Optical diagnosis of cervical dysplasia

ARTICLE

Auteur(s) : Igor Charvet¹_, Paolo Meda¹_, Magalie Genet²_, Marie-Françoise Pelte³_, Anne-Thérèse Vlastos⁴

¹ Département de morphologie, Centre médical universitaire, 1, rue Michel-Servet, 1211 Genève 4, Suisse
² Mauna Kea Technologies (MKT), Paris, France
³ Département de pathologie, Centre médical universitaire, Hôpital cantonal, Genève, Suisse
⁴ Département de gynécologie, Maternité de Genève, Hôpital cantonal, Genève, Suisse

Biopsie optique par mesure de réflectance

La mesure de réflectance ne nécessite aucune addition de molécules exogènes et représente l'une des techniques les plus facilement envisagées dans une application clinique, car totalement non invasive. Lors de leur propagation au sein d'un tissu, les photons ont dans leur grande majorité un trajet sinueux (phénomène de diffusion) et finissent soit par être absorbés par des chromophores (phénomène d'absorption), soit par ressortir du tissu (phénomène de rétrodiffusion) (figure 1). La lumière rétrodiffusée, appelée réflectance, peut être mesurée et analysée par des programmes spécifiques pour obtenir soit des spectres optiques caractéristiques de l'état physiopathologique du tissu (spectroscopie de réflectance), soit une image de la zone sondée (imagerie de réflectance) qui permet d'apprécier directement la morphologie du tissu.

Spectroscopie de réflectance

Cette technique, appelée aussi spectroscopie de dispersion élastique, consiste à utiliser des modèles mathématiques de propagation de la lumière dans les milieux biologiques, pour analyser la réflectance mesurée à la surface d'un tissu et en déduire les spectres de diffusion et d'absorption de la zone sondée. Les variations spectrales (forme et intensité) de la diffusion dépendent spécifiquement de la structure du tissu (densité cellulaire, composition de la matrice) et de l'architecture cellulaire (rapport nucléo-cytoplasmique, taille et forme des noyaux) [6]. En revanche, le spectre d'absorption reflète les principaux chromophores présents dans les tissus de surface, tels que l'hémoglobine, la mélanine et l'eau [7]. C'est ainsi que des lésions entraînant des changements structuraux ou métaboliques d'un tissu peuvent être détectées par des variations caractéristiques des spectres de diffusion et d'absorption (figure 2). Selon différents modèles d'analyses, l'observation de signatures spectrales spécifiques permet aujourd'hui de différencier différents types et grades de lésions survenant dans les tissus de surface de divers organes.
Au niveau du col utérin, la morphologie nucléaire et le contenu en ADN influencent l'intensité de diffusion de la lumière [8]. Ainsi, l'augmentation de la taille des noyaux et de la densité en chromatine au cours de la progression des lésions dysplasiques a pu être clairement détectée in vivo par des variations des spectres de diffusion [8, 9]. Des diagnostics de dysplasie cervicale ont également pu être réalisés à partir de variations des spectres d'absorption [9] et même du signal brut de réflectance [10]. L'enjeu actuel, pour que la spectroscopie de réflectance offre le maximum de sensibilité pour la détection des lésions dysplasiques, est d'analyser de façon combinée différents paramètres optiques (réflectance, absorption, diffusion, fonction de phase), dans des petits volumes de tissus, de l'ordre du milimètre cube [11]. Une utilisation simultanée avec les techniques de spectroscopie fondées sur la mesure de fluorescence et avec les nouvelles technologies d'imagerie devrait également permettre d'améliorer l'approche.

