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Protéomique et spectrométrie de masse : applications en clinique

Hépato-Gastro. Volume 12, Number 6, 427-35, Novembre-Décembre 2005, Bases fondamentales

Résumé

Author(s) : Frédéric Lopez , IFR31, Institut Louis Bugnard, hôpital Rangueil, Bât L3, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4.

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ARTICLE

Auteur(s) : Frédéric Lopez

IFR31, Institut Louis Bugnard, hôpital Rangueil, Bât L3, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4

La compréhension de la fonctionnalité du vivant ne peut se faire qu’au travers de la connaissance de l’entité biologiquement active qu’est la protéine, produit de la traduction d’une entité moléculaire qu’est l’ARNm, lui-même issu de la transcription de fragments d’ADN que sont les gènes. De nouvelles approches méthodologiques permettent désormais d’appréhender la régulation de plusieurs milliers de gènes en parallèle, d’identifier et de caractériser l’expression des protéines au niveau cellulaire et subcellulaire par l’étude du protéome [1]. La « protéomique » met l’accent sur l’étude dynamique de l’expression des protéines cellulaires. Le défi actuel en recherche fondamentale et appliquée consiste à comprendre la fonction des protéines cellulaires à travers leurs régulations, modifications, interactions et à évaluer leur implication potentielle dans une maladie. Les avancées dans la connaissance des protéines impliquées dans une pathologie donnée constituent un atout majeur en terme d’identification de nouveaux marqueurs biologiques ou de nouvelles cibles pharmacologiques de cette pathologie.L’identification de ces protéines repose sur la spectrométrie de masse, technologie qui connaît un essor considérable depuis une dizaine d’années et dont nous nous proposons d’évoquer les applications potentielles en clinique humaine.

De l’échantillon protéique à la spectrométrie de masse

L’analyse protéomique comporte deux étapes fondamentales en amont de la spectrométrie de masse. L’étape initiale consiste à séparer les protéines contenues dans l’échantillon biologique étudié. Cette étape fait le plus souvent appel à l’électrophorèse bidimensionnelle (E-2D), technique séparative de très haut pouvoir résolutif [2]. La deuxième étape est le traitement et la mise en image de la séparation protéique qui permet d’établir une véritable carte protéique ( (figure 1) ).

La séparation bidimensionnelle combine la séparation des protéines selon leur charge (point isoélectrique ou pI) sur un gradient de pH (première dimension) et la séparation de ces mêmes protéines selon leur poids moléculaire dans un gel de polyacrylamide (deuxième dimension).

La précision dans la séparation des échantillons protéiques tient à la fois de la qualité des échantillons biologiques, notamment de leur compatibilité avec les conditions des expériences électrophorétiques, et de la disponibilité sur le marché de gradients de pH préformés qui assurent un fort pouvoir résolutif sur la première dimension. Néanmoins, certains critères de solubilité pour les protéines membranaires, de masse moléculaire pour les petites (< 7 000 Da) et les très grosses protéines (> 200 000 Da) ou encore d’hétérogénéité d’expression de certaines protéines, rendent quasiment impossible la séparation exhaustive de tous les composants d’un échantillon protéique donné.

La plus grande difficulté de l’analyse protéomique réside dans l’analyse et le traitement informatique des cartes protéiques. En effet, l’électrophorèse bidimensionnelle génère, pour chaque type d’analyse, des milliers de « spots » protéiques qu’il faut détecter, comparer entre eux ou d’un échantillon à un autre. Différentes méthodes de coloration sont actuellement disponibles pour la détection de « spots » protéiques séparés sur un gel bidimensionnel, qu’il s’agisse de coloration par le bleu colloïdal ou l’argent, détectables dans le visible, ou de marquage des protéines par des sondes fluorescentes [3]. Ces méthodes peuvent atteindre des sensibilités très importantes. Du fait de leur dynamique et de leur linéarité de détection, les sondes fluorescentes sont de plus en plus utilisées. Le développement de logiciels informatiques de plus en plus performants permet une précision encore meilleure dans la détection et la quantification de ces « spots ». Chaque protéine ainsi détectée, si elle est analysée et donc identifiée en spectrométrie de masse va générer elle-même de nombreuses données qu’il va également falloir traiter puis stocker. De fait, l’analyse de ces données est un véritable enjeu de la bio-informatique [4].

