Chromosomal abnormalities in human oocyte : formation, etiology and detection

ARTICLE

Auteur(s) : Frank Pellestor, Samir Hamamah

Inserm U874, Département de Médecine et Biologie de la Reproduction, CHRU de Montpellier, Hôpital Arnaud de Villeneuve, 371, avenue du Doyen Gaston Giraud, 34295 Montpellier Cedex 5

Les anomalies chromosomiques numériques (aneuploïdies), dues à un excès (hyperploïdie) ou à un défaut (hypoploïdie) de chromosomes, sont à l’origine de la majeure partie des pertes embryonnaires en périodes pré- et post-implantatoires. Pour l’essentiel, ces anomalies sont issues d’erreurs de ségrégation chromosomique (non-disjonction) au cours de la méiose féminine, et en particulier lors de la première division méiotique [1]. Depuis de nombreuses années, l’analyse cytogénétique des ovocytes humains constitue un sujet d’études particulièrement intéressant, compte tenu de la prépondérance des anomalies chromosomiques d’origine maternelle dans les conceptions humaines, et de notre connaissance encore partielle des mécanismes de non-disjonction méiotique [2]. Au cours des 40 dernières années, diverses approches ont été utilisées pour l’analyse directe des ovocytes humains, en étroite conjonction avec le développement des techniques dans les domaines de l’Assistance médicale à la procréation (AMP) et de la génétique de la Reproduction. Chacune de ces approches a contribué à accroître notre connaissance du processus méiotique dans le sexe féminin, tout en soulignant les difficultés de l’examen cytogénétique des ovocytes humains. L’analyse chromosomique des ovocytes matures (ovocyte II) représente aussi une source d’informations essentielles pour l’étude de l’étiologie des anomalies chromosomiques dans l’espèce humaine. L’âge maternel est le seul facteur étiologique dont l’implication dans la survenue des aneuploïdies est connue avec certitude. Les études épidémiologiques et moléculaires réalisées pour différentes trisomies ont clairement démontré l’origine maternelle de la plupart des non-disjonctions, et l’implication des défauts ou de l’absence de recombinaisons méiotiques au cours de la première division méiotique comme facteurs de prédisposition à la non-disjonction méiotique [3]. Ainsi, l’examen chromosomique des ovocytes II humains constitue l’approche la plus directe pour une étude des anomalies chromosomiques méiotiques en relation avec l’âge maternel. Ce type d’analyse n’est pas influencé par les paramètres de viabilité ou de perte embryonnaire précoce, associés à l’examen des produits d’avortement et des nouveau-nés.

La cytogénétique ovocytaire : de l’observation des métaphases au caryotype

Durant les 25 dernières années, ce domaine d’investigation n’a pas cessé de progresser au gré des innovations technologiques en cytogénétique et en biologie de la reproduction. C’est la pratique des techniques de fécondation in vitro (FIV) humaine qui a relancé l’engouement pour l’analyse cytogénétique des gamètes femelles, en rendant disponibles les ovocytes non fécondés à l’issue des protocoles de FIV. Conformément au déroulement de la méiose, ces ovocytes se trouvent au stade métaphasique de la deuxième division méiotique (MII) et ils sont donc directement accessibles à un examen chromosomique après fixation sur lame [10]. Il est important de garder à l’esprit que ces ovocytes sont issus de protocoles de stimulation ovarienne et sont passés par plusieurs étapes de manipulation et de culture in vitro, pouvant constituer des sources potentielles de biais d’analyse. Bien qu’aucune étude n’ait identifié à ce jour de véritables corrélations entre les paramètres des protocoles FIV et le taux d’aneuploïdies ovocytaires, il ne faut donc jamais perdre de vue que les ovocytes analysés constituent une population particulière. Deux types d’ovocytes ont pu être analysés : les ovocytes obtenus par stimulation ovarienne et non utilisés ultérieurement en FIV (ovocytes non inséminés), et les ovocytes obtenus après échecs de FIV (ovocytes non fécondés). La grande majorité des études a porté sur les ovocytes non fécondés.