Imagerie de réflectance

• Imagerie de polarisation

Lors de leur propagation, les photons subissent peu de diffusion au sein d'un tissu hautement organisé tel que l'épithélium (phénomène dit de simple diffusion), alors que de multiples diffusions se produisent dans les tissus sous-jacents, principalement du fait de l'enchevêtrement des fibres composant les tissus conjonctifs (diffusion multiple) [12]. En se fondant sur les propriétés de polarisation de la lumière, qui varient en fonction des régimes de simple et multiple diffusion, il est possible de mesurer spécifiquement le signal de simple diffusion et d'en déduire la structure spectrale fine des couches cellulaires superficielles. L'analyse du signal épithélial par des modèles mathématiques évaluant la distribution en taille des noyaux, leur densité et leur index de réfraction relatif à celui du cytoplasme, permet de reconstituer une image de la surface de l'épithélium œsophagien, sous forme d'une distribution de noyaux de morphologie anormale [12]. Au niveau du col utérin, l'utilisation de l'imagerie de polarisation a permis d'augmenter la sensibilité de détection des lésions néoplasiques et de distinction de leurs différents grades [13].
En utilisant une caméra vidéo pour analyser de larges champs à distance des tissus de surface, l'imagerie de polarisation permet également d'améliorer sensiblement le contraste des images obtenues, en facilitant par exemple le diagnostic de plusieurs types de lésions cutanées [14]. Une miniaturisation de l'instrumentation optique devrait rendre cette technologie applicable à l'examen à distance de la surface du col, dans le but de localiser rapidement les zones à risque.

• Imagerie confocale fibrée

Les nouvelles méthodes d'imagerie de réflectance, utilisant la technologie de la microscopie confocale à balayage laser transmise par fibre optique (imagerie confocale fibrée de réflectance), permettent d'obtenir en temps réel et de manière non invasive (aucune utilisation d'agents exogènes n'est nécessaire) une image des structures cellulaires et subcellulaires des tissus, à des profondeurs allant jusqu'à 100 µm à partir de la surface de l'organe [15, 16]. À ce jour, les sondes disponibles offrent une sensibilité aux faibles signaux de rétrodiffusion et une résolution (jusqu'à 1 µm latéralement et 10 µm axialement) qui sont suffisantes pour permettre la détection d'anomalies cellulaires survenant dans les tissus épithéliaux [16]. Des analyses de tissu cervical ex vivo ont ainsi démontré l'intérêt de l'imagerie confocale fibrée de réflectance pour la détection de dysplasies (figure 3) [17]. Une pratique clinique à grande échelle de cette approche représente la prochaine étape pour évaluer son impact sur le dépistage cervical. Également, une miniaturisation des sondes suffisante pour leur utilisation par voie endoscopique représente un potentiel certain pour réaliser un diagnostic in vivo des lésions endométriales.

• Tomographie par cohérence optique

Au-delà d'une profondeur de 100 à 200 µm à partir de la surface d'un tissu, les photons qui permettent la formation d'images par mesure de réflectance (photons dits balistiques rétrodiffusés, qui ont gardé la mémoire de leur phase et, donc, qui interfèrent de façon déterministe) sont noyés dans le fond de la lumière multidiffusée. Pour atteindre en profondeur une résolution de l'ordre du micromètre, une technique interférométrique utilisant une source lumineuse à faible longueur de cohérence (TCO ou tomographie par cohérence optique) peut être employée pour sélectionner les photons balistiques rétrodiffusés. La faible longueur de cohérence permet de réaliser des images à très haute résolution (1 µm), à partir de « tranches » optiques réalisées à une profondeur de tissu allant de quelques centaines de micromètres à 1 mm [18]. Grâce à l'émission et à la captation de la lumière par fibre optique, la TCO endoscopique est possible, en tout cas au stade expérimental [19]. Il a ainsi été possible d'obtenir une sensibilité supérieure à 80 % et une spécificité supérieure à 70 % pour la détection de dysplasies cervicales de haut grade [19, 20]. Afin d'améliorer encore ces performances, la spectroscopie de fluorescence et l'imagerie par TCO ont été combinées avec succès pour distinguer les lésions néoplasiques du col [21].