La spectrométrie de masse

Les principes

L’identification des protéines ainsi que leurs modifications sont possibles grâce aux techniques de spectrométrie de masse [5]. Nous détaillerons ici, la spectrométrie de masse Esi-Tof et Maldi-Tof ainsi que la spectrométrie de masse en tandem ou MS-MS ( (figure 2) ).

Le principe de la spectrométrie de masse consiste en :

– la génération d’ions chargés en phase gazeuse par la source Esi (Electro spray ionisation) ou Maldi (Matrix assisted-laser desorption/ionisation), à partir d’analytes non volatiles comme des protéines ou des peptides issus de la digestion trypsique des protéines ;
– la séparation de ces ions dans l’analyseur Tof (Time of flight) ;
– leur détection par un photomultiplicateur.

En spectrométrie de masse Maldi-Tof, l’échantillon protéique (natif ou préalablement digéré par la trypsine) est co-cristallisé sur une plaque ou cible avec une matrice. La source Maldi utilise l’énergie d’un laser qui, grâce à la matrice, va désorber l’échantillon et permettre l’éjection des ions positifs en phase gazeuse.

Dans une source Esi, l’échantillon protéique en solution arrivant à l’extrémité d’un capillaire est soumis à un champ électrique intense qui entraîne sa pulvérisation en gouttelettes de plus en plus fines jusqu’à l’obtention d’ions protéiques multichargés.

On appelle analyseur la partie du spectromètre de masse qui est responsable de la séparation des ions protéiques formés dans la source d’ionisation. Les analyseurs sont le plus souvent de type « temps de vol » ou Tof (Time of flight) et séparent les ions sur la base de leur rapport de masse sur charge (m/z). Les spectromètres de masse peuvent avoir également plusieurs analyseurs séparés par une chambre de fragmentation ; il s’agit alors d’analyseurs en tandem (MS/MS). Lorsque les ions peptidiques sélectionnés par le premier analyseur arrivent dans la chambre de fragmentation, ils entrent en collision avec des molécules de gaz rare et se fragmentent au niveau des liaisons peptidiques. Les fragments générés sont analysés dans un deuxième analyseur. Certains spectromètres de masse (trappe à ion notamment) peuvent assurer plusieurs cycles de sélection/fragmentation/analyse permettant ainsi d’avoir accès à des informations sur la séquence en acides aminés des peptides sélectionnés.

Modalités d’identification des protéines

L’identification de protéines excisées d’un gel 2D et analysées en spectrométrie de masse repose sur la comparaison des données obtenues avec les données disponibles dans les banques de données. Bien évidemment, la seule masse d’une protéine ne suffit pas à son identification. Cela implique que l’analyse d’une protéine en spectrométrie de masse ne porte pas uniquement sur la protéine entière mais s’effectue aussi sur des fragments peptidiques issus de la digestion de cette protéine par une enzyme (généralement la trypsine). La masse des peptides obtenus après digestion de la protéine par une protéase est alors comparée aux cartes de masses théoriques des protéines répertoriées dans les banques de données.

En cas d’incertitude liée à un nombre trop faible de fragments peptidiques générés ou encore pour appréhender les modifications post-traductionnelles (phosphorylations, glycosylations, acétylations, méthylations…) [6], le séquençage de peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) devient une étape indispensable.

Quantification des protéines

Bien que très performantes dans l’identification des protéines, les approches de spectrométrie de masse trouvent leur limite dans la quantification des protéines, essentiellement du fait de l’efficacité aléatoire d’ionisation des protéines ou des peptides. Des méthodes alternatives ont été mises en œuvre pour répondre à cette limitation. Ceci est d’un intérêt majeur et grandissant, dans l’analyse comparative d’un échantillon protéique à un autre. La stratégie ICAT (Isotope coded affinity tags) s’appuie sur le marquage différentiel de deux échantillons protéiques par deux isotopes distincts, un léger et un lourd, dont la différence de masse, précisément détectable en spectrométrie de masse est de 8 Da [7]. Les protéines ainsi marquées sont mélangées et digérées par la trypsine. Les peptides générés portant l’ICAT sont purifiés par affinité, analysés en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem ( (figure 3) ). Les peptides sont donc détectés par paires, chaque couple de pic ayant une différence de masse caractéristique des deux isotopes. L’analyse des peptides de chaque couple isotopique (séparés de 8 Da) permet l’identification et une analyse quantitative relative d’une même protéine d’un échantillon à un autre.