A la suite de la première étude publiée par Wramsby et al. [11], 33 études ont été réalisées, toutes basées sur la technique de fixation de Tarkowski (tableau 1). La fréquence moyenne d’anomalies chromosomiques observées dans ces études est de 35,5 %, répartis entre 26,1 % d’anomalies numériques et 6,3 % d’anomalies structurales. Aucune différence significative du taux d’anomalies n’est observée entre les ovocytes non fécondés in vitro et les ovocytes non inséminés. Cependant, il faut noter l’existence d’importantes fluctuations dans les taux d’aneuploïdies rapportés (de 2 à 59,6 %), ainsi que des conclusions contradictoires concernant l’effet de l’âge maternel sur l’incidence des anomalies chromosomiques.

Les raisons essentielles de ces divergences semblent être la petite taille des échantillons d’ovocytes humains analysés et les difficultés inhérentes à la réalisation des caryotypes d’ovocytes. Le nombre de métaphases II analysées varie de 8 à 334, mais la majorité des études sont basées sur l’analyse de moins de 100 métaphases II. Ce sont ces études qui présentent la plus forte variabilité des taux d’anomalies chromosomiques. L’examen cytogénétique des ovocytes humains est aussi rendu délicat par la morphologie très particulière des chromosomes d’ovocytes II, caractérisés par des chromatides très condensées (figure 1), et la difficulté d’obtenir un étalement satisfaisant de ces chromosomes. Ainsi, dans la plupart de ces études, les auteurs se sont limités à une simple classification par taille des chromosomes, après coloration au Giemsa. Seules quelques études ont eu recours à une technique de marquage spécifique des chromosomes (bandes Q ou bandes R), afin d’améliorer leur identification [10, 12].

Le caractère approximatif de ces études a été confirmé par les travaux de R. Angell qui a démontré que la séparation prématurée des chromatides homologues au cours de l’anaphase I constituait un type fréquent d’erreurs de ségrégation méiotique, jusqu’ici passé inaperçu dans les ovocytes humains [13, 14]. Ainsi, le classement erroné de chromatides libres en tant que petits chromosomes additionnels a vraisemblablement contribué à fausser les résultats rapportés dans la plupart des études publiées. Désormais, parallèlement aux non-disjonctions chromosomiques conventionnelles, 2 nouveaux types d’anomalies chromosomiques devraient être pris en compte : la présence d’une ou de plusieurs chromatides libres surnuméraires, et la séparation équilibrée des 2 chromatides constitutives d’un même chromosome (figure 2).

Le développement de nouvelles techniques de fixation des ovocytes humains a permis une amélioration significative de l’examen chromosomique de ces cellules. C’est en 1983 que Mikamo et Kamiguchi [15] présentèrent une méthode de fixation graduelle des ovocytes sur lames, permettant d’éviter la perte artefactuelle de chromosomes. Dès 1991, cette technique fut adaptée aux ovocytes humains, et à ce jour 14 études basées sur cette méthode ont été publiées (tableau 1), généralement sur des échantillons d’ovocytes humains plus importants que précédemment (de 44 à 1397), et en tenant compte des mécanismes de séparation des chromatides dans le décompte des anomalies. Ces études ont ainsi fourni des données cytogénétiques beaucoup plus précises et détaillées. A l’exception des données de Angell [14], essentiellement focalisées sur l’identification des séparations de chromatides-sœurs, toutes ces études font état d’aneuploïdies dues à des non-disjonctions chromosomiques ou à des séparations de chromatides. D’une manière générale, les taux d’aneuploïdies rapportés sont nettement inférieurs aux taux publiés précédemment (moyenne de 17 % contre 26,4 %). Toutefois, l’essentiel des anomalies enregistrées reste des anomalies de nombre, ce qui contraste avec les données obtenues sur les gamètes mâles (en moyenne 7 % d’anomalies structurales et seulement 3 % d’anomalies numériques) [16], et souligne la difficulté de l’analyse cytogénétique des ovocytes humains.

Dans une étude portant sur 1 397 caryotypes d’ovocytes humains non fécondés in vitro, nous avons mis en évidence que les anomalies numériques liées à la séparation prématurée des chromatides-sœurs, étaient plus fréquentes que les non-disjonctions chromosomiques conventionnelles (5,9 % contre 3,5 %) [17]. Ce résultat indique clairement que les erreurs de séparation des chromatides constituent une forme prépondérante d’anomalies au cours de la méiose femelle.

