The search for genes involved in the defence mechanisms of the sunflower, Helianthus annuus L., against the mildew agent Plasmopara halstedii

ARTICLE

Introduction

Avec environ un million d'hectares, la culture du tournesol est de première importance. Un certain nombre de maladies affectent cet oléagineux et ont des conséquences économiques importantes : parmi celles-ci, le mildiou causé par un champignon biotrophe Plasmopara halstedii. Selon la précocité de l'attaque de la plante par P. halstedii, différents symptômes peuvent être observés tels que l'apparition de taches chlorotiques sur les feuilles, la stérilité, le nanisme, le flétrissement et la mort rapide des plantes infectées. Cette maladie, apparue en France en 1966, a posé de graves problèmes. L'absence de lutte chimique efficace a nécessité le développement d'une lutte génétique rendue possible par l'existence de gènes de résistance. Cette résistance est contrôlée par des gènes majeurs appelés Pl. Elle est régie par un système de type gène pour gène. Toutefois, l'apparition en 1988 de nouvelles races de P. halstedii auxquelles toutes les variétés du moment se montraient sensibles a dirigé la lutte vers l'utilisation du métalaxyl, seul fongicide systémique commercialisé. Cependant, l'évolution de la maladie depuis 10 ans en France montre à la fois l'extension des foyers d'infection du tournesol et l'apparition de nouvelles races ainsi que de souches résistantes aux antimildious [1]. Devant les risques liés à cette maladie, différentes études ont été entreprises, parmi lesquelles l'étude des mécanismes de défense du tournesol contre P. halstedii.

Après une infection par P. halstedii, le tournesol élabore différentes réactions de défense afin de limiter la progression du parasite. Des études histopathologiques ont montré une invasion systémique des plantes sensibles alors que les plantes résistantes développent une réaction hypersensible inhibant la croissance du parasite [2]. La formation de ces nécroses est associée à une lignification cellulaire et une augmentation d'activité peroxydasique.

Si certaines des modifications histologiques et biochimiques avaient pu être observées, nos connaissances concernant les étapes moléculaires mises en jeu lors des réactions de résistance étaient insuffisantes. Une caractérisation moléculaire de ces interactions permettant d'identifier certains des gènes impliqués dans ces réactions de résistance paraissait donc nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes élaborés par H. annuus pour lutter contre cette maladie et, à plus long terme, de pouvoir gérer au mieux les moyens de lutte disponibles. En effet, c'est une meilleure compréhension de ce système qui permettra d'envisager les moyens de lutte les plus efficaces.

Pour répondre à cet objectif, nous avons procédé en plusieurs étapes. Dans un premier temps, notre travail s'est porté sur le choix d'un modèle d'étude pour cette caractérisation moléculaire. Nous avons alors étudié l'expression de gènes susceptibles d'intervenir dans la réponse du tournesol à une infection par P. halstedii. Le choix des gènes étudiés (PAL : phénylalanine ammonia-lyase, chitinase et ubiquitine) a été motivé par le rôle prépondérant des protéines correspondantes dans la réponse au stress. Enfin, nous avons souhaité identifier de nouveaux gènes en utilisant la technique du differential display reverse transcription PCR (DDRT-PCR) qui permet de comparer la composition en ARNm d'un tissu placé dans différentes conditions physiologiques (témoin, résistant et sensible) et ainsi de mettre en évidence des gènes exprimés spécifiquement dans une situation de résistance.

Matériel et méthodes

Génotypes de tournesol et isolats de P. halstedii

Le génotype de tournesol utilisé est la lignée RHA274 (USDA, États-Unis) résistante aux races 100 et 300 de mildiou, mais sensible aux races 700, 703 et 710. Cette lignée est maintenue à l'INRA à Clermont-Ferrand par autofécondation.

Les graines sont désinfectées à l'hypochlorite de sodium à 20 % pendant 3 minutes, mises à tremper dans l'eau pendant 5 heures, puis mises à germer à 24 ±2 °C pendant 48 heures dans des boîtes de Petri avec du papier imbibé d'eau. Dans ces conditions, la radicule atteint 5 à 10 mm de long.

