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Measuring resistant forms of two pathogenic protozoa (Giardia spp and Cryptosporidium spp) in two aquatic biotopes in Yaoundé (Cameroon)

Cahiers d'études et de recherches francophones / Santé . Volume 17, Number 3, 167-72, juillet-août-septembre 2007, Étude originale

DOI : 10.1684/san.2007.0077

Résumé

Summary

Author(s) : Aghaindum Ajeagah Gideon, Thomas Njiné, Moïse Nola, Samuel Foto Menbohan, Marguerite Wouafo Ndayo , Laboratoire de biologie générale, Faculté des sciences, Université de Yaoundé-I, BP 812, Yaoundé, Cameroun, Centre Pasteur du Cameroun, BP 1274, Yaoundé, Cameroun.

Summary : Organisms of the genera Cryptosporidium and Giardia are enteric parasites that are responsible for cryptosporidiosis and giardiasis respectively. They are characterised by profuse diarrhoea, abdominal pain and cramping. The symptoms can be fatal for immunodepressed subjects and children because these are opportunistic pathogens. These pathogenic infections are rampant in developing countries due to the unhygienic and improper disposal of wastewater and the use of surface water as the major sources of potable water. Little information is available about the resistant forms of these microorganisms in the hydrosystems of Cameroon in particular and other sub-Saharan ecosystems in general. The aim of this research was to isolate, identify, and measure these forms of these emerging protozoa in the waste and surface waters of Yaoundé, Cameroon. Giardia spp cysts were identified by Lugol iodine staining, and the Cryptosporidium spp oocysts by the Ziehl-Neelsen technique. The cysts were oval in structure and varied in length from 7 um to 12.0 um. Axostyles were visible along the median line and nuclei were present. The oocysts were round in structure and varied in diameter from 4 um to 6 um. A double cell wall was seen in the apicomplexa. The highest concentrations of Giardia spp cysts were 560 cysts/L in the surface water and 650 cysts/L in the residual effluent, while the corresponding figures for Cryptosporidium spp were 1,110 oocysts/L in the stream and 1,500 oocysts/L in the effluent. The cyst and oocyst counts were higher in the direct effluent because they are released directly into the wastewater by feces, while they are diluted in the surface water, reducing their abundance. Turbidity has a significant effect (p<\;0.05) on the population dynamics of these microorganisms, thereby indicating the importance of suspended or colloidal particles in the dissemination of these pathogens in aquatic media. The suspended particles in the wastewater adsorb the oocysts and cysts, probably because of the interactions between the electric charges carried by suspended particles and those present at the surface of the parasites. The positive correlation observed between these parasites and ammonia may account for some of the die-off of these resistant forms, because ammonium ions in water are known to inactivate trophozoites and sporozoites present in cysts and oocysts. This may be due to the permeability of the protozoan membrane to the ammonium ion and other alkaline earth metals present in aqueous form in the biotope. These parasite forms in these media represent a considerable health risk to the inhabitants of the study zone who depend on this surface water for drinking. The small size of these parasitic forms, the nonfunctional water purification stations and ineffective water treatment systems expose the community to outbreaks of giardiasis and cryptosporidiosis.

Keywords : aquatic medium, biological analysis, Cameroon, parasitosis, wastewater

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ARTICLE

Auteur(s) : Aghaindum Ajeagah Gideon¹, Thomas Njiné¹, Moïse Nola¹, Samuel Foto Menbohan¹, Marguerite Wouafo Ndayo²

¹Laboratoire de biologie générale, Faculté des sciences, Université de Yaoundé-I, BP 812, Yaoundé, Cameroun
²Centre Pasteur du Cameroun, BP 1274, Yaoundé, Cameroun

