Mechanism inderlying resistance to antiviral therapy in chronic hepatitis B

ARTICLE

Auteur(s) : Julie Lucifora¹, Fabien Zoulim^1,2

¹Inserm, U871, 151 Cours Albert Thomas, 69003 Lyon, France ; Université Lyon 1, 69008 Lyon, IFR62 Lyon Est, Faculté de Médecine Laennec, 69008 Lyon
²Hospices Civils de Lyon, Hôpital Hôtel-dieu, 69002 Lyon

Cycle de réplication du VHB et cibles antivirales

Après la perte de l’enveloppe virale, la nucléocapside migre ensuite vers le noyau de la cellule hôte où le génome viral pénètre grâce à l’interaction de la capside avec les pores nucléaires [8]. Une fois dans le noyau, l’ADN viral relâché circulaire (ADN-RC) partiellement double brin subit une étape de réparation pour devenir un ADN circulaire clos superenroulé appelé ADNccc [9]. Pour ce faire, il y a clivage de la polymérase virale attaché de façon covalente au brin négatif d’une part et de la séquence oligoribonucléique attachée au brin positif d’autre part, puis complémentation du brin positif et ligation des extrémités des brins pour former une molécule circulaire qui va se superenrouler. Contrairement à l’ADN des rétrovirus, l’intégration de l’ADNccc du VHB dans le génome de la cellule n’est pas nécessaire pour la suite de son cycle de réplication. Bien qu’il y ait probablement intervention d’enzyme(s) cellulaire(s), aucune donnée n’a permis d’identifier les acteurs et les événements précis impliqués dans le processus de formation de l’ADNccc. Or ceci est actuellement un enjeu majeur dans la lutte contre le VHB puisque cet ADNccc peut persister dans le noyau de la cellule infectée en raison de sa longue demi-vie et permettre une réactivation de la réplication virale chez les patients ayant arrêté leur traitement suite à une baisse de la charge virale [4].

L’ADNccc nouvellement formé sert ensuite de matrice pour la transcription de l’ARN prégénomique (ARNpg) et des ARNm viraux. Ceci se fait grâce à une ARN polymérase cellulaire. Les transcrits viraux sont exportés vers le cytoplasme où ils sont traduits en protéines virales. Différentes approches antisens ont été et sont encore aujourd’hui évaluées pour inhiber la transcription du génome viral ou les ARN viraux eux-mêmes mais la difficulté réside dans la pénétration de molécules antisens (ARNsi ou oligonucléotides) dans les cellules infectées [10].

Suite à la synthèse de la protéine de capside dans le cytoplasme, l’ARNpg et la polymérase virale sont encapsidés. Cette étape de formation de la nucléocapside peut aussi être la cible de molécules antivirales. En effet, différents composés ont montré un effet inhibiteur sur l’encapsidation de l’ARNpg comme les dérivés phénylpropénamides [11], sur la formation de la capside comme les hétéroaryldihydropyrimidines [12] ou encore sur la stabilité de la capside comme l’IFN-α [13].

Dans la capside nouvellement formée, le brin d’ADN positif est synthétisé à partir de l’ARNpg grâce à l’activité transcriptase inverse de la polymérase virale. Ce processus débute par l’interaction de la polymérase virale avec le signal d’encapsidation de l’ARNpg qui est alors utilisé comme matrice pour l’addition des premiers nucléotides. De plus, le premier nucléotide (dGTP) va se lier de façon covalente à un résidu tyrosine conservé de la polymérase virale [14]. Au fur et à mesure de la synthèse du brin négatif, l’ARNpg est dégradé grâce à l’activité RNase H de la polymérase virale. Le brin d’ADN positif est ensuite synthétisé en utilisant le brin négatif comme matrice. Les analogues de nucléos(t)ides comme la lamivudine, l’adéfovir, l’entécavir ou encore la telbivudine qui, rappelons-le, sont actuellement approuvés pour le traitement des patients atteints d’hépatite B chronique, inhibent l’activité de la polymérase virale (figure 1). Les mécanismes de cette inhibition seront décrits ultérieurement.