Ces graines germées sont ensuite repiquées en terrines dans du terreau, puis placées en chambre de culture à 18±1 °C avec une humidité relative de l'air comprise entre 60 et 70 %, une photopériode de 16 heures de lumière, 8 heures de nuit et un flux quantique d'environ 200µE.m^-2.s^-1.

Les 5 races de P. halstedii ont été utilisées pour nos études (100, 300, 700, 703 et 710) [3].

Contaminations artificielles

La contamination secondaire est conduite selon le protocole proposé par Pelletier [4]. Les graines germées sont repiquées dans du terreau, disposées en chambre climatisée (21 ±1 °C, flux quantique 250 µE.m^-2.s^-1, photopériode de 16 heures de lumière, 8 heures de nuit, 70 à 80 % d'hygrométrie relative).

Des suspensions de zoosporanges (50 000 zoosporanges.ml^-1) sont pulvérisées au stade « premières feuilles » sur les plantules âgées de 8 jours. Un couvercle est placé sur les terrines de façon à maintenir une humidité saturante pendant les premières heures de l'infection.

Ainsi, des plantes sont pulvérisées avec de l'eau (plantes témoins), d'autres avec la race 100 (réaction incompatible = résistant) et les dernières avec la race 703 (réaction compatible = sensible).

La récolte des plantes est réalisée selon une cinétique de temps suivant les infections. Les organes sont excisés à l'aide d'une lame de rasoir et congelés immédiatement dans l'azote liquide. Ils sont ensuite stockés, avant extraction des acides nucléiques, dans un congélateur à -80° C.

Observations microscopiques

Des plantules de chaque combinaison sont prélevées et fixées dans du FAA (formol:acide acétique:alcool ; 5:5:90). Certaines coupes sont colorées 1 heure au bleu d'aniline (bleu d'aniline 0,1 % dans du tampon phosphate 0,1M pH8). Les coupes sont observées au microscope Olympus BH2.

Extraction des acides nucléiques, transfert et hybridation

La technique d'extraction des ARN utilisée est celle décrite par Bogorad et al. [5]. La technique d'extraction des ADN génomique de tournesol utilisée est celle décrite par Gentzbittel [6]. L'ADN de P. halstedii est extrait selon la méthode décrite par Roeckel-Drevet et al. [7].

Dix microgrammes d'ARN totaux sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose dénaturant 1,5 %. Les ADN sont séparés par électrophorèse non dénaturante en gel d'agarose horizontal 0,8 %. Les acides nucléiques sont ensuite transférés sur membrane de Nylon Hybond N+ (Amersham) et fixés à la membrane par irradiation aux ultraviolets (Spectrolinker).

Les sondes ADNc utilisées pour les hybridations sont marquées avec du [alpha³²P-dCTP] en utilisant le kit « Megaprime DNA labelling systems » d'Amersham.

La préhybridation des ARN se fait pendant 3 heures à 42 °C, celle des ADN à 65 °C. L'hybridation se fait pendant une nuit à 42 °C pour les ARN et 65 °C pour les ADN. Les membranes sont rincées deux fois 15 minutes dans du 2X SSPE, 0,1% SDS ; 1X SSPE, 0,1% SDS ; 0,5X SSPE, 0,1% SDS et 0,2X SSPE 0,1% SDS. Les membranes sont ensuite emballées dans du Saran Wrap et mises au contact de films autoradiographiques (Hyperfilm Amersham) à -80 °C dans une cassette comportant des écrans intensificateurs. La durée d'exposition est évaluée d'après l'intensité du signal estimée à l'aide d'un compteur Geiger.

Differential display reverse transcription PCR (DD RT-PCR)

La technique utilisée est celle décrite par Mazeyrat et al. [8]. Initialement décrite par Liang & Pardee [9], cette technique permet de comparer la composition en ARNm d'un tissu placé dans différentes conditions physiologiques et d'identifier des gènes dont la variation d'expression est corrélée au processus biologique étudié.

