Study of the genetic variation of tall fescue varieties using AFLP markers

ARTICLE

agr.2012.0540

Auteur(s) : Mohammed Mefti¹ mmeftidz@yahoo.fr, Hamena Bouzerzour² hbouzerzour50@gmail.com

¹ Université Saad Dahlab Faculté des sciences agrovétérinaires et biologiques Département d’agronomie Route de Soumaa BP 270 09000 Soumaa Blida Algérie

² Université Farhat Abbas Faculté des sciences de la nature et de la vie Département de biologie végétale et d’écologie Setif Algérie

Tirés à part : M. Mefti

Les graminées fourragères pérennes jouent un important rôle en agriculture. Elles assurent de larges productions de viande et de lait, contribuent à la conservation des sols et à la protection de l’environnement (Wang et al., 2001). Le genre Festuca compte une centaine d’espèces, dont certaines sont couramment utilisées comme graminées fourragères (Soreng et Davis, 1998). Sur la base de la texture de leurs feuilles, ce genre se subdivise en deux types subgénériques : les fétuques à grandes feuilles telles que Festuca arundinacea et Festuca pratensis et les fétuques à feuilles fines telles que Festuca rubra et Festuca ovina (Turgen, 1985). La fétuque élevée (Festuca arundinacea) est le fourrage le plus utilisé, largement cultivé dans les régions tempérées (Sleper, 1985 ; Saha et al., 2005). La fétuque est une espèce allogame avec un haut degré d’auto-incompatibilité (Xu et al., 1991). Pour les besoins de l’amélioration de la production et de la qualité fourragère, il est utile d’avoir des informations sur la diversité génétique disponible. Les marqueurs moléculaires s’avèrent très utiles et efficaces dans ce contexte. Ils aident à identifier des populations très divergentes, utilisables comme matériel de départ dans des croisements, pour générer plus de variabilité. L’étude de la diversité génétique chez la fétuque est compliquée par l’allogamie qui caractérise cette espèce et qui fait que des différences apparaissent aussi bien à l’intérieure de la population qu’entre populations. C’est pour ces raisons que la diversité génétique chez de telles espèces est réalisée sur des mélanges (bulk) d’ADN provenant de plusieurs individus par population (Xu et al., 1994).

Parmi les techniques d’évaluation de la variabilité génétique, l’AFLP (amplified fragment length polymorphism) est une technique de marquage moléculaire permettant de révéler par PCR (polymerase chain reaction) des polymorphismes de restriction. Cette technique est très fiable et fournit beaucoup plus d’informations que la technique RAPD (random amplification of polymorphic DNA), puisqu’elle amplifie 10 fois plus de fragments. Le polymorphisme de longueur des fragments d’amplification est hautement reproductible, moins sensible aux conditions de la réaction et ne nécessite pas d’informations sur la séquence d’ADN (Krauss et Peakall, 1998 ; Vos et al., 1995). Fjellheim et Rognli (2005) ont évalué 12 cultivars nordiques et une population islandaise naturelle de fétuque des prés (Festuca pratensis Huds.) par la technologie des marqueurs AFLP et ont trouvé des niveaux élevés de diversité génétique. Reeves et al. (1998) ont utilisé des profils d’ADN issus de la technique AFLP pour déterminer la relation entre la taille du génome et l’altitude du site d’origine des populations naturelles de dactyles. L’objectif de la présente étude est d’évaluer la diversité génétique et de caractériser sept variétés de fétuque élevée, avec les marqueurs moléculaires AFLP.

Matériel et méthode

Matériel végétal

Les sept variétés de fétuque élevée (Festuca arundinacea Schreb.) qui ont fait l’objet d’analyse de la diversité génétique selon la technique AFLP sont indiquées au tableau 1. Ces variétés ont fait l’objet d’une étude agronomique approfondie au cours de la période 2005-2006 à 2008-2009, entrant dans le cadre du projet Permed¹ (Mefti et al., 2008 ; Pecetti et al., 2011). Les résultats montrent des différences significatives de comportement, de persistance et de production fourragère, suggérant des différences d’ordre génétique. Pour les besoins de l’analyse de la diversité génétique, des échantillons de la végétation des variétés mises en place sur le site expérimental de l’Institut technique des grandes cultures (ITCG) de Sétif ont été pris au cours de la campagne 2007-2008. Ces échantillons ont été analysés au laboratoire français de l’Institut national de la recherche agronomique (Inra) de Lusignan, au cours de la période allant du 1^er au 30 juin de l’année 2008.