La maturation de la nucléocapside s’achève par la phosphorylation des protéines de capsides. Ceci augmente l’affinité de la capside pour l’ADN-RC nouvellement formé [15]. La capside est alors assemblée avec les protéines d’enveloppes présentes dans le réticulum endoplasmique pour former des virions complets qui sont sécrétés dans la circulation. L’utilisation d’iminosucres qui interfèrent avec le repliement correct des protéines d’enveloppe est très efficace pour diminuer l’infectiosité des particules sécrétées [16]. Par ailleurs, la nucléocapside mature peut aussi être recyclée vers le noyau pour amplifier le pool d’ADNccc qui va servir de réservoir pour la réplication du VHB. Enfin, l’ADN viral peut aussi être directement intégré dans le génome par un processus de recombinaison illégitime [17]. Cet ADN viral intégré ne servira pas de matrice pour la synthèse de l’ARNpg. Par contre, la présence d’un ADN viral étranger dans le génome de la cellule hôte et la synthèse de protéines virales qui interagissent avec la machinerie cellulaire telle que la protéine X sont des facteurs qui prédisposent au développement du carcinome hépatocellulaire.

Les différents analogues de nucléos(t)ides et leur mécanisme d’action contre le VHB

Les analogues de nucléotides triphosphates agissent en tant que leurre vis-à-vis de la polymérase en entrant en compétition avec les nucléotides naturels. Ils sont incorporés par la polymérase virale dans la chaîne d’ADN naissante ce qui peut avoir trois types de conséquences sur la réplication du VHB (figure 2B). Premièrement, les analogues de purine peuvent inhiber l’initiation de la transcription inverse en remplaçant le premier dGTP qui, en temps normal, se lie de façon covalente à la polymérase virale et permet le début de la transcription inverse [19]. Deuxièmement, les analogues de nucléos(t)ide peuvent inhiber l’élongation du brin positif en étant incorporés dans la chaîne d’ADN naissante et en jouant un rôle de terminateurs de chaîne. En effet, ils sont dépourvus de groupement hydroxyle en 3’ et empêchent donc l’ajout d’un autre nucléotide. Et troisièmement, de façon similaire, ils peuvent aussi jouer un rôle de terminateur de chaîne pendant l’étape de synthèse d’ADN à partir du brin négatif et donc inhiber la synthèse du brin positif [18]. Divers facteurs entrent en jeu pour déterminer l’efficacité d’un antiviral : son entrée dans la cellule, la demi-vie de sa forme active phosphorylée, sa spécificité de fixation à la polymérase virale et le niveau de compétition avec les nucléotides naturels ou encore son index de sélectivité. L’affinité relative des analogues de nucléos(t)ide pour les polymérases virales et cellulaires est un facteur déterminant pour leur tolérance. Ils ne doivent pas, en particulier, interférer avec les polymérases cellulaires et ainsi être toxiques pour l’hépatocyte. De ce point de vue, les analogues de pyrimidine qui ont une configuration lévogyre ou encore les analogues de purine qui sont acycliques ont une bien meilleure affinité pour la polymérase virale que pour les polymérases cellulaires ce qui explique leur très faible toxicité [18].

La résistance aux antiviraux et ses conséquences au niveau clinique

La résistance aux antiviraux peut être définie à plusieurs niveaux [21]. Premièrement, la résistance génotypique est l’apparition spontanée de mutations conférant la résistance à un antiviral. Ceci peut avoir lieu avant ou pendant le traitement avec un analogue de nucléos(t)ides. Deuxièmement, la résistance phénotype est la confirmation in vitro dans des tests de culture cellulaire que la mutation détectée diminue l’efficacité de l’antiviral [22]. Troisièmement, l’échappement virologique suit la résistance génotypique et correspond à une remontée de la charge virale d’au moins un log par rapport à la valeur thérapeutique la plus basse du patient [23]. Et enfin, l’échappement clinique est défini par l’association de la remontée de la charge virale et l’augmentation des transaminases suivies par une détérioration de l’histologie hépatique [23]. Le délai entre chaque phase, qui est variable en fonction du patient et des antiviraux, peut aller de quelques semaines à quelques mois.

Le développement de résistances a été décrit pour la première fois avec la lamivudine puisque c’est le premier analogue de nucléoside à avoir été approuvé pour le traitement de l’hépatite B. Depuis des résistances à tous les analogues de nucléos(t)ides approuvés ont été décrites (figure 3) [24, 25]. Le ténofovir est la seule molécule pour laquelle aucune résistance spécifique n’a été décrite mais cette molécule a été utilisée principalement chez les patients co-infectés VIH/VHB qui reçoivent déjà un traitement par la lamivudine ou l’emtricitabine dans le cadre de leur thérapie anti-VIH [26]. Or la lamivudine ou l’emtricitabine étant aussi des anti-VHB, ces patients reçoivent en fait une bithérapie anti-HBV, ce qui retarde probablement l’apparition de résistances.