Les approches méthodologiques en recherche

Electrophorèse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse et chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

De façon très schématique, deux stratégies peuvent être mises en œuvre pour l’analyse des protéines selon qu’elles sont digérées par une protéase avant ou après leur séparation.

La première approche consiste en la séparation des protéines avant leur digestion en peptides et requiert des méthodes séparatives de choix comme l’électrophorèse bidimensionnelle. Des méthodes nouvelles utilisent le marquage différentiel de deux échantillons protéiques par des sondes fluorescentes (2DE DIGE) et permettent désormais l’analyse de deux échantillons dans un même gel [9]. Malgré cela, la mise en place de l’électrophorèse 2D reste peu pertinente pour des approches de caractérisation à « haut débit » de nouveaux marqueurs et une utilisation ultérieure en clinique humaine.

La deuxième approche consiste à digérer les protéines en peptides qu’il faut ensuite séparer avant leur analyse en spectrométrie de masse. La chromatographie liquide (LC) en phase inverse, en amont de la spectrométrie de masse, est une méthode séparative de choix pour les fragments peptidiques. Cependant, digérer les protéines d’un échantillon biologique c’est augmenter considérablement la complexité de ce même échantillon. Si l’on admet qu’un échantillon contient 1 000 protéines, que chaque protéine digérée génère 50 peptides, cela revient à analyser 50 000 peptides par échantillon.

Quelques exemples

La spectrométrie de masse Maldi-Tof est utilisée en recherche pour la caractérisation d’un certain nombre de pathologies comme le cancer, la maladie d’Alzheimer, ou encore l’arthrite rhumatoïde.

La découverte de nouveaux marqueurs tumoraux est d’un intérêt capital pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi de la réponse aux traitements des pathologies cancéreuses. La technique d’électrophorèse bidimensionnelle couplée aux analyses en spectrométrie de masse a permis la mise en évidence de marqueurs sériques pour des cancers comme l’hépatocarcinome, les cancers de la vessie, du sein, du rein ou du poumon [13].

S’agissant des cancers digestifs, Valerio et al. ont analysé les sérums de 13 patients atteints de cancer pancréatique, de 9 patients atteints de pancréatite chronique et de 10 sujets sains, directement en spectrométrie de masse Maldi-Tof. Les résultats de cette étude font état de la présence sur le spectre Maldi de « pics » spécifiques des états pathologiques et de certains autres spécifiques de l’état normal [14].

Qu’il s’agisse des approches d’électrophorèse bidimensionnelle ou de chromatographie liquide, ces méthodes sont d’un intérêt essentiel en recherche, pour la caractérisation de nouveaux biomarqueurs. Leur grande difficulté de mise en œuvre constitue cependant un handicap majeur à leur application en clinique. Des méthodes alternatives, plus rapides et moins onéreuses sont en cours de développement pour des applications diagnostiques courantes.

Application à la pratique clinique

Les enjeux fondamentaux en clinique humaine

L’idée d’utiliser la protéomique en clinique repose sur la possibilité de mesurer plusieurs marqueurs protéiques simultanément et d’établir un profil d’expression protéique spécifique d’une pathologie [8]. Ceci devrait permettre une meilleure classification des pathologies, leur dépistage précoce et probablement un meilleur ciblage et suivi thérapeutique. Un des champs d’application émergent dans la recherche de nouveaux marqueurs demeure les pathologies cancéreuses avec l’idée que le développement de processus cancéreux s’accompagne d’une sécrétion anormale de peptides ou de protéines dans les fluides biologiques. Ce sont ces dérivés protéiques qui font l’objet d’une attention toute particulière afin de diagnostiquer et de classer des pathologies à l’aide de prélèvements non invasifs.