La DD RT-PCR (figure 1) consiste, dans un premier temps, en une transcription inverse des ARNm en quatre sous-classes d'ADNc. Ceci est réalisé grâce à quatre amorces oligonucléotidiques de douze thymines terminées en 3' par deux bases : V, indifféremment dATP, dCTP ou dGTP et N qui est une des quatre bases du code génétique. Les quatre amorces utilisées sont donc : oligoT₁₂VA, T₁₂VC, T₁₂VG et T₁₂VT.

Chacune des quatre sous-classes d'ADNc ainsi obtenues est ensuite amplifiée par PCR en présence d'un isotope radioactif par un couple d'amorce qui associe un oligo T₁₂VN et un décamère de séquence arbitraire. En théorie, vingt décamères suffisent pour amplifier et visualiser tous les ARNm d'une cellule, y compris ceux faiblement représentés.

Un même décamère va pouvoir s'hybrider à des distances variables de l'oligodT, suivant les ARNm, générant ainsi des produits PCR de tailles différentes. Ces produits PCR sont ensuite séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide puis révélés par autoradiographie.

La comparaison des profils électrophorétiques d'échantillons obtenus avec un même couple d'amorces permet de détecter des gènes exprimés différentiellement. L'ADN de ces bandes différentielles est purifié, cloné et séquencé permettant ainsi d'identifier un ou plusieurs gènes impliqués dans un processus biologique particulier.

Résultats et discussion

Observations microscopiques : choix d'un modèle d'étude

Les coupes cotylédonaires réalisées 24 et 48 heures après une infection secondaire ont permis de mettre en évidence la présence du champignon chez les plantes sensibles et le développement d'une réaction hypersensible chez les plantes résistantes, mais aucune structure fongique n'a pu être observée dans l'hypocotyle de ces plantes.

Les coupes transversales réalisées 20 jours après une infection secondaire montrent que l'hypocotyle des génotypes sensibles a le même aspect que celui des plantes témoins, cependant la présence du champignon est constatée dans les cellules du parenchyme cortical (haustoria) mais également entre ces cellules (hyphes). Les plantes résistantes développent quant à elles une réaction de type hypersensible conduisant à l'apparition de nécroses des cellules de l'épiderme et du parenchyme cortical. Mais le champignon est absent des parenchymes (figure 2).

La recherche de gènes spécifiquement exprimés par l'un ou par l'autre de ces organismes présente le risque d'isoler un gène de pathogène alors que l'on s'intéresse à ceux de l'hôte.

Ainsi, l'étude de l'expression d'un gène de calmoduline dans des tubercules de pomme de terre infectés par Phytophthora infestans a mis en évidence une augmentation d'ARNm de calmoduline du champignon et non de la plante [10]. L'utilisation de la technique de DD RT-PCR a permis d'isoler des gènes de Botrytis cinerea dont l'expression est induite dans la plante lors d'une interaction Lycopersicum esculentum/B. cinerea [11].

Plasmopara halstedii est un champignon biotrophe. Sa culture sur milieu synthétique est, à l'heure actuelle, impossible. Aucune étude concernant l'expression de ses gènes ne peut donc être réalisée.

Aussi, pour une caractérisation moléculaire des interactions H. annuus/P. halstedii, l'utilisation d'une technique d'infection artificielle par voie aérienne (infection secondaire) présente un avantage comparativement à une infection par voie racinaire (infection primaire).

Lors d'une infection primaire, le parasite pénètre au niveau de la partie basale de l'hypocotyle et croît vers l'apex de la plante. Il est donc présent dans l'hypocotyle des plantes résistantes et sensibles. Malgré des réactions de défense de la plante, le champignon peut atteindre les cotylédons et sporuler faiblement chez les plantes résistantes [2].

Les coupes transversales d'hypocotyles, réalisées 20 jours après une contamination secondaire, montrent que les plantes résistantes développent une réaction de type hypersensible avec l'apparition de nécroses des cellules de l'épiderme et du parenchyme cortical. Mais le champignon est absent des parenchymes. Chez les plantes sensibles, la présence du champignon est observée dans le parenchyme cortical.