Tableau 1 Description des variétés de fétuque étudiées.

Description of the studied varieties of tall fescue.

Extraction et amplification de l’ADN

L’ADN génomique de 20 individus par génotype a été extrait et purifié à partir de 50 mg de matière fraîche foliaire, selon la méthode du Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) (Webb et Knapp, 1990). L’ADN extrait est testé (degré de contamination de l’ADN par les ARN et les protéines) par spectrophotométrie en contrôlant l’absorbance, respectivement à 260 nm et à 280 nm (Sambrook et al., 1989). De même la quantité a été estimée visuellement sous rayons ultra-violets après migration sur gel d’agarose 0,8 % (w/v). Avant amplification, des bulks ont été constitués selon la méthode décrite par Mellish et al. (2002). Cinq bulks d’ADN de 4 individus ont été formés pour chaque variété, en utilisant 5μL d’ADN par individu. L’ensemble a été dilué par 100 μL d’eau Gibco®. L’amplification est réalisée dans un volume réactionnel de 20 μL de milieu contenant 125 ng d’ADN, 0,2 mM de dNTP, 0,5 U de Taq polymerase. La réaction d’amplification est effectuée dans un thermocycleur de type MJ PTC-100, selon le protocole de Vos et al. (1995) comprenant les étapes suivantes. La réaction de digestion enzymatique a été réalisée dans un thermocycleur à 37 ˚C pendant 2 heures, où près de 125 ng d’ADN génomique ont été digérés par deux enzymes de restriction, EcoRI et MseI pendant deux heures à 37 ˚C. La ligation des adaptateurs a été effectuée dans un volume final de 24 μL, grâce à l’action du tampon T4 DNA ligase ligase (Invitrogen) à 20 ˚C pendant 2 heures, enfin le produit est dilué au dixième dans de l’eau Gibco.

La réaction de préamplification est effectuée dans un volume de 22 μL contenant les amorces de préamplification EcoRI + A et MseI + C, mM de dNTP, 5 U/μL de Taq polymerase (MP Biomedicals), ainsi que le tampon de PCR 10X (MP Biomedicals) contenant déjà du MgCl₂. L’opération s’est déroulée dans un thermocycleur (MJ PTC-100) selon le procédé suivant : dénaturation de l’ADN pendant 30 secondes à 94 °C, suivie d’une minute à 56 °C et d’une minute d’élongation à 72 °C. Une étape finale d’élongation est réalisée à 72 °C pendant 10 minutes Ce cycle est répété 20 fois pour terminer avec une température finale de 10 °C.

L’amplification sélective est précédée par le marquage de l’amorce EcoR1 radioactivement par le pentamethine carbcyanine (IRD 700) fluorescente à la longueur d’onde de 760 nm grâce à l’action de la T4 Kinase. Il s’agit d’amplifier cette fois-ci 5 μL d’ADN digérés, ligaturés et préamplifiés qu’on a dilué 40 fois en utilisant deux couples d’amorces EcoRI + 3 et MseI + 4 (tableau 2). Les réactions de préamplification et d’amplification sélective s’effectuent grâce à l’action de la Taq DNA polymérase dans le thermocycleur. Pour cette amplification sélective le programme comprend une première étape de 10 cycles divisée en une phase de dénaturation initiale de 4 minutes à 94 ˚C suivie d’un cycle d’une minute à 94 ˚C, puis une phase d’hybridation d’une minute à 65 et une phase d’élongation d’une minute et 30 secondes à 72 ˚C. La deuxième étape est en revanche composée de 23 cycles (une minute à 94 ˚C pour la dénaturation, 30 secondes à 56 ˚C pour l’hybridation des amorces, une minute à 72 ˚C pour l’élongation)

Tableau 2 Adaptateurs et amorces utilisés pour l’analyse AFLP.

Adapters and primer combinations used for the AFLP analysis.

AFLP : amplified fragment length polymorphism.

