Tumor angiogenesis

ARTICLE

Auteur(s) : Andréas Bikfalvi*

* Laboratoire des mécanismes moléculaires de l’angiogenèse (Inserm E0113), Université Bordeaux I, avenue des Facultés, 33405 Talence

Article reçu le 27 janvier 2003 accepté le 31 mars

Néanmoins, la possibilité d’isoler et de cultiver les cellules endothéliales in vitro ainsi que la mise en évidence de la production par les cellules cancéreuses de facteur(s) diffusible(s) capable(s) de stimuler la croissance, la migration et la différenciation des cellules endothéliales ont contribué à mettre le concept de l’angiogenèse tumorale sur des bases expérimentales solides. L’activité identifiée dans des extraits cellulaires ou des milieux conditionnés a été appelée « facteur de l’angiogenèse tumorale » ou TAF (tumor angiogenesis factor) [3]. Le premier facteur TAF identifié était un facteur de croissance déjà connu pour ses propriétés angiogéniques, le facteur de croissance des fibroblastes (fibroblast growth factor, ou FGF) [4]. Par la suite, celui-ci a été isolé à partir de nombreux tissus tumoraux et ses facultés de stimuler l’angiogenèse in vitro et in vivo ont été confirmées [5]. D’autres facteurs non homologues des FGF ont ensuite rejoint la famille des TAF. La conjonction des travaux de plusieurs équipes a notamment révélé le rôle majeur du vascular endothelial growth factor (VEGF) dans l’angiogenèse nécessaire à la croissance de certaines tumeurs solides [6, 7]. Récemment, un certain nombre de nouveaux acteurs de l’angiogenèse ont été identifiés comme Notch, Delta ou les éphrines et leurs récepteurs. Il est probable que ces molécules interviennent également dans l’angiogenèse tumorale. 
La régulation moléculaire de l’angiogenèse fait intervenir un équilibre entre facteurs pro et anti-angiogéniques qui contrôlent négativement ce processus [8]. Par ailleurs, un nouveau concept d’angiogenèse tumorale a vu le jour récemment : la néovascularisation des tumeurs par vasculogenèse. En effet, des précurseurs de cellules endothéliales circulantes provenant de la moelle osseuse peuvent contribuer significativement (en fonction de la tumeur) à la néovascularisation tumorale 9]. 
Si l’on a identifié de plus en plus précisément les régulateurs principaux et annexes de l’angiogenèse et si certaines interactions entre ces facteurs ont été caractérisées, les étapes moléculaires concertées régies par ceux-ci et conduisant au switch ne sont pas clairement élucidées. Dans cet article, nous résumons les avancées récentes dans le domaine de l’angiogenèse tumorale. Pour complément, le lecteur pourra se référer aux revues récentes de Hagedorn et Bikfalvi [8], Bikfalvi et Bicknell [10] et de Javerzat et al. [11].