Les approches méthodologiques

Surface enhanced laser desorption ionization-time of flight (Seldi-Tof)-mass spectrometry

La technologie Seldi combine deux techniques puissantes que sont la chromatographie et la spectrométrie de masse dans le but précis d’obtenir rapidement des profils d’expression protéique à partir d’un échantillon biologique [10] avec une simplication des étapes de séparation des protéines ou des peptides contenus dans ces échantillons.

Le principe de la spectrométrie de masse Seldi-Tof repose sur la séparation des différentes protéines selon leurs propriétés chimiques ou biochimiques sur des surfaces (ProteinChip Array) aux propriétés chimiques (anionique, cationique, hydrophobe, hydrophile, métallique…) ou biochimiques (anticorps, récepteur, ADN, enzymes…) très spécifiques ( (figure 4) ). Les surfaces de type chimique ont pour but de séparer des classes de protéines tandis que les surfaces de type biochimique séparent les protéines selon leur spécificité d’interaction avec la molécule cible immobilisée (antigène-anticorps, enzyme-substrat, récepteur-ligand, ADN-protéine…) [11].

Après une phase de pré-purification par affinité sur la ProteinChip^®, les protéines sont analysées dans le lecteur Seldi (Surface enhanced laser desorption/ionization) – Tof (temps de vol) - MS.

En quelques secondes, sont ainsi déterminées les masses moléculaires des différentes protéines capturées.

L’intérêt majeur de ce type d’approche consiste en la rapidité de mise en œuvre pour l’établissement et la comparaison de profils d’expression de protéines d’un échantillon à un autre et la caractérisation de marqueurs spécifiques d’une pathologie donnée. L’étape d’identification de tels marqueurs fait appel à des méthodes classiques de digestion, in situ, des protéines prépurifiées sur les différentes surfaces de chip et d’analyse en spectrométrie de masse en tandem (MS-MS) [12].

Quelques exemples

De nombreux exemples dans la littérature font état de l’utilisation de la technologie Seldi pour la caractérisation de nouveaux marqueurs. Certaines études établissent les cartes d’expression protéique d’un tissu pathologique comparativement à un tissu sain ou à partir de lignées cellulaires établies [15]. Une étude menée sur des lysats cellulaires de 39 lignées différentes de cellules cancéreuses (poumon, colon, estomac, sein, ovaire, rein, peau, prostate) a permis l’identification d’une protéine de 12 KDa, la prothymosine α, comme marqueur des tumeurs coliques [16]. D’autres études ont permis de caractériser des profils d’expression spécifiques des cancers de la prostate [17], du sein [18] ou encore la production d’amyloïde β dans la maladie d’Alzheimer [19].

Mais l’idée la plus séduisante demeure la possibilité de pouvoir détecter de tels marqueurs dans les fluides biologiques plus facilement accessibles comme l’urine pour les cancers de la vessie [20] ou les pathologies rénales [21], le liquide céphalo-rachidien pour la maladie d’Alzhzeimer [22] et particulièrement dans les produits dérivés du sang (plasma, sérum).

Le concept de « protéome sérique » naît de la constatation que le sérum perfuse en permanence les tissus, qu’il contient de grosses quantités de protéines (même si certaines sont prépondérantes comme l’albumine ou encore les immunoglobulines) et de nombreux fragments peptidiques issus de la dégradation enzymatique des protéines cellulaires. Outre les constituants protéiques bien connus du sérum, les protéines sériques d’intérêt se composent de protéines sécrétées par les tissus et des produits de sécrétion des tumeurs. Le pari est fait qu’un changement dans la physiologie d’un organe va entraîner des modifications de certaines protéines contenues dans le sérum, notamment dans la fraction des faibles masses moléculaires [23].

Des protéines de faible masse moléculaire, des peptides et autres composés retrouvés dans le sérum ont été associés à des pathologies comme le cancer, le diabète associé au cancer du pancréas et les maladies cardiovasculaires et infectieuses.

Récemment, plusieurs groupes ont démontré la pertinence de l’analyse du « protéome sérique » pour le diagnostic du cancer de l’ovaire [24], du sein [25, 26], de la prostate [27, 28], du rein [29], du foie [30] ou encore du pancréas [31].

