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Adaptation of free and total plasma carnitine determination on the Dimension ^® HM, X-Pand model (Dade Behring)

Annales de Biologie Clinique. Volume 66, Number 2, 207-13, mars-avril 2008, pratique quotidienne

DOI : 10.1684/abc.2008.0208

Résumé

Summary

Author(s) : H Kerspern, J-L Carré , Service de biochimie et biologie moléculaire, CHU de Brest.

Summary : L-carnitine is a quaternary ammonium compound that facilitates long-chain fatty acids crossing through the mitochondrial membrane allowing their β-oxidation. Human pathologies relatives to carnitine are mainly deficiencies, with myopathy and lipids metabolism disorders. The aim of this study was to validate the free and total carnitine plasmatic level measurement using the Dimension ^® HM, X-Pand model analyzer (Dade Behring). Free carnitine was directly determined on plasma samples, deproteinized by using ultrafiltration, whereas total carnitine was measured after alkaline hydrolysis. Within-day and between-day imprecision were <\; 4,00 and 9,00 % respectively. The method is linear through 250,00 μmol/L and the limit of quantification is 3,00 μmol/L. Our method was correlated to tandem mass spectrometry (r \= 0,956 for free and total carnitine). Recovery of free and total carnitine from spiked plasmas was > 99 %. On board stability of cartridge (5 days) and of calibration (at least 30 days) are in agreement with a method easily adaptable in routine laboratories.

Keywords : carnitine, acylcarnitines, Dimension ^® HM, X-Pand model, spectrophotometry, deficiencies

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ARTICLE

Auteur(s) : H Kerspern, J-L Carré

Service de biochimie et biologie moléculaire, CHU de Brest

Article reçu le 4 Octobre 2007, accepté le 31 Decembre 2007

La L-carnitine est un ammonium quaternaire présent naturellement chez tous les mammifères. Sa principale fonction est de faciliter le transport des acides gras à longue chaîne à travers la membrane mitochondriale permettant leur β-oxydation. Chez l’homme, le pool endogène de carnitine, constitué de L-carnitine libre et d’esters de carnitine, est maintenu constant par l’absorption de carnitine à partir du bol alimentaire, par une synthèse endogène, et par une réabsorption tubulaire importante. Les principaux troubles du métabolisme de la carnitine sont des déficits ; ils associent une cardiomyopathie, une myopathie touchant les muscles squelettiques, une hypoglycémie et une hyperammoniémie. Des déficits secondaires peuvent être observés dans l’hémodialyse, les aciduries organiques, ou encore un traitement par l’acide valproïque [1].

Il existe actuellement de nombreuses méthodes permettant le dosage de carnitine plasmatique, parmi lesquelles la méthode radioenzymatique, la chromatographie liquide (HPLC) ou la spectrométrie de masse en tandem. Les méthodes spectrophotométriques, utilisant comme enzyme la carnitine déshydrogénase ou la carnitine acétyl transférase (EC 2.3.1.7), restent cependant les plus appropriées pour une automatisation [2, 3]. Le but de notre étude a été d’établir une méthode qui puisse être adaptée sur l’analyseur Dimension^® HM, modèle X-Pand (Dade Behring) sur un canal ouvert, et qui permette le dosage de carnitine libre et totale dans le plasma grâce à la carnitine acétyl transférase (CAT).

Matériels et méthodes

Principe

Le principe de la réaction est le suivant :

Cette réaction réversible est rendue unidirectionnelle par la neutralisation du coenzyme A (CoA-SH) par le réactif d’Ellman ou DTNB (acide 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoïque)) qui permet la formation du 5-thio-2-nitrobenzoate (TNB). La concentration de TNB est mesurée par spectrophotométrie à 400 et 940 nm (940 nm étant la longueur d’onde utilisée pour corriger les absorbances non spécifiques observées à 400 nm). Après hydrolyse alcaline, le dosage de la carnitine totale (CT), correspondant à la somme des carnitines libre (CL) et estérifiée (CE), est réalisé dans les mêmes conditions que précédemment.