Mécanismes moléculaires de l’angiogenèse tumorale : switch angiogénique

La surexpression de l’antigène T sous la dépendance du promoteur d’un gène de régulation de l’insuline induit un insulinome chez la souris transgénique (lignée RIP-Tag). Ce modèle, développé par Hanahan et al. en 1985, a permis de mieux comprendre les mécanismes du démarrage de la néovascularisation tumorale et de fournir une base expérimentale pour le concept de switch angiogénique (figure 2) [12]. Les îlots pancréatiques de souris RIP-Tag prélevés en phase pré-angiogénique et cultivés en présence de cellules endothéliales n’entraînent pas de modification de ces dernières quant à leur statut de différenciation, de migration ou de prolifération. En revanche, lorsque les îlots sont prélevés à un stade de malignité déclarée et co-cultivés avec les cellules endothéliales en gel de collagène en trois dimensions, la formation de réseaux capillaires convergents vers l’îlot d’angiogenèse est observée. Cela indique que les cellules tumorales acquièrent la capacité de stimuler l’angiogenèse au cours de leur progression maligne. Différentes molécules semblent être à l’origine du switch angiogénique dans ce modèle. La présence de VEGF-A est absolument requise car ce facteur semble être essentiel et non redondant ; les souris présentant une inactivation conditionnelle du gène ne sont plus capables de développer une néovascularisation tumorale dans ce modèle [13]. Par ailleurs, Bergers et al. [14] ont également montré que le VEGF est transloqué des cellules tumorales vers l’endothélium tumoral grâce à l’action d’une protéase, la métalloprotéinase MMP9, et que cette translocation est un événement essentiel pour le switch angiogénique. La conversion du pro-MMP9 en MMP9 semble être le fait d’une autre protéase, la MMP3. L’activation oncogénique est également impliquée dans le switch comme cela était montré pour l’oncogène ras [15]. L’insertion d’un oncogène c-ras activé dans des cellules MCF7 entraîne l’induction de l’expression du VEGF et la formation in vivo de tumeurs très vascularisées.
La perte d’hétérozygotie au locus codant pour p53 favorise clairement le switch, de même que le facteur de croissance/survie IGF11 ; le FGF1 semble également impliqué. Le rôle de la protéine p53 a été élucidé dans différents modèles [16, 17]. Elle régule positivement l’activité d’inhibiteurs de l’angiogenèse comme la thrombospondine (TSP1) et négativement le VEGF. Kerbel et al. [18] ont récemment montré que des tumeurs HCT116 négatives pour p53 étaient moins sensibles, in vivo, à l’inhibition par des molécules anti-angiogéniques que les tumeurs HCT116 p53-positives. En dehors de la thrombospondine 1 (TSP1), la thrombospondine 2 (TSP2) semble participer à la quiescence de l’endothélium vasculaire et constitue un mécanisme de défense de l’hôte (cf. infra).
Dans un autre système, le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC), la stimulation de la formation de néovaisseaux s’accompagne de la perte d’un inhibiteur de l’angiogenèse. Il s’agit de l’angiostatine [19]. Paradoxalement, celle-ci est produite par la tumeur primaire elle-même et inhiberait le développement des métastases latentes. Cette situation est différente de celle décrite pour le modèle Rip-Tag dans lequel le contrôle se situe au niveau de la tumeur primaire.
L’hypoxie est un facteur essentiel de régulation du switch angiogénique [20]. L’hypoxie induit l’expression du VEGF-A et down-régule l’expression de la TSP2 dans un grand nombre de cellules normales ou transformées. La nature précise de cette régulation a été récemment élucidée. Une enzyme, appelée prolyl-4-hydroxylase (PHD), lie l’oxygène moléculaire et le fixe sur des résidus spécifiques de proline du HIF1α. Une autre protéine, appelée protéine de von Hippel-Lindau (VHL), lie ensuite le HIF1α oxydé, et le complexe est ensuite ubiquitinylé et dégradé dans le protéasome.
Quand le taux d’oxygène baisse, ce processus est ralenti et le taux de HIF1α augmente. À l’inverse, quand le taux d’oxygène augmente, la dégradation de HIF1α est accélérée.
Il existe trois familles de PHD (PHD1, PHD2, PHD3) possédant des similarités de séquence. En dehors des sites d’hydroxylation de proline, des sites d’asparagine hydroxylée ont été identifiés. L’enzyme responsable de cette hydroxylation n’a pas encore été identifiée. Une autre cible de l’hypoxie est également HIF2α [21]. Néanmoins, la cible transcriptionnelle dans ce cas est le VEGFR2 au niveau de la cellule endothéliale.