Nouveaux développements technologiques

Une application extrêmement récente, puisque née à la fin des années 1990, de la spectrométrie de masse Maldi-Tof, est l’imagerie par spectrométrie de masse qui consiste à établir des profils de distribution (spectre de masse Maldi-Tof) de peptides et de protéines en chaque point d’une coupe de tissu [32]. Les analyses Maldi se font soit directement sur des coupes fraîchement congelées après application de la matrice, soit après transfert de la coupe de tissu sur une membrane de polyéthylène et application de la matrice.

De telles applications ont été mises en œuvre par le groupe de Caprioli pour des études sur différents tissus, notamment sur le côlon, l’épididyme ou encore la prostate de souris. Pour chaque tissu, les profils de protéines montrent une très grande spécificité et une reproductibilité en nombre de pics, rapport m/z et intensité des différents pics d’un individu à un autre.

L’intérêt de ces approches technologiques réside dans les applications cliniques. Des premières études sur le cerveau notamment, ont permis de caractériser des profils protéiques spécifiques sur des coupes de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris ou de tumeurs cérébrales humaines [32, 33]. La question de l’identification de marqueurs potentiels demeure une priorité avec la possibilité de générer des spectres MS-MS et donc d’identifier certaines de ces protéines.

Un des intérêts grandissant de ces approches est la possibilité de reconstituer des images à partir des profils d’expression protéiques sur les coupes de tissus ( (figure 5) ), permettant une localisation précise de l’expression de marqueurs potentiels. Avec des spectromètres de masse dont la résolution du laser est de 25 µm, et probablement moins dans les années à venir, et la possibilité de rendre compatible les analyses histo-morphologiques avec l’imagerie par spectrométrie de masse, ces nouveaux développements technologiques devraient à terme fournir des informations précieuses pour le diagnostic de certaines tumeurs solides.

Conclusion

Un des aspects essentiels en recherche fondamentale et pour des applications cliniques courantes ultérieures, est la découverte de marqueurs protéiques spécifiques des différentes pathologies. L’idée est de pouvoir établir une « bio signature » à partir des profils d’expression protéique, et si possible de fluides biologiques, permettant la discrimination rapide, précise et fiable de différents états pathologiques.

Les développements récents de nouvelles méthodes séparatives combinées à des avancées technologiques considérables des spectromètres de masse (précision, sensibilité, résolution, quantification) font de l’analyse protéomique une méthodologie incontournable pour la découverte de nouveaux marqueurs diagnostiques ou de sensibilité aux traitements thérapeutiques. Avec l’avènement récent de technologies comme le Seldi ou l’imagerie par spectrométrie de masse, il est évident que les avancées de la recherche fondamentale dans ce domaine sont à la base du développement probable de nouveaux tests cliniques au service de la médecine et des patients.

Remerciements

Au Dr Nicole Vaysse pour la relecture attentive et critique du manuscrit et ses utiles suggestions.

Bibliographie

1 Kahn P. From genome to proteome : looking at a cell’s proteins. Science 1995 ; 270 : 369-70.

2 Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics : old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2002 ; 2 : 3-10.

3 Cristea IM, Gaskell SJ, Whetton AD. Proteomics techniques and their application to hematology. Blood 2004 ; 103 : 3624-34.

4 Patterson SD. Data analysis--the Achilles heel of proteomics. Nat Biotechnol 2003 ; 21 : 221-2.

5 Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 2003 ; 422 : 198-207.

6 Mann M, Jensen ON. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat Biotechnol 2003 ; 21 : 255-61.

7 Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol 1999 ; 17 : 994-9.

8 Seliger B, Kellner R. Design of proteome-based studies in combination with serology for the identification of biomarkers and novel targets. Proteomics 2002 ; 2 : 1641-51.

9 Karp NA, Kreil DP, Lilley KS. Determining a significant change in protein expression with DeCyder during a pair-wise comparison using two-dimensional difference gel electrophoresis. Proteomics 2004 ; 4 : 1421-32.

10 Hutchens TW, Yip TT. New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules. Rapid Commun Mass Spectrom 1993 ; 7 : 576-80.