Le fractionnement des produits de l’amplification est réalisé par un séquenceur d’ADN LI-COR, 4 000 L. Trois microlitres d’ADN dilué à 100 % sont mélangés à volume égal avec le tampon de charge (98 % formamide, 10 mM EDTA, 0,25 % bleu de Bromophénol, 0,25 % xylène Cyanole) puis dénaturés pendant 5 minutes à 95 °C. Six microlitres de chaque échantillon sont déposés dans chaque puits du gel de polyacrylamide à 6,5 % (w/v) sous un courant de 40W pendant 4 heures et à une température de 47 °C. Les profils sont traités par le logiciel SAGA pour la visualisation des bandes AFLP.

Analyse des données

La diversité génétique est estimée à partir de la matrice de présence (1) absence (0) des bandes polymorphes. La similarité génétique entre génotypes a été calculée d’après le coefficient de Jaccard (GSJ) :

où Ni représente le nombre de bandes détectées sur le génotype i et pas sur le génotype j ; Nj représente le nombre de bandes détectées sur le génotype j et pas sur le génotype i, alors que Nij est le nombre de bandes communes aux deux génotypes i et j.

Sur la base de la matrice de similitude un dendrogramme montrant les relations génétiques entre les variétés a été réalisé selon la méthode Unweighted pair group method using arithmetic average (UPGMA) attribuée à Sneath et Sokal (1973) en utilisant le logiciel PAST version 2.4 (Hammer et al., 2001). L’analyse en coordonnées principales (ACoP) est réalisée avec le même logiciel Past dans le but de regrouper les variétés étudiées.

Résultats et discussion

Les deux couples d’amorces AFLP utilisées pour analyser la distance génétique entre les différentes variétés par la méthode du bulk ont permis d’obtenir des profils d’amplification avec une bonne résolution des bandes et un niveau de variabilité des produits d’amplification assez important. Un total de 105 fragments dont la taille varie de 71 à 388 paires de bases (pb) a été obtenu ; avec 55 bandes générées par le premier couple d’amorces E-ACG/M-CACG et 50 bandes par le deuxième couple d’amorces E-ACA/M-CTCG (figures 1 et 2). Soixante-six fragments sont polymorphes, soit 62,85 % du nombre total des bandes observées. À ce sujet, Roldan-Ruiz et al. (2000) rapportent avoir trouvé 83 % de fragments AFLP polymorphes, chez le ray-grass. Ces auteurs qualifient ce taux d’élevé. Bolaric et al. (2005) rapportent, eux aussi, un degré de polymorphisme des marqueurs RAPD de 88 % chez le ray-grass anglais. Un taux de polymorphisme similaire, de 85.4 %, est rapporté par Majidi et al. (2006), chez la fétuque élevée, avec une moyenne de 10 à 75 bandes polymorphes engendrées par couple d’amorce. Dans ce contexte, Paglia et Morgante (1998) rapportent une moyenne de 12,6 fragments polymorphes par couple d’amorce. Selon Mian et al., 2002, l’amplification sélective avec le couple d’amorce EcoRI + 3 et MseI + 3 produit un nombre élevé de fragments (plus de 200) à séparer sur gel de polyacrylamide ; en revanche, la combinaison d’amorce EcoRI + 3 et MseI + 4 produit un nombre de fragments plus pratique allant de 80 à 100.

L’analyse des coefficients des similarités génétiques (GSJ) des marqueurs AFLP basées sur l’indice de Jaccard et du dendrogramme UPGMA montre des valeurs variant entre 0,35 et 0,8, avec une moyenne de 0,54 suggérant une assez grande variabilité intervariétale, et un coefficient de corrélation cophénétique r = 0,95 (tableau 3, figure 3). À ce sujet, Powell et al. (1996) et Lübberstedt et al. (2000) ont également obtenu des coefficients de similarités élevés pour les AFLP par rapport à d’autres marqueurs. La variété australienne Fraydo et la variété française Lutine présentent la plus grande divergence génétique (GSJ = 0,35). Fraydo apparaît génétiquement proche des variétés française Centurion et sud-américaine Flecha. Quant aux variétés européennes Tanit et Sisa, elles présentent une grande similitude génétique (GSJ = 0,73) et forment un groupe, lui-même très distant génétiquement de la variété française Lutine, et assez éloigné de la variété Centurion bien que ces deux dernières variétés soient des obtentions du même institut (Institut national de la recherche agronomique [Inra], France) (figure 3).

