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Le rôle du biologiste de la reproduction

Médecine Thérapeutique / médecine de la reproduction. Volume 9, Number 3, 195-8, Mai-Juin 2007, Revue

DOI : 10.1684/mte.2007.0074

Author(s) : Philippe Terriou , Institut de Médecine de la Reproduction, Marseille.

ARTICLE

Auteur(s) : Philippe Terriou

Institut de Médecine de la Reproduction, Marseille

L’arrêté du 10 mai 2001, qui rend possible la prise en charge en Assistance médicale à la procréation (AMP) des couples sérodiscordants pour les virus des hépatites B (VHB) ou C (VHC) ou pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), impose que la prise en charge des patients à risque viral se fasse dans un circuit d’AMP avec risque viral (RV) séparé du circuit d’AMP sans RV dans l’espace ou dans le temps. Cette prise en charge se fait au sein d’une équipe clinicobiologique structurée qui vérifie pour chaque couple que les critères légaux de prise en charge sur les plans médicaux, psychologiques et virologiques sont respectés. La mise en oeuvre de ces techniques par une équipe déjà agréée pour l’AMP fait l’objet d’une déclaration spécifique auprès du ministère chargé de la Santé. Le rôle du biologiste de la reproduction est donc dans ce contexte légal d’organiser un circuit d’AMP à risque viral, de réduire au minimum théorique le potentiel contaminant des gamètes des patients séropositifs et de participer avec les autres membres de l’équipe au contrôle des indications d’AMP et à la bonne tenue des dossiers RV.

L’organisation d’un circuit à risque viral

Le circuit spécifique d’AMP avec RV est organisé pour que les gamètes potentiellement infectieux des couples sérodiscordants ne contaminent pas les gamètes et/ou les embryons des couples séronégatifs qui sont pris en charge en AMP au sein de la même équipe. Le circuit RV doit être séparé du circuit d’AMP sans RV soit dans l’espace (les locaux d’AMP sans RV et d’AMP avec RV sont alors distincts), soit dans le temps (un arrêt momentané de l’activité AMP sans RV permet alors de pratiquer l’activité avec RV). La séparation dans l’espace est obligatoire pour les laboratoires à forte activité. Elle présente l’avantage de ne pas interrompre l’activité d’AMP aussi bien pour les couples sans RV que pour les couples sérodiscordants et garantit un accès aux soins satisfaisant pour tous. Elle présente cependant un gros inconvénient : un laboratoire spécialement dédié au RV nécessite un investissement important, puisque tout le matériel nécessaire pour réaliser une AMP doit être en double exemplaire : local, hotte, microscopes droit et inversé, loupe, centrifugeuse, poste de micro-injection pour intra cytoplasmic sperm injection (ICSI) mais aussi appareils de congélation des spermatozoïdes, de congélation des embryons, dispositifs permettant le remplissage de paillettes à haute sécurité, et plusieurs cuves de stockage. En effet, les gamètes doivent être séparés les uns des autres pour chaque type de virus (VIH, VHC et VHB) et doivent également être séparés des embryons. Enfin, l’arrêté du 10 mai 2001 précise que la mise en place d’une activité d’AMP à RV nécessite une formation spécifique du personnel vis-à-vis du risque viral.

Le rôle central du laboratoire dans la prise en charge : le « lavage » des gamètes

C’est grâce à la technique de « lavage » des gamètes que les couples sérodiscordants peuvent aujourd’hui être pris en charge en AMP et c’est par cette procédure que le laboratoire joue un rôle central dans cette prise en charge. Le lavage doit être réalisé aussi bien pour les gamètes féminins que pour les gamètes masculins potentiellement contaminés.

Le lavage des gamètes de femmes séropositives pour le VIH-1, le VHC ou le VHB

L’arrêté du 10 mai 2001 rend obligatoire la prise en charge des gamètes féminins dans un circuit spécifique à RV sans pour autant préciser les techniques devant être mises en œuvre. Le rôle du laboratoire dans la réduction du potentiel contaminant des gamètes féminins procédera donc du bon sens et résidera dans la réalisation de lavages soigneux des follicules ponctionnés dans des bains répétés de milieu de culture pour éliminer de façon optimale les particules virales libres et les cellules sanguines potentiellement contaminées. Il faut en effet garder à l’esprit que les liquides des ponctions folliculaires sont fréquemment contaminés par du sang et sont probablement plus souvent et fortement contaminés que la plupart des spermes de patients séropositifs. Le personnel doit donc prendre des précautions particulières pour se protéger, protéger le matériel et par là même protéger les gamètes et embryons des autres couples.