Tous les groupes chromosomiques sont concernés par l’aneuploïdie. Cependant, certains groupes (groupes A et C) présentent une fréquence d’aneuploïdies inférieure aux valeurs moyennes attendues, alors que les groupes E (chromosomes 16, 17, 18) et G (chromosomes 21 et 22) se caractérisent par des fréquences de non-disjonctions ovocytaires nettement supérieures. Ces observations rapportées dans plusieurs études [13, 18, 19] sont en accord avec les données épidémiologiques obtenues à terme ou sur les produits d’avortements spontanés [1, 2]. Cette variabilité interchromosomique observée dans la survenue des aneuploïdies ovocytaires suggère fortement que le processus de non-disjonction méiotique n’est pas un phénomène aléatoire dans le sexe féminin.

Tableau 1 Résumé des études de cytogénétique conventionnelle et de cytogénétique moléculaire réalisées sur les ovocytes humains

La cytogénétique ovocytaire : du caryotype à l’analyse moléculaire in situ

Les techniques d’hybridation in situ fluorescente (FISH)

Les protocoles FISH utilisés ont porté sur le marquage de 2 à 9 chromosomes. Ils se composent généralement d’une série de 2 ou 3 réactions de marquage simultané de plusieurs chromosomes, réalisées sur une même préparation chromosomique. Les sondes utilisées sont essentiellement les sondes centromériques ou locus-spécifiques du commerce (tableau 1). De 1996 à 2003, 12 études ont ainsi été publiées sur un total de 1 467 métaphases II et 727 globules polaires. Toutes ces études confirment la coexistence des mécanismes de non-disjonction chromosomique et de séparation des chromatides dans les ovocytes humains. La prévalence des anomalies dans les chromosomes de petites tailles est aussi rapportée par plusieurs équipes, confirmant ainsi l’hypothèse de non-disjonction non aléatoire. Dans plusieurs études, l’analyse du premier globule polaire a fourni un contrôle interne pour l’identification des aneuploïdies, et a permis de mieux comprendre l’origine de certaines anomalies liées à un mosaïcisme gonadique [20, 21].

Il faut cependant noter que les fréquences d’aneuploïdies rapportées dans ces études FISH présentent aussi d’importantes fluctuations avec des taux variant de 3 à 47,5 % (tableau 1). En conséquence, il convient de rester prudent sur la fiabilité des résultats rapportés. Indépendamment du nombre limité de chromosomes analysés dans ces études et de la taille relativement modeste des échantillons de métaphases II analysées (de 8 à 275), plusieurs facteurs peuvent affecter les résultats d’une analyse FISH sur ovocytes. Étant donné que la technique FISH permet d’obtenir un marquage in situ sur des préparations chromosomiques de qualité médiocre, la prise en compte des résultats ainsi obtenus a introduit un biais dans l’estimation du taux d’anomalies, puisque de tels lots chromosomiques sont généralement issus d’ovocytes atrétiques ou dégénératifs, qui sont systématiquement écartés dans les études cytogénétiques conventionnelles. Un deuxième facteur pouvant influencer les résultats est l’efficacité des sondes utilisées sur les ovocytes humains [22]. Les erreurs de marquage in situ sur les ovocytes humains ont été initialement estimées à 10 % [23], mais des études récentes rapportent que 26 % des marquages FISH réalisés sur ovocytes peuvent être artefactuels [22, 24]. L’emploi d’un seul type de sondes par chromosome (sondes répétées centromériques ou des sondes locus-spécifiques) est aussi une source d’erreurs d’interprétation, puisque l’analyse chromosomique est alors limitée à la seule détection in situ de simples spots colorés, sans reconnaissance précise des chromosomes cibles. Cette approche utilisée de manière séquentielle sur une même préparation chromosomique, s’accompagne irrémédiablement d’une altération de la préparation chromosomique [25]. Pour remédier à cette perte de qualité et limiter les erreurs d’interprétation, 2 équipes ont élaboré des protocoles permettant une identification précise des chromosomes et des chromatides in situ. Eckel et al. [26] ont combiné le marquage par sondes locus-spécifiques commerciales avec un deuxième marquage des métaphases présentant des anomalies par des sondes complémentaires, issues de banques de YAC (Yeast artificial chromosomes) ou de BAC (Bacterial artificial chromosomes). Sur un total de 17 métaphases jugées anormales puis réanalysées, ils ont trouvé 7 métaphases normales et 3 métaphases présentant des anomalies chromosomiques différentes d’un marquage à l’autre. Dans la même optique, nous avons développé un protocole de double marquage combinant l’utilisation de sondes centromériques (ou locus-spécifiques) avec des peintures chromosomiques [27]. Cette méthode permet sur chaque chromosome-cible la visualisation simultanée de domaines spécifiques et des bras chromosomiques (figure 3). Cette technique a été testée sur 104 ovocytes et 56 globules polaires pour la détection des chromosomes 9, 13, 16, 18, 21 et X. Elle nous a permis de détecter avec précision les aneuploïdies dans cet échantillon, mais surtout d’éviter 18 % d’erreurs dues à des marquages centromériques ou locus-spécifiques ambigus.