• Agents de contraste et bioconjugués

L'application sur le col d'acide acétique à des doses cliniquement tolérables permet d'améliorer le contraste de l'imagerie confocale de réflectance en augmentant les signaux de rétrodiffusion provenant des noyaux [22]. L'emploi de tels agents de contraste combiné à celui de différentes technologies de mesure de réflectance devrait améliorer les performances diagnostiques des lésions cancéreuses débutantes. Si l'imagerie de réflectance offre, avec ou sans agent de contraste, une visualisation directe de la morphologie tissulaire, elle peut aussi permettre d'apprécier la distribution et l'expression de molécules spécifiques. Il a ainsi été démontré que l'application de nanoparticules d'or, détectables par leur propriétés de diffusion et couplées à des anticorps spécifiques contre les récepteurs de l'EGF (ce récepteur est surexprimé lors du processus de carcinogenèse), marque les cellules précancéreuses dans l'épithélium cervical ex vivo [23]. De tels bioconjugés devraient donc permettre, outre leur utilisation diagnostique, de visualiser l'expression de différents marqueurs précoces du cancer du col et, ainsi, de fournir une imagerie moléculaire in vivo visant à améliorer la compréhension des mécanismes de carcinogenèse.
Le futur du dépistage précoce des cancers du col par mesure de réflectance repose, d'une part, sur l'utilisation combinée de différentes techniques de spectroscopie et d'imagerie actuellement mises au point et, d'autre part, sur le développement de nouveaux systèmes diagnostiques permettant une résolution spectrale de l'ordre du nanomètre, au travers d'une vaste gamme de longueurs d'onde visibles.

Biopsie optique par mesure de fluorescence

L'analyse non invasive des tissus par mesure de fluorescence représente la technique de biopsie optique la plus investiguée en cancérologie pour l'aide au diagnosic précoce. Le principe consiste à détecter une variation dans l'intensité, la durée d'émission ou la distribution de fluorescence entre un tissu sain et un tissu tumoral (figure 4). La fluorescence mesurée par les techniques de spectroscopie ou d'imagerie peut être naturelle (autofluorescence) ou provenir de fluorophores exogènes (fluorescence induite)

Spectroscopie de fluorescence

• Mesure d'autofluorescence

La plupart des tissus recèlent des fluorophores endogènes, identifiables par une émission dans une région spectrale spécifique, et dont la distribution est concentration-dépendante du métabolisme et de la structure du tissu. Le tryptophane, les flavines, la porphyrine, le coenzyme nicotineamide adénine dinucléotide (NADH), l'élastine et le collagène sont parmi les fluorophores endogènes les plus étudiés à ce jour pour le diagnostic optique des lésions précancéreuses de divers organes. Au niveau du tissu cervical, il a ainsi été démontré que la contribution du NADH à l'autofluorescence totale augmente lorsque le tissu progresse d'un état normal à un stade néoplasique, alors que la contribution du collagène diminue [24]. L'augmentation de la fluorescence du NADH se localise principalement au niveau de l'épithélium et serait liée à une activité métabolique plus élevée du tissu dysplasique, alors que la baisse de fluorescence du collagène, localisée dans le stroma sous-jacent, serait induite par une diminution de la densité des fibres de collagène et par un épaississement de la muqueuse qui empêche une fraction de la lumière excitatrice d'atteindre le tissu conjonctif. Les mesures d'autofluorescence pour le diagnostic cervical ont abouti au développement de systèmes de matrices permettant une mesure simultanée des spectres de fluorescence en fonction de plusieurs longueurs d'onde excitatrices. L'utilisation de ces matrices sur un échantillon de 146 patientes a ainsi permis de détecter des dysplasies cervicales de haut grade avec une sensibilité de 71 % et une spécificité de 77 % [25]. Ces résultats peuvent néanmoins être sensiblement influencés par de nombreux facteurs tels que le degré histopathologique des lésions analysées (dysplasie de faible, moyen et haut grade), l'inflammation chronique, le cycle menstruel, l'âge, la race, le tabagisme, la présence d'acide acétique, de mucus ou, encore, la ménopause [26-29]. La prise en compte de ces variables dans les algorithmes de différenciation spectrale devrait améliorer les performances diagnostiques des matrices de fluorescence et, par conséquent, faciliter la détection des dysplasies aux stades les plus précoces. Par ailleurs, des études sur la sélection de longueurs d'onde d'excitation optimale devraient aboutir au développement de matrices moins coûteuses, permettant une plus large application clinique.