Enfin, chez les patientes porteuses du virus de l’hépatite B, l’arrêté du 10 mai 2001 précise qu’il y aura nécessité de vacciner l’enfant dans les 72 heures qui suivent la naissance.

Le lavage de sperme des patients séropositifs : cas des couples dont le conjoint est séropositif pour le VIH-1

Le lavage systématique du sperme est capital car il a été démontré que ce dernier peut contenir du virus même en cas de non-détection du virus dans le sang [1-3]. Si le virus peut être retrouvé dans le plasma séminal ou dans les leucocytes contenus dans le sperme [4, 5, 1, 6], sa présence au contact des spermatozoïdes ou des cellules germinales est incertaine [7-10, 6, 11]. C’est en vue d’inséminations que les premières techniques de lavage du sperme ont été utilisées en AMP [12]. Elles consistent généralement en l’utilisation successive d’un gradient de densité et d’une migration ascendante. Cependant, malgré ce lavage, Leruez-Ville et al. [13] ont retrouvé de l’ARN du VIH dans 8 préparations finales de spermatozoïdes issues de 125 patients dont 2 étaient traités ; cette présence s’est avérée plus fréquente lorsque la charge virale du VIH dans le plasma séminal est supérieure à 10 000 copies (26 % versus 11 %). Une autre équipe française n’a jamais retrouvé de génomes du VIH après préparation de 51 spermes issus de 33 patients séropositifs, alors que de l’ARN du VIH était retrouvé dans 30 % des plasmas séminaux initiaux sans relation évidente avec la charge virale sanguine [14]. En France, ce sont les résultats rassurants de deux essais cliniques de l’ANRS qui ont permis de préciser les conditions légales de prise en charge des couples sérodifférents : la première équipe a pris en charge 60 couples en cycles d’inséminations [15], la seconde a effectué des ICSI chez 68 couples [16].

L’arrêté du 10 mai 2001 précise que ce lavage doit être accompagné, d’une part, d’une exploration virologique du sperme frais et, d’autre part, d’une vérification de l’efficacité du lavage par une validation virologique. Une mesure de la charge virale du VIH-1 est donc effectuée dans le plasma séminal avant traitement du sperme. Si le nombre de copies est supérieur à 10 000/mL, le couple ne pourra pas être pris en charge tant que cette situation persiste. Dans le cas inverse, un traitement du sperme est effectué en privilégiant l’emploi successif d’un gradient de densité puis d’une migration ascendante. En pratique, le sperme est tout d’abord centrifugé sur un gradient de densité de particules de silane pendant 20 minutes à 300 g ; les cellules et débris indésirables pouvant contenir des virus restent piégés dans les parties supérieures du tube alors que les spermatozoïdes « lavés » sont récupérés au fond du tube puis débarrassés des particules de silane par dilution-centrifugation ; on pratique ensuite une migration ascendante en additionnant du milieu de culture au culot de centrifugation de spermatozoïdes et en laissant migrer ces derniers vers la surface du tube pendant 30 minutes dans une étuve chauffée à 37 °C. Les spermatozoïdes ayant migré dans la partie supérieure du tube sont récupérés alors que le culot pouvant encore (théoriquement) contenir des virus est éliminé. La détection d’ADN proviral ou d’ARN est ensuite réalisée sur la fraction finale des spermatozoïdes lavés. Cette détection doit être négative pour que la préparation finale puisse être utilisée en AMP. Cependant, le type de technique d’AMP utilisée dépendra de la charge virale trouvée initialement dans le plasma séminal : si cette charge virale était inférieure à 1 000 copies/mL, toutes les techniques d’AMP peuvent être utilisées (insémination, FIV, ICSI) ; si elle était supérieure à ce seuil (et inférieure à 10 000 copies/mL, seuil d’acceptabilité du dossier), il est recommandé de recourir à une ICSI. Il doit être souligné ici que c’est le seuil de détection de la charge virale qui définit le degré de certitude concernant l’absence totale de virus dans la fraction finale des spermatozoïdes lavés. Le risque zéro contamination n’existe donc pas et cette notion doit être expliquée clairement aux couples lors des entretiens avec l’équipe clinicobiologique.