Des études d'expression de gènes effectuées sur hypocotyles à la suite d'une infection secondaire permettent de penser que les variations d'expression observées chez les plantes résistantes concernent des gènes de la plante et non ceux du pathogène puisque le champignon ne se développe pas dans cet organe.

Enfin, pour les études moléculaires, la lignée choisie (RHA274) est infectée par deux races de P. halstedii : une race virulente (race 703) et une race avirulente (race 100).

Le choix d'un tel modèle permet d'être sûr que les différences observées entre combinaisons compatibles et incompatibles sont uniquement dues à des différences de réactions, d'expression de gènes de la plante puisque le fond génétique est le même quelle que soit la combinaison étudiée.

Differential display reverse transcription PCR (DD RT-PCR)

Afin d'identifier des gènes exprimés durant les premiers stades d'une infection de plantules de tournesol par l'agent du mildiou P. halstedii, nous avons choisi d'utiliser la technique de DD RT-PCR.

Des études précédentes [12] ayant montré une forte accumulation d'ARNm de :

- PAL : première enzyme intervenant dans les voies de biosynthèse des phénylpropanoïdes permettant d'obtenir par exemple des polymères de lignine intervenant dans le renforcement des parois cellulaires végétales, des phytoalexines qui sont des composés antimicrobiens...,

- chitinases : enzymes hydrolytiques pouvant avoir un rôle antifongique,

- ubiquitine : protéine intervenant dans le catabolisme de polypeptides,

dans l'hypocotyle des génotypes résistants 24 et 48 heures après une infection par P. halstedii, nous avons donc choisi d'analyser ces populations d'ARNm, extraits de plantes récoltées 24 et 48 heures après la contamination, par la technique de DD RT-PCR. Le choix de ces temps répondait à une exigence : avoir un maximum d'ARNm présents chez les plantes développant des réactions d'incompatibilité afin de cloner des gènes susceptibles d'être impliqués dans les mécanismes de résistance.

Des ARN extraits d'hypocotyles de plantes infectées par la race 100 (incompatibilité) ou la race 703 (compatibilité) ou de plantes témoins sont utilisés pour synthétiser des ADNc par transcription inverse à 42 °C. Ceux-ci servent ensuite de matrice pour les amplifications PCR.

Les différentes combinaisons d'amorces testées ont mis en évidence une forte similarité entre les profils électrophorétiques des plantes témoins, résistantes ou sensibles. Cependant, différentes observations peuvent être notées :

- certaines bandes semblent constitutives puisqu'elles sont présentes chez les témoins comme chez les résistants et les sensibles,

- certaines bandes sont détectées chez les témoins et non chez les résistants ou les sensibles,

- enfin, d'autres bandes sont apparemment spécifiques de l'état de résistance ou de sensibilité.

Dans nos expériences, nous ne nous sommes intéressés qu'aux bandes apparaissant spécifiquement dans les situations de résistance. Afin de réduire le nombre de faux positifs, seules les bandes spécifiques de l'état de résistance et présentes à 24 comme à 48 heures ont été testées.

Cette technique nous a ainsi permis d'isoler deux ADNc spécifiques de l'état de résistance : HaAC1 et Fl2 (figure 3A) pour lesquels une accumulation d'ARNm est observée lors des réactions de résistance (figure 3B) 24 et 48 heures après l'infection. Le premier clone différentiel HaAC1 présente des homologies avec des gènes induits par les auxines [8] et nous avons pu mettre en évidence une induction d'accumulation de transcrits de HaAC1 après des traitements par de l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D). Cependant, l'induction d'expression de cet auxin-induced gène ne semble pas être spécifique des auxines puisqu' une pulvérisation d'acide salicylique ou des blessures induisent également une accumulation d'ARNm de HaAC1.

L'identité du deuxième clone differentiel Fl2 n'a pu être établie. La séquence de l'ADNc cloné n'a révélé que quelques identités avec des protéines hypothétiques ou inconnues d'Arabidopsis thaliana. De plus, aucune accumulation des transcrits correspondants n'a été observée après des traitements par des auxines, de l'acide salicylique ou des blessures.