Toutes les études réalisées dans le cadre d’essais cliniques ont montré que l’apparition d’une résistance à un analogue de nucléos(t)ide a un effet délétère sur la progression de la maladie hépatique. Ceci se traduit d’un point de vue clinique par : a) une remontée de la charge virale ; b) une remontée des transaminases qui peut s’accompagner d’une insuffisance hépatocytaire [27] ; c) une reprise de l’inflammation hépatique et de la fibrose hépatique [28] ; d) une aggravation de la cirrhose chez les patients cirrhotiques [3] ; e) une augmentation du risque de réinfection du foie greffé après une transplantation [29].

Sélection des mutants résistant aux antiviraux

Les souches mutantes résistant aux antiviraux deviennent majoritaires quand le nombre d’hépatocytes infectés par la souche sauvage a été réduit de façon significative (figure 4). Il existe ainsi un temps de latence entre la sélection du mutant et la colonisation du foie par ce dernier. Il est donc possible de détecter une souche VHB résistante dans le plasma d’un patient avant qu’une modification de la charge virale ait eu lieue. Des analyses génotypiques et phénotypiques ont été mises au point pour surveiller et prévenir l’apparition de résistances. Les études génotypiques permettent de détecter les changements dans le génome du VHB et d’identifier les mutations sélectionnées lors du traitement. Pour cela, le génome du VHB est amplifié et les mutations sont détectées par séquençage direct ou par des techniques d’hybridations spécifiques [31]. En théorie, la surveillance génotypique permettrait d’obtenir des informations sur l’efficacité du traitement et, en cas d’apparition de résistances, devrait alerter le médecin sur le besoin de modifier le traitement pour éviter l’apparition des symptômes cliniques. Mais contrairement au cas du VIH, les analyses génotypiques ne sont pas utilisées en routine pour le VHB en raison de leur coût important et de la difficulté à interpréter certains profils complexes de mutations. Les analyses phénotypiques permettent de déterminer la capacité réplicative d’une souche mutante ainsi que sa sensibilité aux différents analogues de nucléos(t)ides disponibles actuellement. Ces études sont basées sur la transfection transitoire de clones du VHB qui contiennent les mutations de résistance ou la construction de lignées cellulaires qui expriment de façon stable les souches mutantes [32]. Des efforts restent à faire pour améliorer ces techniques non commerciales qui, à l’heure actuelle, sont coûteuses et laborieuses afin de les utiliser en complément des analyses génotypiques et assurer une optimisation du traitement du patient.

Les principales mutations dans la polymérase virale qui confèrent les résistances aux analogues de nucléos(t)ides sont présentés dans le tableau 1 [21]. Comme la structure de la polymérase du VHB n’est pas connue, des homologies ont été faites avec celle du VIH pour modéliser le mécanisme moléculaire de la résistance aux analogues de nucléos(t)ides [33-35]. Les mutations dans le motif YMDD du domaine catalytique C de la polymérase virale sont fréquemment associées à des résistances. Le remplacement d’une méthionine en position 204 par une valine ou une isoleucine (rtM204V) confère par exemple la résistance à la lamivudine, l’emtricitabine ou encore au telbivudine. Cette substitution est probablement critique vis-à-vis de l’action de l’analogue de nucléoside dans le site catalytique de l’enzyme. Des modélisations moléculaires suggèrent que le groupement méthyle de la valine ou de l’isoleucine crée un encombrement stérique qui empêche la lamivudine d’accéder au site catalytique [35]. Mais cette substitution empêche aussi le substrat naturel d’accéder au site catalytique de l’enzyme ce qui affecte l’activité de la polymérase virale et diminue la capacité de réplication des souches portant cette mutation. Des travaux ont décrit des mutations compensatoires situées dans le domaine B de la polymérase virale, comme rtV173L et rtL180M, qui restaurent une certaine capacité de réplication et augmentent la résistance au traitement [36]. Les mutants résistant à l’adéfovir ont une substitution rtN236T et/ou rtA181V/T situées respectivement dans les domaines D et B de la polymérase virale [37, 38]. Les modèles moléculaires tridimensionnels ont suggéré que la mutation rtN236T affecterait plutôt l’accrochage de l’analogue de nucléos(t)ides que l’activité catalytique de l’enzyme.
Tableau 1 Principales mutations situées dans la polymérase virale qui confèrent des résistances aux analogues de nucléos(t)ides.