Les organismes du genre Cryptosporidium et Giardia sont des protozoaires entéroparasites, responsables de la cryptosporidiose et de la giardiase. Les espèces les plus connues sont Cryptosporidium parvum, C. hominis, C. baileyi, C. canis, C. felis, C. meleagridis, et C. muris [1]. Les espèces de Giardia couramment rencontrées sont Giardia lamblia, G. muris et G. agilis [2]. Ces protozoaires sont, selon les espèces, parasites de reptiles, d’amphibiens, de mammifères, des oiseaux ou de l’homme [3]. Ces parasites sont responsables chez l’homme de diarrhées aiguës, de douleurs abdominales, de nausées et de pertes de poids [4]. Dans les pays en développement, Cryptosporidium sp et Giardia sp sont à l’origine de 30 à 50 % des infections opportunistes chez les personnes atteintes par le virus du syndrome de l’immunodéficience humaine (VIH) [5]. La giardiase et la cryptosporidiose sont remarquables pour leur transmission zoonotique à la suite d’une élimination des kystes et des oocystes à travers les fèces [6]. Les taux d’infection de Cryptosporidium sp et Giardia sp sont très élevés dans les pays en développement [7]. Leur transmission se fait par voie orale et bon nombre d’épidémies ont été associées à leur présence dans les milieux aquatiques [8].

Les kystes de Giardia et les oocystes de Cryptosporidium sont résistants à la désinfection par le chlore [9]. Les oocystes conservent leur pouvoir infectant pendant de longues périodes dans l’eau [10]. Giardia sp est un protozoaire flagellé avec quatre paires de flagelles (une paire antérieure, deux paires postérieures et une paire caudale) chez les trophozoïtes, donnant une haute mobilité dans l’intestin grêle, tandis que le complexe mécano-chimique du Cryptosporidium facilite sa pénétration dans les cellules hôtes, causant ainsi des troubles intestinaux [11].

La contamination par Cryptosporidium sp et Giardia sp de l’eau de surface exploitée pour l’alimentation, constitue un problème de santé publique et doit faire l’objet d’une attention particulière. Aucune étude dans ce domaine n’a encore été menée sur les eaux tant résiduaires que superficielles ou souterraines au Cameroun. Les seules informations disponibles sur les milieux aquatiques camerounais sont relatives à l’abondance et à la diversité de la microflore ; elles montrent la présence de coliformes et streptocoques fécaux dans les eaux de surface et dans les eaux souterraines des échantillons provenant des régions équatoriales [12]. Cela témoigne de l’intensification de la pollution des cours d’eau urbaine de l’amont vers l’aval [13]. Les données disponibles sur la distribution des pathogènes flagellés ou des apicomplexa d’origines aquatiques et parasites du tube digestif de l’homme, au Cameroun en général et à Yaoundé en particulier, sont encore au stade élémentaire. Peu d’informations sont également accessibles sur les risques sanitaires liés à Giardia et à Cryptosporidium dans les villes du Cameroun. La présente étude a pour but de rechercher, d’isoler et d’identifier les oocystes de Cryptosporidium sp et les kystes de Giardia sp dans les eaux usées domestiques et dans les eaux superficielles à Yaoundé.

Matériel et méthode

Description des sites d’étude et prélèvement des échantillons d’eau

La ville de Yaoundé est située sur la bordure ouest du plateau sud-camerounais, à 3° 52’ de latitude Nord et 11° 32’ de longitude Est. Ce plateau a une altitude moyenne de 750 m. Plusieurs cours d’eau de la ville de Yaoundé appartiennent au bassin du Mfoundi, bassin constitué de nombreux ruisseaux qui sont pour la plupart permanents. Ces affluents se jettent dans la rivière Mfoundi qui porte le nom de ce bassin.

Deux sites d’étude ont été choisis dans cette ville, sur la base de l’ampleur des difficultés d’accès à l’eau potable dans les localités concernées, et de l’état avancé de l’insalubrité de l’environnement. Ces deux sites sont le quartier Cité Verte, et le Cours d’eau Abiergue-Est. Le quartier Cité Verte est situé dans l’arrondissement de Yaoundé II et est caractérisé par une densité de population supérieure à 1 000 habitants au km², et par les eaux usées domestiques qui circulent dans les rigoles et sur la chaussée, suite au dysfonctionnement des stations dépuration existantes.

Le cours d’eau Abiergué-Est prend sa source dans le quartier Mokolo, dans l’arrondissement de Yaoundé II. Ce cours d’eau se jette dans le Mfoundi après avoir arrosé le quartier Nkolbisson.