Réactifs

Les Annexes 1 et 2 précisent les références, la préparation et la conservation des réactifs, le mode de reconstitution des solutions de travail A et B, ainsi que la procédure de préparation des Flex du Dimension^® HM, modèle X-Pand préconisée par la société Dade Behring.

Trois niveaux de contrôle sont utilisés pour la carnitine libre : contrôle de bas niveau (CQ1) : solution à 12,50 μmol/L de L-carnitine (Sigma, réf. C7518) ; contrôle de moyen niveau (CQ2) : pool de 50 ultrafiltrats de plasmas recueillis chez des patients ne présentant cliniquement aucun signe d’anomalie du métabolisme de la carnitine ; contrôle de haut niveau (CQ3) : solution à 200,00 μmol/L de L-carnitine. Les solutions de L-carnitine CQ1 et CQ3 sont préparées indépendamment de la solution de calibration.

Pour la carnitine totale, un seul contrôle est passé (CQ4) : il s’agit du pool de 50 ultrafiltrats ayant subi une hydrolyse alcaline puis une neutralisation.

Tous les contrôles sont passés à chaque série.

Préparation des échantillons

Les échantillons sanguins ont été recueillis chez 123 adultes volontaires (à jeun depuis au moins 12 heures) dans des tubes héparinés (Vacutainer^®, ref. 368484) centrifugés à 3 500 tours/min pendant 15 minutes ; les plasmas sont immédiatement analysés ou congelés à - 20 °C. Deux millilitres de plasma (frais ou congelé à - 20 °C) sont placés dans un filtre Centricon Ultracel YM10 (Millipore) pour une ultrafiltration à 8 450 tours/min (2 000 g), pendant une heure à 25 °C. L’ultrafiltrat est ensuite recueilli pour l’analyse.

Les échantillons pour le dosage de carnitine totale sont préparés par hydrolyse alcaline : 200 μL d’ultrafiltrat mélangés à 100 μL de NAOH 0,15 N sont hydrolysés pendant une heure à 37 °C. Cet hydrolysat est ensuite neutralisé par 75 μL d’HCl 0,15 N. Un minimum de 180 μL d’échantillon (ultrafiltrat pour la carnitine libre ou hydrolysat pour la carnitine totale) est nécessaire pour des dosages en double.

Paramètres du programme

Cette méthode en point final utilise un canal ouvert en mode absorbance. Le mode de paramétrage du Dimension^® HM, modèle X-Pand a été fourni par la société Dade Behring et est mentionné en Annexe 2. Le temps d’analyse est de 16 minutes. Une calibration en 5 points est réalisée (0,00 ; 25,00 ; 50,00 ; 100,00 ; 200,00 μmol/L). Le mode de calcul utilisé est le mode Logit.

Protocole d’étude

La réalisation de cette étude suit le protocole rédigé par les membres de la commission «Validation de techniques» de la Société française de biologie clinique et les recommandations édictées par celle-ci quant aux coefficients de variations (CV %) [4]. Les caractéristiques analytiques suivantes ont été étudiées : précision (répétabilité et reproductibilité), linéarité, limite de détection, exactitude (test de surcharge), comparaison avec la méthode de référence (spectrométrie de masse en tandem). L’étude des interférences habituelles (hémolyse, turbidité, bilirubine) n’a pas été réalisée ici. En effet, le dosage de la carnitine s’effectue sur l’ultrafiltrat et non sur le plasma directement : les filtres Amicon retenant toutes les molécules de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, on ne retrouve donc dans l’ultrafiltrat aucune de ces substances susceptibles d’interférer. L’influence de la congélation sur un échantillon, ainsi que la stabilité dans le temps des réactifs et des calibrateurs ont également été testées. Enfin, nous avons établi des valeurs de référence pour la technique étudiée.