Afin de vérifier que ces clones correspondent bien à des gènes de tournesol et non des gènes de P. halstedii, une hybridation de type Southern est réalisée sur 10 µg d'ADN extrait de différents isolats de P. halstedii :

- 10 µg d'ADN des races 100, 703 et 300 digérés par EcoRI,

- 10 µg d'ADN des races 710 et 700 digérés par HindIII.

Un témoin d'hybridation est réalisé en parallèle sur 10 µg d'ADN de tournesol (génotype RHA274) digérés par EcoRI, EcoRV et HindIII.

Les autoradiographies (figure 4) ne permettent pas de détecter de signal d'hybridation sur l'ADN du champignon. En revanche, différentes bandes sont observées sur l'ADN de H. annuus. Ces résultats permettent donc de conclure que HaAC1 et Fl2 sont bien des gènes de H. annuus.

Le clonage de gènes impliqués dans un phénomène physiologique particulier peut se faire par différentes techniques. Le criblage par soustraction et le criblage différentiel étaient jusque-là largement utilisés pour cloner des séquences spécifiques d'un état.

Ces techniques sont séduisantes mais leur mise en œuvre reste délicate et lourde. Elles nécessitent en effet la fabrication d'au moins deux banques d'ADNc, une banque pour chaque état physiologique étudié.

L'identification de gènes spécifiquement induits chez les plantules de tournesols résistants à une infection par P. halstedii nécessite une comparaison avec des plantes témoins non infectées mais aussi avec des plantes sensibles. Il faut donc comparer trois conditions physiologiques différentes. Dans ce cas précis, la technique de criblage soustractif semblait lourde à mettre en place.

Aussi avons nous choisi d'utiliser la méthode de DD RT-PCR décrite pour la première fois en 1992 par Liang & Pardee [9]. Cette technique paraît plus rapide et plus simple à mettre en œuvre que celles précédemment citées. L'hypothèse de départ est la suivante : toutes les molécules d'ARNm présentes dans une cellule peuvent subir une transcription inverse et les ADNc obtenus peuvent être amplifiés par PCR. Les transcriptions inverses se font à l'aide d'amorces oligodT et les amplifications PCR avec les amorces précédemment citées et des amorces arbitraires.

Cette technique semble cependant présenter un inconvénient majeur : les faux positifs. Il s'agit de bandes qui apparaissent comme spécifiques d'un état physiologique particulier d'après les profils électrophorétiques, mais dont l'expression ne varie pas, une fois testées par hybridation de type Northern (hybridation ADN-ARN). Différentes procédures ont été proposées pour éliminer ces faux positifs [13, 14] mais chaque laboratoire semble opérer différemment. Il est à noter que si ce problème constitue une des principales critiques de la technique de DD RT-PCR, le criblage soustractif ne garantit pas l'absence de contaminations par des clones communs aux différentes conditions étudiées.

Dans notre cas, nous avons choisi d'analyser en parallèle des ARN extraits de plantes récoltées 24 et 48 heures après l'infection, c'est-à-dire d'utiliser des ADNc provenant de deux réactions de transcription inverse indépendantes, à partir d'échantillons différents. Et seuls des produits d'amplification détectés dans les combinaisons incompatibles à 24 comme à 48 heures ont été analysés. Si ce raisonnement peut nous faire passer à côté de gènes exprimés à 24 mais pas à 48 heures, et inversement, il nous a permis de cloner deux ADNc induits spécifiquement chez les génotypes résistants à 24 comme à 48 heures. Bien sûr, cette analyse simultanée s'appuyait sur les résultats obtenus avec les gènes de PAL, chitinase et ubiquitine [12] qui ont permis le choix des périodes d'étude.

