bactérien.
7 EST : expressed sequence tag, fragment de
séquence de gènes exprimés produit à partir d'échantillons
biologiques à partir duquel les mRNA sont extraits.
8 http://compgenomics.ucdavis.edu/
9 Assemblages (clusters) : plusieurs EST
sont potentiellement associés aux mêmes gènes. Il convient, à
la fois pour résumer l'information et pour disposer de séquences
consensus plus longues donc plus aisées à annoter, de condenser
cette information par un outil bio-informatique (ici, CAP3), donc
le paramétrage permet de régler le niveau de stringence.
10 Improving sunflower yield and quality
for biofuel production by genomics and genetics.
11 Unité de recherche en génomique
végétale, http://www.versailles.inra.fr/urgv/.
12
http://wwwagir.toulouse.inra.fr/agir/.
13 SNP : single nucleotide polymorphism :
polymorphisme élémentaire associé à la modification d'une seule
base dans la séquence nucléotidique.
14
http://www2.toulouse.inra.fr/centre/lipm/eng/bioinformatique/bioinformatique.htm.
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