Les résistances croisées

Le phénomène de résistance croisée a un impact clinique important ; il conditionne le choix du traitement en fonction d’une situation clinique et virologique donnée. Ainsi, un patient infecté par une souche mutante qui présente des résistances croisées verra ses options thérapeutiques diminuer puisqu’il est capital de lui administrer une nouvelle molécule qui présente un profil de résistance croisée différent. En effet, il faut absolument proscrire l’utilisation séquentielle en monothérapie (ou en addition) de molécules qui ont des profils de résistance similaires afin d’éviter le risque d’inefficacité du traitement et de sélections successives de mutations. Une mauvaise utilisation des molécules peut aboutir à la sélection de souches multirésistantes.

Des travaux ont été réalisés pour examiner la possibilité de l’émergence de souches virales ayant des mutations dans la polymérase virale qui confèrent des résistances à la lamivudine et à l’adéfovir. Un mutant contenant les mutations rtL180M+rtM204V+rtN236T a donc été construit par mutagenèse dirigée et des analyses phénotypiques ont été réalisées afin de tester sa capacité réplicative et sa sensibilité aux différents analogues de nucléos(t)ides. Les résultats montrent qu’un tel mutant est capable de se répliquer in vitro mais avec une efficacité bien plus faible que la souche sauvage ou que les souches mutantes rtL180M+rtM204V et rtN236T. Comme attendu, ce triple mutant rtL180M+rtM204V+rtN236T est résistant aux analogues de pyrimide et montre une baisse de susceptibilité à l’adéfovir. Par contre, il reste sensible au traitement au ténofovir et à l’entécavir et l’IFN-α inhibe sa réplication aussi efficacement qu’il inhibe celle de la souche sauvage. Ces résultats montrent qu’il peut y avoir une sélection de souches résistantes à la fois à la lamivudine et à l’adéfovir capables de se répliquer [39]. Ceci a été confirmé récemment chez un patient transplanté qui a échappé à une thérapie combinée lamivudine-adéfovir-immunoglobulines. En effet, les études génotypiques et phénotypiques effectuées sur ce patient ont mis en évidence la sélection d’une souche, ayant un profil de mutations complexe (rtV173L+rtL180M+rtA181V+rtN236T), qui est résistante à la lamivudine et à l’adéfovir et qui échappe à la reconnaissance par certains anticorps anti-HBs. Cette souche reste d’après les analyses in vitro sensible au ténofovir et les données cliniques concernant ce patient montrent un bon début de réponse au traitement avec le ténofovir puisqu’on observe une diminution de la charge virale de 3 log [40].

Les analyses phénotypiques ont aussi montré que les mutants résistants à la lamivudine sont moins sensibles à l’entécavir que la souche sauvage du VHB mais des mutations supplémentaires telles que rtI169T, rtM205V, rtI84G et rtS202I/G (tableau 1) sont nécessaires pour conférer une véritable résistance [41, 42]. Ces mutations ont été caractérisées dans le cas de patients recevant un traitement à l’entécavir suite à une résistance à la lamivudine. La sélection de ces virus mutants s’est donc faite en deux étapes : d’abord la sélection de virus résistants à la lamivudine avec des mutations en position 204 (mutations primaires) et ensuite, la sélection de mutations supplémentaires en position 202 par exemple (mutations secondaires) qui augmentent très fortement la résistance à l’entécavir. De plus, les essais phénotypiques ont montré que les mutations secondaires seules ne confèrent pas de résistance à l’entécavir [41].