Plusieurs campagnes d’échantillonnage ont été effectuées sur les eaux usées domestiques au quartier Cité Verte, et sur les eaux de l’Abiergué-Est. Cette étude s’est déroulée d’octobre 2002 à janvier 2003 avec un pas d’échantillonnage bimensuel. Au total, huit échantillons ont été analysés à chaque point de prélèvement. Les spécimens ont été prélevés dans une bonbonne stérile en polyéthylène de 10 litres et les échantillons ont ensuite été transportés à température ambiante au Laboratoire de biologie générale de l’université de Yaoundé 1, dans les 45 minutes qui suivent leurs prélèvements pour analyse.

Analyses physico-chimiques

Les paramètres physico-chimiques examinés ont été la turbidité, les matières en suspension (MES), l’azote ammoniacal (NH₄⁺), et la demande biochimique en oxygène (DBO₅). Les échantillons destinés à l’analyse physico-chimique ont été prélevés dans des flacons de 250 mL. Les valeurs de la DBO₅ sont exprimées en milligrammes d’oxygène par litre d’eau tandis que celles de la MES et de NH₄⁺ sont exprimées en mg/L. Les valeurs de la turbidité sont exprimées en unité turbidité formazine (formazine turbidity unity, FTU). Excepté la DBO₅ qui a été analysée par respirométrie, les autres paramètres ont été analysés par spectrophotométrie suivant les techniques préconisées par l’American Public Health Association (APHA) [14].

Recherche, isolement et identification des kystes et oocystes des parasites

Pour les oocystes de Cryptosporidium sp, les échantillons sont prélevés dans des bidons stériles de 10 litres. Ils sont ensuite laissés pour sédimentation dans les récipients pendant 24 heures à température ambiante. Les dépôts obtenus sont ensuite homogénéisés et un sous-spécimen est prélevé et distribué dans les tubes à essais. Les contenus des tubes à essais sont centrifugés à 1 000 grammes pendant 10 minutes pour favoriser la sédimentation. Une solution de sulfate de zinc (10 %) est ajoutée au culot qui est ensuite centrifugé à 2 500 grammes pendant 2 minutes pour faire flotter les oocystes. Les oocytes sont pipetés, introduits dans une solution d’eau distillée et centrifugés à 1 500 grammes pendant 10 minutes. Le culot est prélevé à l’aide d’une micropipette et posée sur des lames porte-objet. Après fixation au méthanol et coloration à la fuchsine phénique, on rince à l’eau et à l’acide sulfurique (2 %). On réalise ensuite une contre-coloration au vert de malachite (5 %) puis, après rinçage à l’eau et séchage à l’air, l’examen et le dénombrement des oocystes sont réalisés au microscope Olympus aux grandissements 40X et 100X. Les mensurations sont faites sur 100 oocystes par échantillon. L’isolement et l’identification de ces oocystes de Cryptosporidium ont été réalisés suivant les techniques proposées par Rigo et Franco [15] et Quintero-Betancourt et al. [16].

Pour l’isolement des kystes de Giardia sp, on laisse sédimenter 10 litres d’échantillon pendant 3 heures. Une fois le culot réparti dans différents tubes à essais, on fixe à l’aide du formaldéhyde (2 %), puis on colore au Lugol simple (5 %) et on ajoute du sulfate de zinc pour favoriser la flottaison des kystes. L’ensemble est porté dans une centrifugeuse à 650 grammes pendant 3 minutes. Une fois prélevés et posés sur une lame, les kystes sont portés au microscope Olympus et analysés comme indiqué ci-dessus.

Analyse des données

Le volume intégral (Vx) du culot est enregistré ; après homogénéisation du culot, un volume précis (Vy) est prélevé et réparti dans différents tubes à essais. Le culot final de chaque tube à essais est réparti sur des lames, puis le nombre d’oocystes est compté. Le nombre total d’oocystes dans l’échantillon est calculé en multipliant la valeur obtenue pour toutes les lames par la fraction Vx/Vy et le résultat est enfin ramené au litre. Les relations entre la distribution des kystes et des oocystes des parasites et les variables physico-chimiques des eaux ont été évaluées par le test de corrélation de Spearman.