• Mesure de fluorescence exogène

Il est possible de forcer le phénomène de fluorescence en administrant des fluorophores artificiels non cytoxiques et facilement administrables. Cette approche est issue de la thérapie photodynamique des cancers (PDT) et a comme but la réalisation de biopsies optiques à visée de diagnostic topographique. En PDT, un photosensibilisateur non cytotoxique se fixe préférentiellement sur le tissu néoplasique et est rendu toxique par une excitation lumineuse. Dans le diagnostic photodynamique (PDD), le but est de visualiser des lésions néoplasiques en utilisant un photosensibilisateur fluorescent. Deux de ces agents ont été utilisés en clinique humaine. Il s'agit de l'hématoporphyrine (ou photofrine II) et surtout de l'acide 5-amino-lévulinique (5ALA). Le 5ALA entraîne une synthèse endogène de protoporphyrine IX (PpIX), le précurseur de l'hème des érythroblastes, dont la fluorescence peut être détectée à 630 nm. De nombreuses études ont montré l'intérêt diagnostique du 5ALA en gynécologie, particulièrement au niveau du col de l'utérus [30, 31]. Quelle que soit l'origine de la lésion, les zones dysplasiques ont montré une fluorescence plus intense que les tissus sains environnants : 60 à 90 minutes après application de 5ALA sur le col, la mesure de la fluorescence de la PpIX a permis de détecter des dysplasies avec une sensibilité de 94 % et une spécificité de 75 %, dans un échantillon de 68 femmes [32]. L'utilisation clinique de cette approche diagnostique repose désormais sur les recherches de nouvelles formulations (gels, spray, etc.) et de modes d'administration optimaux (utilisation systémique ou topique), ainsi que sur de nouvelles générations d'ALA (pentyl ou hexyl esters) qui pourraient générer une fluorescence plus intense et obtenue plus rapidement qu'avec le marqueur standard.

Imagerie de fluorescence

L'imagerie de fluorescence vise à fournir un diagnostic à partir d'une image de la structure du tissu. Les mesures de fluorescence peuvent se faire localement (au niveau du contact entre la sonde de mesure et la surface du tissu) ou à distance, et les signaux recueillis peuvent provenir soit de la fluorescence spontanée du tissu, soit de fluorophores exogènes de type organique ou inorganique.

• Mesures ponctuelles de la fluorescence

En utilisant une procédure d'imagerie de fluorescence par l'utilisation d'une sonde de fibres optiques au contact avec la surface du tissu à explorer, la microscopie confocale fibrée permet de visualiser le tissu avec une résolution cellulaire. À partir de mesures d'autofluorescence du tissu cervical ex vivo, Sokolov et al. [23] ont ainsi réalisé des images confocales d'épithélia qui, combinées à une analyse par imagerie de réflectance, montrent les différences morphologiques entre tissus dysplasiques et normaux.
L'imagerie confocale fibrée par mesure de fluorescence exogène est envisagée au niveau du col utérin en utilisant des marqueurs non toxiques de type photosensibilisateur (5ALA) ou colorants vitaux (violet de crésyl) pour localiser les zones néoplasiques. L'application de marqueurs nucléaires et/ou membranaires devrait permettre une visualisation à haute résolution de la structure tissulaire et, ainsi, de mieux apprécier les différences morphologiques entre tissus dysplasiques et sains (figure 5). On peut aussi avoir recours à des fluorophores qui témoignent d'activités métaboliques liées au processus de carcinogenèse ou, encore, à de nouvelles générations de fluorophores inorganiques, dits quantum dots, qui génèrent une fluorescence très stable dans le temps et sont moins toxiques que les fluorophores classiques. Pour l'instant, ces marqueurs n'ont été évalués que chez l'animal ou sur des explants de tissus humains.