Résultats

Répétabilité

L’essai de répétabilité pour la carnitine libre a été réalisé à trois niveaux de concentration (bas, moyen et élevé à des concentrations respectives de 12,50 ; 50,00 ; et 200,00 μmol/L), à partir de solutions de L-carnitine, en réalisant 20 mesures de chaque niveau en une seule série. Concernant la carnitine totale, l’essai de répétabilité a été réalisé sur le contrôle CQ4. Compte tenu du nombre de dosages (n = 20) et du risque α choisi à 5 %, le calcul de l’intervalle de confiance du CV donne une limite d’acceptabilité à 3,71 % pour CQ1, 1,48 % pour CQ2, 1,28 % pour CQ3 et 4,68 % pour CQ4. La répétabilité, présentée dans le tableau 1 et calculée aux trois niveaux de concentration, répond donc aux critères de validation.

Tableau 1 Etudes de répétabilité et de reproductibilité (carnitine libre (CL) sur 3 niveaux de contrôle et carnitine totale (CT) sur un niveau de contrôle).

Répétabilité	Contrôles (n = 20)	Moyenne (μmol/L)	Ecart-type (μmol/L)	Coefficient de variation (%)
CQ1	12,48	0,44	3,52
CQ2	49,88	0,61	1,22
CQ3	200,55	1,37	0,68
CQ4	61,40	2,26	3,69
Reproductibilité	Contrôles (n = 5x2)	Moyenne (μmol/L)	Ecart-type (μmol/L)	Coefficient de variation (%)
CQ1	11,32	0,91	8,02
CQ2	33,49	0,81	2,42
CQ3	201,41	1,36	0,68
CQ4	60,89	2,99	4,91

Reproductibilité

L’essai de reproductibilité a été réalisé sur les mêmes contrôles (CQ1, CQ2, CQ3, CQ4) à raison de 2 séries par jour pendant 5 jours. Chaque jour, deux mesures de chaque échantillon ont été réalisées. Compte tenu du nombre de dosages (n = 10) et du risque α choisi (5 %), l’intervalle de confiance du CV donne un CV limite calculé de 8,59 % pour CQ1, 2,92 % pour CQ2, 1,52 % pour CQ3 et 6,76 % pour CQ4 (tableau 1), ce qui est tout à fait acceptable.

Limite de quantification

La détermination de la limite de détection est difficilement réalisable, dans la mesure où l’automate, en deçà d’un certain seuil, ne rend pas une valeur mais un message d’alarme (« résultat inférieur au domaine de calcul »). La limite de quantification, plutôt que la limite de détection, a donc été déterminée par des dilutions successives d’une solution à 250,00 μmol/L de carnitine servant également à l’étude de la linéarité.

Pour le point de gamme 1/128 (1,95 μmol/L), l’automate rend des résultats aléatoires : soit des valeurs, soit le message d’alarme. Nous nous sommes donc intéressés à des dilutions moindres, et pour le point de gamme 1/64 dilué aux 2/3, soit environ 2,60 μmol/L, l’automate rend des valeurs tout à fait répétables (CV = 8,90 %). Nous avons donc fixé à 3,00 μmol/L la valeur de la limite de quantification.

Linéarité

La linéarité a été étudiée grâce à une gamme de dilution géométrique de progression 2 à partir d’une solution de L-carnitine à 250,00 μmol/L. Trois gammes ont été passées chaque jour sur l’automate, pendant trois jours consécutifs, et tous les points de gamme ont été mesurés en double. Compte tenu de la limite de quantification déterminée au paragraphe précédent, nous n’avons conservé que les valeurs supérieures à 3,00 μmol/L. L’observation des résultats et la courbe obtenue permettent de conclure à une linéarité parfaite de 3,00 à 250,00 μmol/L (figure 1).