Résultats et discussion

Dans les eaux de la Cité Verte, l’abondance de Cryptosporidium sp varie de 600 à 1 500 oocystes/L et celle de Giardia sp de 180 à 650 kystes/L (figure 1). Les abondances de Cryptosporidium sp et de Giardia sp dans les eaux de l’Abiergue-Est varient de 500 à 1 110 oocystes/L et de 150 à 560 kystes/L respectivement (figure 1). La densité des oocystes de Cryptosporidium sp la plus élevée a été notée au cours du mois de décembre dans les eaux de la Cité Verte et au cours du mois de janvier dans le cours d’eau Abiergué-Est. Pour les deux sites d’étude, les concentrations les plus élevées en kystes de Giardia sp ont été enregistrées au cours du mois de janvier, qui constitue la période sèche (figure 1). Pour les deux parasites isolés, les densités les plus faibles ont été enregistrées au cours du mois d’octobre, qui constitue la période humide due à l’effet de dilution de l’écosystème (figure 1).

La caractérisation morphologique des deux parasites au microscope montre que les oocystes sont arrondis, alors que les kystes sont ovalaires. Les mesures des deux formes de résistance ont été faites sur 100 parasites de chaque espèce. Il en ressort que les oocystes de Cryptosporidium sp mesurent de 4 à 6 µm de diamètre et les kystes de Giardia sp mesurent de 7 à 12 µm de diamètre. L’oocyste de Cryptosporidium sp est constitué de deux couches séparées par un espace clair. Le kyste de Giardia sp, quant à lui, est constitué d’un axostyle médian et d’un noyau visible. Les eaux usées analysées contiennent de la matière organique biodégradable, de l’azote ammoniacal et des MES (tableau 1).

Les valeurs de la turbidité varient de 500 à 3 100 FTU dans les eaux de la Cité Verte et de 430 à 3 300 FTU dans celles de l’Abiergué-Est. Les teneurs des matières en suspension varient de 110 à 490 mg/L dans les eaux de l’Abiergué-Est et de 380 à 600 mg/L dans celles de la Cité Verte. La concentration la plus élevée de ces matières en suspension dans les eaux usées de la Cité Verte a été enregistrée au cours du mois d’octobre, alors qu’elle n’a été observée qu’au mois de décembre dans le cours d’eau Abiergué-Est (tableau 1). Les valeurs de la DBO₅, traduisant la richesse en matières organiques biodégradables, varient de 210 à 650 mg d’oxygène/L dans les deux sites d’étude. Elles sont cependant relativement élevées dans les eaux usées de la Cité Verte par rapport au cours d’eau (tableau 1). La plus faible valeur de la DBO₅ a été enregistrée au cours du mois de janvier dans le cours d’eau Abiergué-Est (tableau 1). Les concentrations de NH₄⁺ qui traduisent la matière organique azotée en décomposition varient pour l’ensemble des deux sites d’étude de 0,5 à 4,1 mg/L d’eau. Ces teneurs sont relativement faibles pour les eaux de l’Abiergué-Est par rapport aux eaux usées de la Cité Verte (tableau 1).

Une forte densité d’oocystes de Cryptosporidium sp et de kystes de Giardia sp a été isolée et identifiée dans les deux sites de prélèvement. Ces formes de résistance sont en nombre plus élevé dans l’effluent de la Cité Verte. Dans les eaux analysées, les fluctuations de la plupart des variables physico-chimiques sont dépendantes de celles des abondances des parasites isolés. Un rapport régulièrement positif est obtenu entre la turbidité, la matière en suspension, la DBO₅ et la biodynamique des parasites alors qu’une corrélation négative est calculée pour les teneurs en ammoniaque et la distribution des oocystes dans les écosystèmes aquatiques étudiés (tableau 2). La turbidité est en effet significativement liée (p < 0,05) à la dynamique d’abondance des kystes de Giardia sp dans le cours d’eau Abiergué-Est. La réduction de la turbidité d’une eau est très souvent reliée à une diminution de la quantité en cryptosporidies et en Giardia [17]. Les particules de matières dans l’eau jouent ainsi un rôle important dans le transport de ces parasites [18]. Selon Medema et al. [19], les oocystes et kystes des parasites sont généralement liés aux matières organiques en suspension dans l’eau. Cette adsorption influence la vitesse de sédimentation de ces parasites en milieu aquatique, bien que la durée de la sédimentation n’ait pas d’influence significative sur leur détection [20]. L’adsorption de ces parasites aux particules a aussi été indiquée dans les eaux de distribution mal traitées [21]. L’adsorption de ces formes de résistance aux particules occasionne de grandes difficultés dans la chaîne de traitement des eaux de distribution [22]. Les kystes de Giardia et les oocystes de Cryptosporidium ont néanmoins été parfois indiqués comme négativement liés à la demande chimique en oxygène (DCO) du milieu aquatique et restent infectieux dans l’eau pendant de longues périodes à basse température, pH neutre et faibles rayons ultraviolets [23].