La connaissance des différentes mutations dans la polymérase virale et de leur phénotype in vitro sera très importante d’un point de vue clinique puisqu’elle permettra au praticien d’adapter le traitement du patient en fonction du profil de mutations qu’il présente. Dans cette optique, le développement de nouvelles molécules actives sur les souches résistantes aux autres traitements est un enjeu majeur pour lutter contre le VHB. Récemment, l’efficacité d’un nouvel analogue phosphonate acyclic de pyrimidine nommé PMEO-DAPym a été évaluée in vitro. Les résultats montrent que le PMEO-DAPym possède une meilleure activité antivirale contre la réplication de la souche VHB sauvage que l’adéfovir ou le ténofovir. De plus, il inhibe la réplication de souches du VHB porteuses des mutations qui confèrent la résistance à la lamivudine (rtL180M+rtM204V) et à l’adéfovir (rtN236T) aussi bien que celle de la souche sauvage. Il inhibe aussi la réplication de souches du VHB provenant de patients chroniquement infectés ayant développé une résistance au traitement antiviral administré, et porteuses d’associations complexes de mutations qui confèrent la résistance à un ou plusieurs analogues de nucléos(t)ides utilisés actuellement en clinique. Le PMEO-DAPym est donc un candidat intéressant pour le traitement de souches multirésistantes. Son utilisation dans le développement de thérapies visant à retarder, voire à empêcher, l’apparition des résistances aux antiviraux pourrait être envisagée après confirmation des résultats obtenus dans des modèles expérimentaux animaux [43]. Ceci souligne l’intérêt de poursuivre des recherches pour la découverte de nouveaux inhibiteurs du VHB afin de prévenir ou combattre les résistances aux analogues de nucléos(t)ides disponibles actuellement.
Tableau 2 Résistance croisée. Le tableau indique pour chaque souche du VHB sa susceptibilité aux différents analogues de nucléos(t)ides. Blanc = sensible, gris = baisse de sensibilité, vert = résistant.

Combattre et prévenir les résistances aux antiviraux

Quatre stratégies thérapeutiques peuvent être envisagées pour traiter un patient atteint d’hépatite B chronique (figure 5).

Premièrement, le patient peut être traité en monothérapie avec un analogue de nucléos(t)ide qui va permettre de diminuer la charge virale. S’il y a apparition d’une résistance, on peut décider de changer le traitement et d’administrer un 2^e analogue de nucléos(t)ides présentant un profil de résistances croisées différent. Le risque d’une telle thérapie dite «séquentielle» est de sélectionner des mutants résistants avec un changement progressif de la quasi-espèce virale pour arriver à une quasi-espèce composée d’une majorité de souches mutantes résistantes à une molécule. Cette situation virologique favorise la sélection de souches mutantes multirésistantes par additions successives de mutations de résistance sur le même génome viral. Ce scénario a été observé par exemple chez un patient ayant reçu un traitement à la lamivudine puis à l’entécavir [41].

La deuxième stratégie est d’ajouter un 2^e analogue de nucléos(t)ide en cas de résistance à un 1^er traitement. Avec une telle option thérapeutique, le risque de sélectionner des souches mutantes multirésistantes est moins important. Cependant, ceci peut se produire et notamment en cas de virosuppression insuffisante ou de transplantation hépatique où il y a un nombre important d’hépatocytes sains qui peuvent être infectés et donc un espace de réplication virale important [40].

La troisième stratégie thérapeutique serait de ne pas attendre les premiers signes d’un échappement virologique pour ajouter le 2^e analogue de nucléos(t)ide en cas de virosuppression insuffisante (c’est-à-dire si la charge virale est supérieure à 3 log après 6 mois de traitement par la lamivudine ou l’emtricitabine, ou après 12 mois de traitement par l’adéfovir ou l’entécevir). Cette option permettrait de maintenir une charge virale très faible et de retarder l’éventuelle apparition de souches mutantes multirésistantes.

Enfin, la dernière stratégie thérapeutique serait de combiner deux analogues de nucléos(t)ides ayant des profils de résistances croisées différents dès le début du traitement. Cette option, qui se base sur le fait que les souches multirésistantes ont une probabilité plus faible de préexister dans la quasi-espèce virale que les souches résistantes à une seule molécule, semble être en théorie la plus prometteuse. Cette stratégie doit être évaluée en essai clinique afin de déterminer le ratio entre le bénéfice thérapeutique et le coût du traitement.

Pour conclure, l’option thérapeutique la plus optimale serait de combiner des molécules ayant des mécanismes d’action différents et présentant une synergie antivirale. Cette combinaison théorique permettrait de diminuer les risques de résistance au traitement. Aucune synergie entre 2 analogues de nucléos(t)ides n’a pu être démontrée puisqu’ils ciblent une seule étape du cycle de réplication du VHB. La recherche doit donc aujourd’hui se concentrer sur le développement et l’évaluation de nouveaux composés antiviraux ciblant d’autres étapes du cycle viral.

Remerciements

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