• Mesures à distance de la fluorescence

Bien que particulièrement performantes pour le diagnostic des néoplasies cervicales, les techniques de spectroscopie et d'imagerie confocale fibrée de fluorescence citées précédemment nécessitent toutes un contact entre les sondes de mesure et la surface du tissu pour permettre l'acquisition et donc l'analyse des signaux émis. Cette condition ne permet en général pas d'explorer plus de un millimètre carré de tissu lors de chaque mesure, ce qui, dans le cadre d'une recherche de lésions, nécessite la multiplication des mesures sur la zone à analyser. Dès lors, ces mesures en un seul point sont préférentiellement envisagées pour l'analyse de petites régions déjà considérées comme suspectes.
Des techniques d'imagerie de fluorescence permettant d'explorer en un seul temps de larges zones à risque ont ainsi été développées ces dernières années. Reposant sur l'utilisation de sondes maintenues à distance de la surface du tissu, elles permettent une mesure de la fluorescence spontanée (autofluorescence) ou exogène (après application d'un photosensibilisateur). Dans les deux cas, la difficulté de l'approche est de résoudre ou de minimiser les distorsions des signaux de fluorescence intrinsèques induites par des phénomènes de réflexion de surface et par des effets géométriques (variations de distance et d'angulation entre la sonde et la surface du tissu). En ce qui concerne la mesure d'autofluorescence, les équipements mis au point pour le diagnostic du col utérin permettent en général de visualiser la zone sondée sous forme d'une image virtuelle révélant des variations d'intensité de fluorescence liées aux changements tissulaires. L'application d'algorithmes d'analyse spectrale et/ou de systèmes de réseaux neuronaux permet alors de distinguer, en temps réel, les zones de lésions néoplasiques des zones de tissu sain [33]. Pour les mesures à distance de fluorescence exogène, la zone sondée est imagée grâce à la fluorescence spécifique de l'agent (de type 5ALA) qui s'est accumulé dans les zones dysplasiques [32]. Que ce soit par mesure de fluorescence endogène ou exogène, les capacités diagnostiques de l'imagerie à distance du tissu cervical sont satisfaisantes puisqu'elles révèlent une détection des dysplasies avec des sensibilités toujours supérieures à 85 % et des spécificités supérieures à 50 % [31-33].
Afin d'abaisser le coût des technologies d'imagerie et d'envisager leur application à grande échelle, des instrumentations plus simplifiées sont désormais développées, par exemple en remplaçant les spectromètres d'imagerie par des caméras CCD vidéo couleur, capables à la fois de collecter et de résoudre spectralement la fluorescence émise par le tissu. Ces développements ont permis d'améliorer le diagnostic de lésions cervicales à des niveaux comparables à ceux des approches utilisant des spectromètres [34].

• Fluorophores inorganiques

L'utilisation pour l'imagerie in vivo de nouveaux marqueurs fluorescents de la famille des quantum dots (boîtes quantiques) devrait également améliorer le dépistage précoce du cancer du col. Les quantum dots sont des fluorophores inorganiques formés de nanocristaux de semi-conducteurs, dont la principale caractéristique est une longueur d'onde d'émission qui est directement en rapport avec leur taille [35]. Des quantum dots de tailles différentes mais produits à partir du même matériau semi-conducteur émettent donc à des longueurs d'onde différentes lorsqu'ils sont excités par un même rayonnement. Cette propriété révolutionne l'imagerie biomédicale car elle permet, à partir d'une seule longueur d'onde d'excitation, de visualiser simultanément plusieurs quantum dots de couleurs différentes, chacun correspondant à une cible spécifique. De plus, les quantum dots utilisés in vivo résistent beaucoup mieux au photoblanchiment (c'est-à-dire à la perte d'émission de fluorescence sous l'effet d'un rayonnement d'excitation prolongé) que les fluorophores organiques traditionnels (rhodamine, fluorescéine, green fluorescent protein, etc.) et présentent une plus faible phototoxicité dans le temps [35-37]. Récemment, il a été montré que les quantum dots peuvent être couplées à diverses biomolécules, tels que des ADN simple brin, des vitamines incorporées par des cellules cancéreuses ou encore des anticorps monoclonaux [37, 38]. De telles approches devraient permettre d'obtenir in vivo une analyse moléculaire (distribution des marqueurs, localisation préférentielle, surexpression) qui viendrait utilement compléter l'analyse morphologique fournie par l'imagerie d'autofluorescence ou par les marqueurs exogènes classiques. Les multiples variétés de quantum dots et la possibilité de leur utilisation simultanée permettraient en outre, à partir d'un seule excitation, un screening rapide de l'expression d'un grand nombre de molécules liées au développement des lésions néoplasiques, améliorant ainsi non seulement les performances diagnostiques mais aussi la compréhension des processus de carcinogenèse.