Tableau 3 Distances génétiques entre les différentes variétés de fétuque basées sur l’indice de Jaccard.

Genetic distance between tall fescue varieties based on Jaccard's index.

Les deux premiers axes de l’analyse en coordonnées principales (ACoP) expliquent 65,0 % de la variation totale disponible dans la matrice soumise à l’analyse, avec respectivement 41,2 % pour le premier axe et 23,9 % pour le second (figure 4). Les résultats de l’ACoP confirment ceux du dendrogramme UPGMA. L’axe 1 discrimine nettement entre Fraydo et Lutine, alors que l’axe 2 oppose le groupe formé par Flecha, Flecha endophyté (E-542) et Centurion à celui formé par Tanit et Sisa (figure 4).

Ces divergences entre accessions semblent avoir pour cause les origines géographiques. En effet, Sharma et al. (2000) pour le genre Morus, Vergara et Bughrara (2003) pour le genre Agrostis rapportent des corrélations positives entre les distances des marqueurs moléculaires de type AFLP et les coordonnées de l’origine géographique. En revanche, Cresswell et al. (2001) ainsi que Bolaric et al. (2005) pour le genre Lolium n’ont pas observé de liaisons significatives entre la distance géographique et les marqueurs moléculaires AFLP étudiés.

La méthode d’ADN bulk a été déjà utilisée par Mian et al. (2002) pour faire la distinction entre 18 populations de fétuque élevée. Yu et Pauls (1993)Sweeny et Danneberger (1997) et Warburton et al. (2000) ont aussi évalué la diversité génétique fondée sur des marqueurs moléculaires entre des populations respectives de Medicago sativa, de ray-grass anglais et de maïs à travers des échantillons d’ADN en bulk. Cette stratégie est appliquée pour évaluer la diversité des populations d’espèces allogames (Mian et al., 2002). L’utilisation des marqueurs AFLP constitue un outil précieux pour l’identification des variétés commercialisées comme le mentionnent Roldan-Ruiz et al. (2000).

Conclusion

Les résultats obtenus mettent en exergue la différenciation des différentes variétés étudiées, issues de diverses origines. Elles confirment aussi, dans ce cadre-là, le grand intérêt des marqueurs moléculaires, en particulier de type AFLP, dans l’analyse de la diversité génétique et de l’identification variétale. En effet, cette technique a permis une bonne discrimination et un regroupement des accessions étudiées. L’utilisation de ces accessions relativement diversifiées dans un programme d’amélioration permettra certainement d’accélérer le processus d’amélioration variétale. Enfin, l’utilisation de cette technologie sur un large éventail de populations de fétuques algériennes présente un intérêt certain dans l’orientation ultérieure des prospections et collectes du matériel génétique local, également dans le but d’accélérer le processus de son amélioration génétique.

Remerciements

Nos remerciements s’adressent au ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique ainsi qu’aux responsables du Laboratoire de biologie moléculaire de l’Unité de recherche pluridisciplinaire « Prairies et plantes fourragères » de l’Inra de Lusignan. Nous tenons à remercier en particulier le Dr Philippe Barre pour son accueil et ses orientations, la Dr Sandrine Flojolot pour ses orientations ainsi que M^me Françoise Durand pour son assistance technique.

Références

Bolaric S, Barth S, Melchinger AE, Posselt UK ,,,, 2005. Molecular genetic diversity within and among German ecotypes in comparison to European perennial ryegrass cultivars. 2005. ; Molecular genetic diversity within and among German ecotypes in comparison to European perennial ryegrass cultivars. Plant Breeding 2005 ; 24 : 257-262.

Bouton JH, Latch GCM, Hill NS, Hoveland CS, McCann MA, Watson RH, et al. ,,,,, , 2002. Reinfection of tall fescue cultivars with non-ergot alkaloid–producing endophytes. 2002. ; Reinfection of tall fescue cultivars with non-ergot alkaloid–producing endophytes. Agronomy Journal 2002 ; 94 : 567-574.