Théoriquement, la technique d’AMP peut être réalisée le jour de la validation virologique. Cependant cette situation est rare en pratique étant donné la lourdeur des techniques mises en œuvre. La préparation finale des spermatozoïdes lavés est donc généralement congelée en deux lots : une partie est congelée sans cryoprotecteur pour validation par le laboratoire de virologie, l’autre partie est congelée avec cryoprotecteur pour être utilisée ultérieurement en AMP (en cas de validation virologique rassurante).

Si la technique de lavage utilisant successivement un gradient de silane puis une migration ascendante est une méthode sûre, elle présente l’inconvénient d’avoir un pourcentage de récupération de spermatozoïdes mobiles assez faible car il existe une perte de spermatozoïdes au cours de chacune des deux étapes qui la composent. De plus, si l’on considère que la congélation entraîne également une perte de spermatozoïdes et qu’un certain nombre d’entre eux doivent être cédés au laboratoire pour la validation virologique (un minimum de 500 000 gamètes lavés est nécessaire pour réaliser correctement cette analyse), on comprendra que certains recueils soient trop pauvres pour faire des paillettes suffisamment riches pour réaliser des inséminations, des FIV voire des ICSI. C’est pourquoi, en cas de premier recueil insuffisant, il sera demandé au patient un second recueil une ou deux heures après le premier pour obtenir des paillettes utilisables ultérieurement en AMP. De même, les patients présentant un volume d’éjaculat trop faible ne pourront pas être pris en charge si la quantité de plasma séminal disponible pour rechercher l’ARN du VIH-1 s’avère insuffisante.

Cas des couples dont le conjoint est séropositif pour le VHC

Il est utile de rappeler ici que la transmission du VHC par voie sexuelle est très faible et qu’il n’est pas nécessaire de recommander l’usage du préservatif au sein des couples sérodiscordants pour ce virus. Contrairement aux couples sérodiscordants pour le VIH, ces couples font donc appel aux techniques d’AMP uniquement en cas d’infertilité. L’arrêté du 10 mai 2001 précise donc que le sperme devra être traité et préparé au laboratoire en circuit RV selon les mêmes modalités décrites plus haut pour le VIH-1, c’est-à-dire en privilégiant l’utilisation successive d’un gradient de centrifugation et d’une migration ascendante. Si le patient est traité, on suspendra le traitement 6 à 8 mois avant la congélation de sperme. L’évaluation de la charge virale du VHC sur le plasma séminal conditionne la procédure ultérieure : si la recherche est négative, aucune nouvelle analyse virologique ne sera pratiquée sur la préparation finale de spermatozoïdes lavés ; si la recherche est positive, une nouvelle analyse sera effectuée sur la fraction intermédiaire ou finale de spermatozoïdes congelés (si la fraction intermédiaire est positive, l’étude de la fraction finale est systématique). Dans le cas où la fraction finale obtenue après préparation s’avère positive, le couple ne pourra pas être pris en charge en assistance médicale à la procréation.

La nécessité d’un second recueil pour pouvoir réaliser l’ensemble des techniques devant être mises en œuvre sera plus fréquente dans le cas des patients séropositifs pour le VHC que pour les patients séropositifs pour le VIH car, par définition, les couples sérodiscordants pour le VHC demandent une prise en charge en AMP pour des raisons d’infertilité dont un tiers est entièrement d’origine masculine et un autre tiers d’origine mixte.

Cas des couples dont le conjoint est séropositif pour le VHB

L’arrêté ne prévoit dans ce cas que deux choses : d’une part, la vaccination de la conjointe et d’autre part, l’obligation de traiter le sperme en circuit RV. Aucune technique particulière n’est recommandée. Une simple préparation de sperme obtenue par un lavage du sperme sur gradient de silane pourra donc être réalisée et utilisée le jour même en insémination, FIV ou ICSI sans être ni congelée ni validée sur le plan virologique.