Exactitude (test de surcharge)

Les solutions utilisées pour la surcharge ont été celles préparées pour l’étude de linéarité. Les concentrations s’étendent donc de 250,00 à 3,91 μmol/L, l’eau distillée étant utilisée pour le point 0,00. La surcharge a été réalisée sur un ultrafiltrat obtenu à partir d’un pool de 20 plasmas. Pour chaque dosage (réalisé en double), un mélange à volume égal de la solution de concentration connue et de l’ultrafiltrat a été réalisé et les taux de carnitine libre et totale déterminés à chaque fois. Pour chacun des deux tests (CL et CT), une droite de régression linéaire a été établie entre les valeurs théoriques et les valeurs mesurées. Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les résultats théoriques de carnitine libre et totale, et ceux obtenus avec l’ultrafiltrat surchargé. Les coefficients de corrélation respectifs entre les deux tests sont de 0,998 et 0,994.

Comparaison avec la technique de référence (corrélation)

Quarante-trois échantillons ont été dosés à la fois par spectrométrie de masse en tandem à l’hôpital Debrousse à Lyon, et par spectrophotométrie sur l’automate Dimension^® HM, modèle X-Pand. Les résultats obtenus (figure 2) nous donnent un biais négatif pour la méthode sur Dimension^® HM, modèle X-Pand de 6,18 % pour la CL et de 12,95 % pour la CT. En réalisant un test de Student sur séries appariées, nous ne mettons en évidence aucune différence significative entre les taux de CL et CT obtenus par spectrophotométrie et ceux obtenus par spectrométrie de masse en tandem.

Stabilité des réactifs

La stabilité des réactifs A et B reconstitués et placés dans un « flex » a été testée. Pour cela, le flex est resté à bord de l’automate pendant 18 jours. Le taux de carnitine libre d’un pool de plasmas a alors été mesuré deux fois par jour. Les résultats sont les suivants : perte à j+5 : 9,36 % ; perte à j+10 : 17,30 % ; perte à j+15 : 22,39 % ; perte à j+18 : 26,73 %. Une perte inférieure à 10 %, jugée comme acceptable, est observée après 5 jours de préparation du flex. Nous avons donc fixé à 5 jours la durée de vie maximale à bord de l’automate. Ceci est tout à fait satisfaisant, dans la mesure où les échantillons peuvent être congelés sans altération, et donc regroupés par séries hebdomadaires.

Stabilité de l’échantillon à la congélation

Nous avons testé l’effet de 7 jours de congélation sur 5 ultrafiltrats (dosés en double). Nous ne mettons pas en évidence de différence significative sur les taux de CL et CT entre les plasmas frais ou congelés.

Stabilité des calibrateurs

A la congélation

L’éventuelle altération par la congélation à - 20 °C de la solution concentrée de L-carnitine à 200,00 μmol/L servant à reconstituer les calibrateurs a été étudiée. Pour cela, différents points de gamme correspondant aux calibrateurs ont été préparés à partir d’une solution à 200 μmol/L conservée un mois à - 20 °C. Ces solutions ont été passées sur l’automate avec la calibration du moment. Chaque point de gamme a été dosé en double. Aucune différence significative n’a pu être mise en évidence entre les valeurs trouvées à j0 et celles trouvées à j30. La solution de calibration est donc considérée comme restant stable un mois à - 20 °C.

A bord de l’automate

Quatre contrôles de qualité ont été passés en double quotidiennement pendant un mois. Un mois après la calibration, les contrôles passés quotidiennement rendent des valeurs correctes dont les CV restent inférieurs aux CV limites calculés à partir de l’intervalle de confiance du CV (6,85 % pour CQ1, 3,69 % pour CQ2, 1,40 % pour CQ3 et 6,27 % pour CQ4). La calibration est donc stable un mois au minimum.

Intervalles de référence

Les valeurs de carnitine libre et totale ont été mesurées dans le plasma de 123 volontaires adultes (47 hommes et 76 femmes), ce qui nous a permis d’établir des valeurs moyennes de référence : 24,15 à 43,39 μmol/L pour la carnitine libre, et 32,34 à 55,97 μmol/L pour la carnitine totale. L’âge moyen est de 42 ans (16 à 81 ans).