Cresswell A, Hamilton NRS, Roy AK, Viegas MF ,,,, 2001. Use of amplified fragment length polymorphism markers to assess genetic diversity of Lolium species from Portugal. 2001. ; Use of amplified fragment length polymorphism markers to assess genetic diversity of Lolium species from Portugal. Molecular Ecology 2001 ; 10 : 229-241.

Fjellheim S, Rognli OA. Genetic diversity within and among Nordic meadow fescue (Festuca pratensis Huds.), 2005. Cultivars Determined on the Basis of AFLP Markers. Crop Science 45 : 2081-6.

Hammer Ø, Harper DAT, Ryan PD, 2001. PAST. Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica 4 : 9 p. http://palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01.htm.

Krauss S, Peakall R, 1998. An evaluation of the AFLP fingerprinting technique for the analysis of paternity in natural population of Persoonia mollis (Proteaceae). Australian Journal of Botany 46 : 533-46.

Lelièvre F, Satger S, Volaire F, 2008. Water use efficiency in a mild season and water cost of summer survival of perennial forage grasses in Mediterranean areas. Options Méditerranéennes, Ser A (79) : 259-63.

Lübberstedt TH, Melchinger AE, Dussle D, Vuylsteke M, Kuiper M, 2000. Relationships among early European maize inbreds: IV. Genetic diversity revealedwith AFLP markers and comparison with RFLP, RAPD and pedigree data. Crop Science 40 : 783-91.

Majidi MM, Mirlohi AF, Sayed-Tabatabaei BE ,,, 2006. AFLP Analyses of genetic variation in Iranian fescue accessions. 2006. ; AFLP Analyses of genetic variation in Iranian fescue accessions. Pakistan Journal of Biological Sciences 2006 ; 9 : 1869-1876.

Malinowski DP, Zuo H, Kramp BA, Muir JP, Pinchak WE ,,,,, 2005. Obligatory Summer-Dormant Cool-Season Perennial Grasses for Semiarid Environments of the Southern Great Plains. 2005. ; Obligatory Summer-Dormant Cool-Season Perennial Grasses for Semiarid Environments of the Southern Great Plains. Agronomy Journal 2005 ; 97 : 147-154.

Mellish A, Coulman B, Ferdinandez Y ,,, 2002. Genetic Relationships among Selected Crested Wheatgrass Cultivars and Species determined on the Basis of AFLP Markers. 2002. ; Genetic Relationships among Selected Crested Wheatgrass Cultivars and Species determined on the Basis of AFLP Markers. Crop Science 2002 ; 42 : 1662-1668.

Mefti M, Bouzerzour H, Abdelguerfi A, Nouar H ,,,, 2008. Morphological and Growth characteristics of Perennial Grass cultivars Grown under Semi-Arid conditions of the Algerian High Plateaus. 2008. ; Morphological and Growth characteristics of Perennial Grass cultivars Grown under Semi-Arid conditions of the Algerian High Plateaus. Journal of Agronomy 2008 ; 7 : 38-47.

Mian AR, Hopkins AA, Zwonitzer JC ,,, 2002. Determination of genetic diversity in tall fescue with AFLP markers. 2002. ; Determination of genetic diversity in tall fescue with AFLP markers. Crop Science 2002 ; 42 : 944-950.

Paglia G, Morgante M ,, 1998. PCR-based multiplex DNA fingerprinting techniques for the analysis of conifer genomes. 1998. ; PCR-based multiplex DNA fingerprinting techniques for the analysis of conifer genomes. Molecular Breeding 1998 ; 4 : 173-177.

Pecetti L, Annicchiarico P, Abdelguerfi A, Kallida R, Mefti M, Porqueddu C, et al. ,,,,, , 2011. Response of Mediterranean Tall Fescue Cultivars to Contrasting Agricultural Environments and Implications for Selection. 2011. ; Response of Mediterranean Tall Fescue Cultivars to Contrasting Agricultural Environments and Implications for Selection. Journal of Agronomy and Crop Science 2011 ; 197 : 12-20.

Powell W, Morgante M, Andre C, Hanafey M, Vogel J, Tingey S, Rafalski A ,,,,,,, 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. 1996. ; The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 1996 ; 2 : 225-238.

Reed KMM, Lee CK, Jahufer MZZ, Anderson MW, 2004. Fraydo tall fescue (Festuca arundinacea L.). Australian Journal of Experimental Agriculture 44: 955-7.