Cette technique de DD RT-PCR peut présenter un autre risque : isoler un ADNc spécifique d'un état mais dont la variation d'expression ne sera pas visible par une hybridation de type Northern. En effet, la PCR permet d'amplifier toute molécule d'ADN. Même pour un ARN présent en très faible quantité dans la cellule, l'amplification de son ADNc permettra de l'isoler à partir des profils électrophorétiques mais l'étude de son expression par Northern pourra nécessiter plusieurs microgrammes d'ARN polyA. Pour le clone FL2 que nous avons isolé, il apparaît une bande différentielle très visible alors que l'expression de ce transcrit est faible.

En dépit de ces inconvénients, cette technique permet d'obtenir des ADNc spécifiques d'un état particulier. Une fois mise au point, elle est relativement facile d'utilisation. Pour un laboratoire qui dispose de très nombreuses amorces aléatoires utilisées en RAPD, elle est de moindre coût puisqu'elle ne nécessite pas la synthèse de nombreux oligonucléotides, hormis les quatre amorces dégénérées oligodT.

L'avantage majeur de cette technique dans notre cas est la possibilité de comparer facilement trois états physiologiques différents, témoin, sensible et résistant, prélevés à des temps différents. Ceci paraît nécessaire puisque l'expression de certains gènes peut être induite ou inhibée dans l'une ou l'autre condition.

CONCLUSION

La similitude des cinétiques d'accumulation des transcrits de PAL, chitinase, ubiquitine, HaAC1 et Fl2 suggère que l'induction d'expression de ces gènes est le résultat d'une reconnaissance spécifique par la plante d'un éliciteur race spécifique du champignon. En effet, le gène de résistance cloné possède des domaines NBS et LRR [15]. Ces derniers pourraient servir de site de liaison pour des ligands produits grâce à l'activité des gènes d'avirulence. Pour vérifier cette hypothèse, l'obtention des produits codés par ces gènes d'avirulence est une étape nécessaire.

A la suite de cette reconnaissance, directe ou indirecte, entre produits des gènes de résistance et d'avirulence, il y aurait transduction d'un signal jusqu'aux gènes de défense précédemment cités et induction d'expression de gènes de PAL, chitinase, ubiquitine, HaAC1 et Fl2 (figure 5).

La PAL pourrait donc intervenir dans le renforcement des parois cellulaires, dans la destruction du pathogène par la synthèse de phytoalexines, mais également dans le transduction de signaux puisqu'elle intervient dans la synthèse d'acide salicylique.

Les chitinases, enzymes hydrolytiques sont connues pour intervenir dans la réponse des plantes à des infections. Cependant, P. halstedii, Oomycètes, ne contient pas de chitine, aussi le rôle de ces enzymes dans la destruction du pathogène n'est pas clairement défini dans les interactions H.annuus/P. halstedii.

L'ubiquitine se complexant à des protéines destinées à être catabolisées, nos résultats permettent d'envisager une activation des voies de protéolyse en réponse à une infection fongique. La dégradation des complexes protéine-ubiquitine se faisant par les protéasomes, l'étude de ces derniers semble nécessaire. Un programme visant à analyser l'intervention des protéasomes est en cours de réalisation.

Concernant les clones HaAC1 et Fl2, la nature et le rôle des protéines codées par ces ADNc restent pour l'instant indéterminés. L'obtention de protéines recombinantes permettrait alors une meilleure caractérisation. Pour ce faire, une banque ADNc d'expression est en cours de criblage.

Enfin, ces différents marqueurs de résistance à P. halstedii pourraient être utilisés pour l'étude de la résistance du tournesol à Sclerotinia sclerotiorum. Cette résistance est de type polygénique, c'est-à-dire qu'elle fait intervenir plusieurs gènes. Il est possible que des gènes impliqués dans les mécanismes de résistance à P. halstedii soient aussi impliqués dans ceux de la résistance à S. sclerotiorum. En effet, même si les pathogènes différent, certains des mécanismes de défense élaborés par le tournesol doivent être semblables. Nos différents marqueurs de résistance à P. halstedii pourraient donc être utilisés pour la recherche de QTL (quantitative trait loci) impliqués dans la résistance du tournesol à S. sclerotiorum.

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