Bien que ces 2 procédures soient plus longues que les protocoles FISH usuels, le bénéfice en termes de fiabilité des résultats est indéniable, et les valeurs rapportées dans ces 2 études indiquent que le taux d’aneuploïdies ovocytaires n’est sans doute pas aussi élevé que le suggéraient les études FISH antérieures.

L’analyse des globules polaires par FISH

Les études rapportées par Verlinski et al. [28] et Kuliev et al. [31] sur plusieurs milliers de globules polaires analysés pour les chromosomes 13, 16, 18, 21 et 22, font état de taux d’aneuploïdies extrêmement élevés, de l’ordre de 32 à 52 %. Ces valeurs élevées peuvent être attribuées à l’effet de l’âge des patientes. Cependant, comme le soulignent Verlinsky et al. [28], une surestimation du taux d’aneuploïdies n’est pas à exclure, compte tenu des difficultés de l’analyse FISH multicouleur sur les globules polaires. Ces auteurs estiment que les taux d’aneuploïdies obtenus par cette approche peuvent être réajustés autour de 28 %.

Par ailleurs, ces études ont démontré qu’une proportion significative de cellules (27 %) présentait des anomalies chromosomiques issues des 2 divisions méiotiques. Les anomalies observées dans les globules polaires sont en majorité des anomalies de séparation des chromatides (63,5 % contre 6,4 % de non-disjonctions chromosomiques) ce qui contraste fortement avec les données issues des caryotypes ovocytaires et des études FISH (tableau 1). Aussi, ces résultats doivent être considérés avec prudence.

Les techniques de PRINS (PRimed IN Situ labelling) et de PNA (Peptide Nucleic Acids)

La technique PRINS est basée sur le principe de la PCR. Elle permet l’identification in situ des chromosomes humains grâce à l’utilisation d’amorces oligonucléotidiques spécifiques des domaines centromériques d’ADN répétitif de chaque chromosome. Diverses amorces spécifiques sont disponibles pour 21 des 24 chromosomes humains [32]. Cette technique a été utilisée pour l’estimation de l’aneuploïdie dans différents types cellulaires, dont les spermatozoïdes [33] et les ovocytes humains [34]. En 1988, Findlay et al. [35] ont comparé la fiabilité des techniques PRINS et FISH pour l’identification in situ des chromosomes d’ovocytes humains sur 118 métaphases II. Bien que la technique PRINS présente des avantages en termes de rapidité, de spécificité et de coût, son utilisation courante est toujours limitée à la détection in situ des séquences répétées.