Reeves G, Francis D, Davis MS, RogersHJ Hodkinson TR ,,,,, 1998. Genome size is negatively correlated with altitude in natural populations of Dactylis glomerata. 1998. ; Genome size is negatively correlated with altitude in natural populations of Dactylis glomerata. Annals of Botany 1998 ; 82 : 99-105.

Roldan-Ruiz I, Dendauw J, Van Bockstaele E, Depicker A, De Loose M ,,,,, 2000. AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses (Lolium spp.). 2000. ; AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses (Lolium spp.). Molecular Breeding 2000 ; 6 : 125-134.

Saha MC, Mian R, Zwonitzer JC, Chekhovskiy K, Hopkins AA, 2005. An SSR and AFLP based genetic linkage map of tall fescue (Festuca arundinacea Schreb.). Theoretical Applied Genetics 110 : 323-36.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 1989. Molecular cloning : A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor (NY) : Harbor Laboratory.

Sharma A, Sharma R, Machii H ,,, 2000. Assesment of genetic diversity in a Morus germplasm collection using fluorescens-based AFLP markers. 2000. ; Assesment of genetic diversity in a Morus germplasm collection using fluorescens-based AFLP markers. Theoretical Applied Genetics 2000 ; 101 : 1049-1055.

Sleper DA , 1985. Breeding tall fescue. 1985. ; Breeding tall fescue. Plant Breeding Reviews 1985 ; 3 : 313-342.

Soreng RJ, Davis JI ,, 1998. Phylogenetics and character evolution in the grass family (Poaceae) : simultaneous analysis of morphological and chloroplast DNA restriction site character sets. 1998. ; Phylogenetics and character evolution in the grass family (Poaceae) : simultaneous analysis of morphological and chloroplast DNA restriction site character sets. Botanical Review 1998 ; 64 : 1-85.

Sweeny PM, Danneberger TK ,, 1997. RAPD markers from perennial ryegrass DNA extracted from seeds. 1997. ; RAPD markers from perennial ryegrass DNA extracted from seeds. Horticultural Science 1997 ; 32 : 1212-1215.

Turgen AJ, 1985. Turf grass managements. Reston (Virginia) : Reston publishing company.

Vergara GV, Bughrara SS ,, 2003. AFLP analyses of genetic diversity in bentgrass. 2003. ; AFLP analyses of genetic diversity in bentgrass. Crop Science 2003 ; 43 : 2162-2171.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee T, Hornes M, et al. ,,,,, , 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. 1995. ; AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research 1995 ; 23 : 4407-4414.

Wang Z, Hopkins A, Main R ,,, 2001. Forage and turfgrass biotechnology. 2001. ; Forage and turfgrass biotechnology. Critical Reviews in Plant Sciences 2001 ; 20 : 573-619.

Warburton ML, Hoisington DA, Xia XC, Charcosset A, 2000. Fingerprinting maize populations using a bulking strategy. In : 2000 Annual Meeting Abstracts. Madison (Wisconsin) : ASA; CSSA; SSSA.

Webb DM, Knapp SJ ,, 1990. DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. 1990. ; DNA extraction from a previously recalcitrant plant genus. Plant Molecular Biology Reporter 1990 ; 8 : 180-185.

Xu WW, Sleper DA, Hoisington DA ,,, 1991. A survey of restriction fragment length polymorphisms in tall fescue and itsrelatives. 1991. ; A survey of restriction fragment length polymorphisms in tall fescue and itsrelatives. Genome 1991 ; 34 : 686-692.

Xu WW, Sleper DA, Krause GF ,,, 1994. Genetic diversity of tall fescue germplasm based on RFLPs. 1994. ; Genetic diversity of tall fescue germplasm based on RFLPs. Crop Science 1994 ; 34 : 246-252.

Yu K, Pauls KP ,, 1993. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of alfalfa by random amplification of genomic DNA samples. 1993. ; Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of alfalfa by random amplification of genomic DNA samples. Theoretical Applied Genetics 1993 ; 86 : 788-794.

¹ Projet financé par l’Union européenne (UE), contrat N^o INCO-CT-2004-509140 et intitulé : « Improvement of native perennial forage plants for sustainability of Mediterraean farming systems ».