Discussion et conclusion

Nous décrivons ici une méthode de mesure de la carnitine libre et totale dans le plasma, mise au point sur l’automate Dimension^® HM, modèle X-Pand (société Dade-Behring). Les résultats obtenus pour la validation technique sont tout à fait satisfaisants : cette méthode spectrophotométrique est précise, simple et rapide (les résultats sont obtenus en moins de 20 minutes). La limite de quantification (3,00 μmol/L) et la linéarité sont acceptables par rapport au domaine de mesure habituellement exploité. La limite de quantification, pouvant parfois être atteinte lors de déficits en carnitine (par exemple chez l’hémodialysé), est cohérente par rapport à celle obtenue par les autres méthodes automatisées [2, 3]. Le test de surcharge donne un taux de recouvrement de 99,8 % pour la carnitine libre, et de 99,4 % pour la carnitine totale. La stabilité des réactifs à bord (5 jours), et celle de la solution de calibration (un mois au minimum) sont largement compatibles avec une utilisation en routine, d’autant que les dosages peuvent être réalisés par séries, sur des échantillons dont la stabilité n’est pas altérée par la congélation. Les interférences habituelles telles que l’hémolyse, la bilirubine et les triglycérides n’interviennent pas ici du fait de l’ultrafiltration. La comparaison avec la méthode par spectrométrie de masse en tandem montre une excellente corrélation (r > 0,956 pour CL et CT). Il n’a pas été mis en évidence de différence significative entre les valeurs de CL et CT obtenues par spectrophotométrie et par spectrométrie de masse en tandem. Cependant, il est observé un biais négatif pour la méthode sur Dimension^® HM, modèle X-Pand respectivement de 6,18 % et de 12,95 % pour la CL et la CT. Il est difficile de comparer ces résultats à ceux de la littérature car les auteurs comparent le plus souvent la méthode spectrophotométrique à la méthode radioenzymatique, ou à d’autres méthodes spectrophotométriques [2, 3]. En outre, la corrélation entre les deux méthodes spectrophotométriques automatisées (Dimension^® HM, modèle X-Pand et Hitachi 917) a révélé un biais négatif pour la méthode sur X-Pand respectivement de 5,40 % et de 6,30 % pour la CL et la CT [2]. Les intervalles de référence obtenus pour une population adulte (24,15 à 43,39 μmol/L pour la carnitine libre, et 32,34 à 55,97 μmol/L pour la carnitine totale) sont comparables à ceux obtenus dans la littérature [5]. En définitive, cette méthode est caractérisée par sa fiabilité et son automatisation, et donc sa capacité à être employée dans un laboratoire de routine.

Remerciements

Les auteurs remercient le docteur Vianey-Saban (Service de biochimie, Lyon) pour la réalisation des dosages par spectrométrie de masse, et le docteur Simard (Service de biochimie, Angers) pour sa collaboration biologique.

Références

1 Hoppel C. The role of carnitine in normal and altered fatty acid metabolism. Am J Kidney Dis 2003 ; 41(Suppl. 4) : S4-S12.

2 Ghoshal AK, Soldin SJ. Determination of total and free plasma carnitine concentrations on the Dade Behring Dimension RxL : Integrated chemistry system. Clin Chim Acta 2005 ; 361 : 80-5.

3 Cibulka R, Siroka R, Trefil L, Racek J, Vesela E. Measurement of carnitine in hemodialysis patients - adaptation of an enzymatic photometric method for an automatic analyser. Clin Chem Lab Med 2006 ; 44 : 983-6.

4 Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C, et al. Protocole de validations de techniques. Ann Biol Clin (Paris) 1986 ; 44 : 686-745.

5 Lennon DL, Shrago ER, Madden M, Nagle FJ, Handson P. Dietary carnitine intake related to skeletal muscle and plasma carnitine concentrations in adult men and women. Am J Clin Nutr 1986 ; 43 : 234-8.

Adaptation of free and total plasma carnitine determination on the Dimension ® HM, X-Pand model (Dade Behring)