Le futur du dépistage précoce des cancers du col par mesure de fluorescence repose certainement sur l'utilisation combinée des technologies de spectroscopie et d'imagerie et sur une analyse simultanée de la fluorescence spontanée et de celle observée après administration de marqueurs type 5ALA. Une étude préliminaire a porté sur une telle association pour le diagnostic des lésions polypoïdes du côlon [39], qui devrait ouvrir la voie pour l'application à d'autres organes. À ce jour, l'application topique (sous forme de spray ou de gel) de bioconjugués de type anticorps – quantum dots – se heurte aux difficultés inhérentes à l'expression inconstante des antigènes tumoraux de surface et à leur hétérogénéité. Cependant, les travaux en cours devraient permettre d'utiliser cette technique dans un proche futur pour réaliser des biopsies optiques renseignant à la fois sur la morphologie et la distribution de marqueurs moléculaires des tissus néoplasiques [38, 40, 41].

Conclusion et perspectives

Aujourd'hui, les progrès des techniques biophotoniques aboutissent à la mise au point de sondes de fibres optiques spectroscopiques ou d'imagerie, pouvant être placées dans le canal opérateur d'endoscopes et, ainsi, être utilisées comme adjuvant à l'endoscopie conventionnelle en lumière blanche. De même, la microscopie confocale in vivo, utilisant soit la lumière réfléchie (réflectance), soit la fluorescence, permet désormais d'atteindre une résolution largement suffisante pour l'analyse des épithélia qui sont à l'origine de la vaste majorité des lésions précancéreuses. Le couplage de ces techniques d'analyse microscopique du tissu in vivo avec des sondes de balayage à grande surface (macroscopie) devrait permettre de cartographier de larges zones à risque, de localiser rapidement les lésions, puis de déterminer leur grade. Dans cette approche, des instruments d'endoscopie confocale pour l'examen du col utérin devraient bientôt être présentés. Bien que les techniques de spectroscopie et d'imagerie présentées ici permettent une détection efficace des dysplasies du tissu cervical, nombre d'entre elles sont des innovations récentes et sont encore soit au stade expérimental, soit à leurs débuts de validation clinique. Ces instrumentations, sans cesse améliorées et aux capacités évolutives importantes, nous permettront d'apprécier l'impact d'une application à grande échelle de la biopsie optique sur la qualité du dépistage du cancer cervical. Du fait de son caractère non invasif et d'une analyse en temps réel, la biopsie optique représente incontestablement l'un des outils les plus prometteurs pour la réduction des risques et des coûts liés au diagnostic du tissu cervical qui, à ce jour, restent élevés de par la nécessité de biopsies tissulaires et de l'analyse histologique qui s'ensuit.
Enfin, les techniques de biopsie optique par mesure de réflectance et fluorescence peuvent être combinées avec d'autres modalités d'imagerie, telles que l'imagerie radiologique, étant donné l'interférence minimale entre les fibres optiques et, par exemple, les champs magnétiques utilisés en IRM. On peut ainsi s'attendre à ce que le futur appareillage dédié à l'examen du col utérin représente une panoplie de méthodes optiques complémentaires, chacune offrant des performances uniques pour le diagnostic précoce du cancer cervical. ▾ Remerciements. Ce travail a été rendu possible grâce au Fonds de recherche et développement des Hôpitaux universitaires de Genève. Les recherches effectuées au laboratoire du Pr P. Meda sont subventionnées par le Fond national suisse pour la recherche scientifique (3100-067788.02), la Fondation de pour la recherche sur le diabète, l'Union européenne (QLRT-2001-01777), le National Institute of Health (DK 63443-01) et le Juvenile Diabetes Research Foundation International (1-2001-622). n

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