Les PNA sont des sondes synthétiques, analogues des acides nucléiques, dans lesquelles le squelette phosphatidique a été remplacé par une ossature polyamidique non chargée. Ceci confère aux PNA une très forte affinité pour l’ADN, une grande stabilité in vitro et in vivo et une résistance quasi absolue aux dégradations enzymatiques. Récemment, ces nouvelles molécules ont fait leur apparition dans le domaine de la cytogénétique. Des protocoles de détection chromosomique simples et rapides ont été élaborés et testés avec succès sur différents types cellulaires [36]. En 2004, Paulasova et al. [37] ont testé l’usage des sondes PNA sur les ovocytes, les globules polaires et les embryons humains. La cinétique de réaction des PNAs est très proche de celle obtenue avec les protocoles PRINS, puisque les temps d’incubation des sondes PNA n’excèdent pas 30 à 40 minutes. Les résultats obtenus laissent à penser que cette nouvelle famille de sondes pourrait fournir des outils particulièrement efficaces pour la détection chromosomique in situ, si toutefois le coût de la synthèse des PNA venait à diminuer.

L’hybridation génomique comparative (CGH)

Malgré son efficacité, la technique CGH présente aussi des inconvénients. Ce sont essentiellement la durée du protocole d’hybridation (de 2 à 3 jours) et l’impossibilité de détecter par CGH des polyploïdies ou des réarrangements chromosomiques équilibrés tels que les translocations. Toutefois, l’association de la méthode CGH avec la technique des puces à ADN, en améliorant les performances de la technique, constitue une innovation très prometteuse pour l’analyse chromosomique, y compris sur cellules uniques [41].

Le caryotype spectral

Les taux d’anomalies rapportés varient de 20 à 39 % et les anomalies observées comprennent aussi bien des non-disjonctions chromosomiques que des anomalies de séparation des chromatides. L’observation par Sandalinas et al. [44] de séparations équilibrées de chromatides-sœurs sur des ovocytes immédiatement après leurs recueils, est une donnée très intéressante qui indique que ces séparations de chromatides ne sont pas des artefacts de culture, mais qu’elles contribuent pleinement à la formation d’aneuploïdies ovocytaires. D’autre part, dans toutes ces études, les séparations de chromatides ont lieu préférentiellement dans les petits chromosomes. Ceci confirme les données antérieures sur la prévalence des anomalies numériques dans les chromosomes de petites tailles.

Ces résultats préliminaires ont souligné le potentiel de cette technique pour l’analyse chromosomique des ovocytes humains. Cependant, tous les auteurs s’accordent à dire que la technique présente encore des points faibles qui sont la nécessité absolue de réaliser un étalement chromosomique parfait sans chevauchement, le temps d’hybridation de 2 à 3 jours, et le manque de résolution des peintures chromosomiques ne permettant pas la détection des petits réarrangements intra- ou interchromosomiques. Le développement de nouvelles sondes de peinture plus performantes devrait permettre de surmonter la plupart de ces difficultés.

Anomalies chromosomiques ovocytaires et effet de l’âge maternel

La confirmation de ces données a été fournie par plusieurs études FISH et CGH réalisées sur les ovocytes et globules polaires humains [23, 44]. Il faut cependant noter que quelques études FISH n’ont pas relevé de corrélations entre l’aneuploïdie et l’âge maternel [21, 24]. Cette disparité dans les résultats pourrait être liée au nombre restreint d’ovocytes humains analysés par FISH, en particulier dans les groupes d’âges supérieurs à 35 ans. En général, la moyenne d’âge des patientes dont les ovocytes ont été analysés par FISH, est inférieure à l’âge ou la corrélation entre anomalie et âge devient significative. A l’inverse, les études FISH réalisées sur les globules polaires de patientes âgées (moyenne de 38,5 ans) ont clairement mis en évidence une corrélation entre le taux d’aneuploïdies et l’âge maternel [28]. Ces études ont aussi indiqué une nette différence de production des anomalies entre les 2 divisions méiotiques, puisque les chromatides libres sont nettement prépondérantes dans les erreurs de première division méiotique alors que des taux similaires de chromatides séparés et de non-disjonctions chromosomiques classiques sont observés pour la deuxième division méiotique.

Tableau 2 Détails de l’analyse chromosomique réalisée sur 1397 caryotypes ovocytaires

^bLes aneuploïdies extrêmes présentent un nombre de chromosomes situé entre 13 et 18.

Rôle de la cohésion chromatidienne

Conclusion

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