Les fortes concentrations de NH₄⁺ du milieu peuvent augmenter l’inactivation des oocystes par leur grande capacité de pénétration dans la paroi des oocystes et dans les membranes de sporozoïtes. Cette pénétration est facilitée par les valeurs de pH non adaptées au parasite [24]. La présence de certains éléments chimiques tels que les ions Na⁺, Cl^- et K⁺ réduit la viabilité des oocystes de Cryptosporidium [25].

La destruction des kystes de Giardia sp et des oocystes de Cryptosporidium sp dans les eaux brutes par les méthodes habituelles de traitement des eaux telles que la chloration et l’ozonation est rendue difficile à cause de leur petite taille et de leur forte résistance. Une étape complémentaire de filtration et de désinfection pourrait réduire le taux de ces oocystes et kystes dans le milieu aquatique et par conséquent diminuer le taux de contamination de la population par ces deux entero-proto pathogènes opportunistes émergents [26, 27].

Tableau 1 Valeurs des paramètres physicochimiques en fonction des périodes d’échantillonnage dans les eaux usées de la Cité Verte et dans les eaux du cours d’eau d’Abiergué-Est.Table 1. Values of physicochemical variables according to sampling periods in the waste water of Cité Verte and the East Abiergue stream.

Paramètres chimiques	Origine des eaux analysées et périodes d’échantillonnage
Cité Verte				Abiergué-Est
Oct-02	Nov-02	Dec-02	Jan-03	Oct-02	Nov-02	Dec-02	Jan-03
DBO₅ (mg/L)	650	500	430	510	260	250	265	210
NH₄+ (mg/L)	2,75	4,1	2,3	3,4	2,0	0,6	1,0	0,5
MES (mg/L)	600	390	410	380	400	110	490	220
Turbidité (FTU)	500	1 000	3 100	1 900	430	505	3 300	1 700

Tableau 2 Coefficient de corrélation de Spearman entre les kystes de Giardia, les oocystes de Cryptosporidium et les facteurs environnementaux pour les eaux de la Cité Verte et le cours d’eau Abiergue-Est.Table 2. Spearman correlation coefficient between Giardia spp cysts, Cryptosporidium oocysts, and environmental factors for the waste water of Cite Verte and the East Abiergue stream.

	DBO₅	DBO₅	NH₄+	NH₄+	MES	MES	Turbidité	Turbidité
Abiergue	Cité Verte	Abiergue	Cité Verte	Abiergue	Cité Verte	Abiergue	Cité verte
(Kyste)	0,25	0,66	– 0,31	0,80	0,51	0,16	0,96	0,74
(Oocyste)	0,78	– 0,41	– 0,51	– 0,74	0,25	0,60	0,20	0,37

Conclusion

Cette étude a permis l’isolement et la mise en évidence des oocystes de Cryptosporidium sp et des kystes de Giardia sp dans les eaux de surface de certains milieux aquatiques de la ville de Yaoundé. Le réseau hydrographique du Mfoundi qui est la source principale d’exploitation de l’eau potable consommée à Yaoundé et ses environs est contaminé par ces deux entéro proto-pathogènes. Des mesures environnementales appropriées ainsi que les procédés adéquats de traitement s’imposent pour éviter une transmission prépondérante de cryptosporidiose et de giardiase dans la région.

Remerciements

Ce travail a été réalisé avec l’appui financier de Aire Développement.

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