11 Issaq HJ, Veenstra TD, Conrads TP, Felschow D. The SELDI-TOF MS approach to proteomics : protein profiling and biomarker identification. Biochem Biophys Res Commun 2002 ; 292 : 587-92.

12 Caputo E, Moharram R, Martin BM. Methods for on-chip protein analysis. Anal Biochem 2003 ; 321 : 116-24.

13 Poon TC, Johnson PJ. Proteome analysis and its impact on the discovery of serological tumor markers. Clin Chim Acta 2001 ; 313 : 231-9.

14 Valerio A, Basso D, Mazza S, Baldo G, Tiengo A, Pedrazzoli S, et al. Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis : searching for a diagnostic protein pattern. Rapid Commun Mass Spectrom 2001 ; 15 : 2420-5.

15 von Eggeling F, Junker K, Fiedle W, Wollscheid V, Durst M, Claussen U, et al. Mass spectrometry meets chip technology : a new proteomic tool in cancer research? Electrophoresis 2001 ; 22 : 2898-902.

16 Shiwa M, Nishimura Y, Wakatabe R, Fukawa A, Arikuni H, Ota H, et al. Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform. Biochem Biophys Res Commun 2003 ; 309 : 18-25.

17 Paweletz CP, Liotta L, Petricoin 3rd EF. New technologies for biomarker analysis of prostate cancer progression : Laser capture microdissection and tissue proteomics. Urology 2001 ; 57 : 160-3.

18 Wulfkuhle JD, McLean KC, Paweletz CP, Sgroi DC, Trock BJ, Steeg PS, et al. New approaches to proteomic analysis of breast cancer. Proteomics 2001 ; 1 : 1205-15.

19 Austen BM, Frears ER, Davies H. The use of seldi proteinchip arrays to monitor production of Alzheimer’s betaamyloid in transfected cells. J Pept Sci 2000 ; 6 : 459-69.

20 Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. Am J Pathol 2001 ; 158 : 1491-502.

21 Hampel DJ, Sansome C, Sha M, Brodsky S, Lawson WE, Goligorsky MS. Toward proteomics in uroscopy : urinary protein profiles after radiocontrast medium administration. J Am Soc Nephrol 2001 ; 12 : 1026-35.

22 Lewczuk P, Esselmann H, Groemer TW, Bibl M, Maler JM, Steinacker P, et al. Amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid as profiled with surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry : evidence of novel biomarkers in Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry 2004 ; 55 : 524-30.

23 Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome : history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics 2002 ; 1 : 845-67.

24 Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002 ; 359 : 572-7.

25 Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J, Shih Ie M, Pham T, Fung ET, et al. Proteomic approaches to tumor marker discovery. Arch Pathol Lab Med 2002 ; 126 : 1518-26.

26 Li J, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer. Clin Chem 2002 ; 48 : 1296-304.

27 Petricoin 3rd EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani A, Hackett PS, Hitt BA, et al. Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. J Natl Cancer Inst 2002 ; 94 : 1576-8.

28 Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res 2002 ; 62 : 3609-14.

29 Won Y, Song HJ, Kang TW, Kim JJ, Han BD, Lee SW. Pattern analysis of serum proteome distinguishes renal cell carcinoma from other urologic diseases and healthy persons. Proteomics 2003 ; 3 : 2310-6.

30 Poon TC, Yip TT, Chan AT, Yip C, Yip V, Mok TS, et al. Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes. Clin Chem 2003 ; 49 : 752-60.

31 Koopmann J, Zhang Z, White N, Rosenzweig J, Fedarko N, Jagannath S, et al. Serum diagnosis of pancreatic adenocarcinoma using surface-enhanced laser desorption and ionization mass spectrometry. Clin Cancer Res 2004 ; 10 : 860-8.

32 Stoeckli M, Chaurand P, Hallahan DE, Caprioli RM. Imaging mass spectrometry : a new technology for the analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat Med 2001 ; 7 : 493-6.

33 Schwartz SA, Weil RJ, Johnson MD, Toms SA, Caprioli RM. Protein profiling in brain tumors using mass spectrometry : feasibility of a new technique for the analysis of protein expression. Clin Cancer Res 2004 ; 10 : 981-7.