Conclusion

Le biologiste de la reproduction tient un rôle central dans la prise en charge des couples sérodiscordants. C’est à lui en effet qu’incombe la charge d’organiser un circuit RV lorsque l’équipe clinicobiologique a décidé de réaliser un circuit séparé dans l’espace du circuit d’AMP sans RV. C’est à lui également que revient la tâche de rendre les gamètes potentiellement contaminants aptes à être utilisés en AMP avec un risque pour le conjoint et le futur enfant réduit au risque théorique. Comme les autres membres de l’équipe multidisciplinaire, le biologiste de la reproduction veillera au respect des critères légaux d’inclusion des couples dans le protocole RV et participera à l’établissement des indications d’AMP. Enfin, il donnera aux couples une information circonstanciée sur les techniques utilisées ainsi que sur leurs limites et recueillera leur consentement éclairé.

Références

1 Zhang H, Dornadula G, Beumont M, et al. Human immunodeficiency virus type 1 in the semen of men receiving highly active antiretroviral therapy. N Eng J Med 1998 ; 349 : 1803-10.

2 Dornadula G, Zhang H, Van Uitert B, et al. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA 1999 ; 282 : 1627-32.

3 Mayer KH, Boswell S, Goldstein R, et al. Persistence of human immunodeficiency virus in semen after adding indinavir to combination antiretroviral therapy. Clin Infect Dis 1999 ; 28 : 1252-9.

4 Quayle AJ, Xu C, Mayer KH, Anderson DJ. T lymphocytes and macrophages but not motile spermatozoa, are a significant source of human immunodeficiency virus in semen. J Infect Dis 1997 ; 176 : 960-8.

5 Coombs RW, Speck CE, Hughes JP, et al. Association between culturable human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in semen and HIV-1 RNA levels in semen and blood : evidence for compartmentalization of HIV-1 betwen semen and blood. J Infect Dis 1998 ; 177 : 320-40.

6 Kim LU, Johnson MR, Barton S, et al. Evaluation of sperm washing as a potential method of reducing HIV transmission in HIV-discordant couples wishing to have children. AIDS 1999 ; 6 : 645-51.

7 Dussaix E, Guetard D, Dauguet C, et al. Spermatozoa as potential carriers of HIV. Res Virol 1993 ; 144 : 487-95.

8 Baccetti B, Benedetto A, Burrini AG, et al. HIV-1 particles in spermatozoa of patients with AIDS and their transfer into the oocyte. J Cell Biol 1994 ; 127 : 903-14.

9 Bagasra O, Farzadegan H, Seshamma T, Oakes JW, Saah A, Pomerantz RJ. Detection of HIV-1 proviral in sperm from HIV-1 infected men. AIDS 1994 ; 8 : 1669-74.

10 Muciaccia B, Filippini A, Ziparo E, Colelli F, Baroni CD, Stefanini M. Testicular germ cells of HIV-seropositive asymptomatic men are infected by the virus. J Reprod Immunol 1998 ; 1-2 : 81-93.

11 Pudney J, Nguyen H, Xu C, Anderson DJ. Microscopic evidence against HIV-1 infection of germ cells or attachment to sperm. J Reprod Immunol 1999 ; 1-2 : 57-77.

12 Brechard N, Galea P, Silvy F, Amram M, Chermann J-C. Study of HIV localization in sperm. Contracept Fert Sex 1997 ; 5 : 389-91.

13 Leruez-Ville M, De Almeida M, Tachet A, et al. Assisted reproduction in HIV-1 serodifferent couples : the need for viral validation of processed semen. AIDS 2002 ; 17 : 2267-73.

14 Pasquier C, Daudin M, Righi L, et al. Sperm washing and virus nucleic acid detection to reduce HIV and hepatitis C virus transmission in serodiscordant couples wishing to have children. AIDS 2000 ; 14 : 2093-9.

15 Daudin M, Pasquier C, Izopet J, et al. Le protocole ANRS 096 : prise en charge en assistance médicale à la procréation des couples sérodifférents dont l’homme est infecté par le VIH. Résultats préliminaires de Toulouse. Reprod Hum Horm 2001 ; 6 : 365-9.

16 Guibert J, Merlet F, Le Du A, et al. Prise en charge des couples sérodiscordants pour le VIH. Résultats du protocole NECO (ANRS 092) à Paris. Reprod Hum Horm 2001 ; 6 : 363-4.