Facteurs impliqués dans l’angiogenèse tumorale

VEGF

Plusieurs équipes ont démontré que les membres de la famille des VEGF stimulent la croissance des cellules endothéliales. L’action des VEGF est plus restreinte que celle des FGF. Le VEGF-A existe sous quatre isoformes de 121, 165, 189 et 206 acides aminés. Des homologues du VEGF-A ont été décrits qui incluent le VEGF-B, pour lequel un rôle angiogénique a récemment été proposé, et les VEGF-C, D et E (voir sur la lymphangiogenèse) [22, 23].
Les molécules de VEGF-A se fixent sur deux types de récepteurs de surface appelés FLK1 (ou KDR ou VEGFR2) et FLT1 (VEGFR1) ainsi que sur un co-récepteur la neuropilline 1 (NRP1) (figure 3). La transduction du signal par ces types de récepteurs a récemment fait l’objet de recherches actives [24, 25]. Le VEGF-A a une affinité dix fois plus importante pour le VEGFR1 que pour le VEGFR2. Cependant, l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 est fortement stimulée par le VEGF-A, contrairement à celle du VEGFR1. Le VEGFR2 active, après sa stimulation, la voie des MAP kinases, principalement par l’intermédiaire de la PLCγ et de la PKC. Le VEGFR1 est capable de s’associer à la sous-unité p85 de la phosphatidylinositol-3-kinase. De plus, la phosphorylation de Fyn et de Yes est stimulée en réponse au VEGF-A dans les cellules exprimant le VEGFR1. Par ailleurs, le VEGFR1 est exprimé à la surface de cellules hémapoïétiques et de monocytes dont le recrutement dans des foyers néoangiogéniques semble important pour faciliter le développement de la néovascularisation [26].
L’ensemble des données indique donc que le VEGFR2 et le VEGFR1 participent tous les deux à la signalisation mais par des voies distinctes. Quant à la NRP1, elle joue le rôle de co-récepteur pour le VEGFR2 principalement [27].
L’invalidation par recombinaison homologue (knock-out) des gènes codant pour le VEGF-A, le VEGFR2 et le VEGFR1 a été réalisée et met en évidence le rôle primordial de ces molécules lors de l’angiogenèse embryonnaire [28].
La transcription du gène codant pour le VEGF-A est activée dans les cellules tumorales mais ne l’est, en général, dans les cellules endothéliales. En revanche, le VEGFR2 et le VEGFR1 sont présents à la surface des cellules endothéliales adjacentes aux cellules tumorales et le VEGFR1 au niveau des monocytes et des cellules hématopoïétiques participant à l’angiogenèse tumorale. Notons qu’une source supplémentaire de VEGF-A est constituée par les lymphocytes infiltrant la tumeur [29]. Cela indique que le VEGF-A induit l’angiogenèse sur un mode paracrine. Il semble qu’il agit principalement via le VEGFR2 directement au niveau de la cellule endothéliale tumorale. En effet, chez la souris nude, la croissance des glioblastomes est inhibée par surexpression dans les cellules endothéliales d’une forme dominante-négative de VEGFR2 [30]. Néanmoins, Shibuya et al. [31] ont montré que le VEGFR1 pouvait renforcer l’effet du VEGF-A dans l’angiogenèse tumorale.
Le VEGF-A a été détecté à des concentrations très élevées dans un certain nombre de tumeurs comme les tumeurs du poumon et de la vessie. Cette surexpression est accompagnée d’une augmentation significative de la densité de microvaisseaux dans les tumeurs. Par ailleurs, l’expression du VEGF-A dans les cellules tumorales est positivement corrélée avec le pouvoir métastasiant.
En utilisant principalement des approches de transgenèse et d’invalidation conditionnelle spécifique, des informations importantes concernant l’activité des différentes formes du VEGF ont été obtenues [10]. Si le VEGF¹²¹ semble être indispensable pour le développement et l’organogenèse, l’ensemble des isoformes du VEGF-A est capable d’induire l’angiogenèse tumorale. Par ailleurs, une isoforme du VEGF-B, le VEGF-B¹⁸⁶, est exprimée dans certains types de tumeurs. Quant aux VEGF-C et D, leur action dans la lymphangiogenèse est actuellement très étudiée (cf. infra). La famille des placental growth factors (PLGF1, 2 et 3) apparentés aux VEGF semble jouer un rôle principalement dans la neoangiogenèse post-natale en activant exclusivement le VEGFR1 (figure 3). En effet, les souris PLGF1^-/- ne présentent pas de déficits développementaux, mais ont une inhibition de l’angiogenèse lors de l’ischémie, l’inflammation et du cancer dans des modèles expérimentaux.
L’activité du VEGFR2 peut être inhibée par des anticorps neutralisants, des inhibiteurs de tyrosine kinase, des récepteurs du VEGF (principalement VEGFR2) et par l’administration de récepteur soluble, en particulier du VEGF-trap, un récepteur soluble créé par la fusion du domaine extracellulaire du VEGFR1 et/ou du VEGFR2 à la région constante Fc des immunoglobulines IG1 [32, 33]. Le développement tumoral est plus fortement inhibé par le VEGF-trap que par des anticorps solubles. Par ailleurs, le VEGF-trap est capable d’inhiber également la co-option de vaisseaux, ce qui peut expliquer sa plus grande efficacité par rapport à d’autres stratégies d’inhibition du VEGF.

FGF

Les FGF appartiennent à une famille qui compte actuellement 23 membres [11, 34-37]. Les propriétés angiogéniques de deux prototypes FGF1 et FGF2 ont été particulièrement étudiées.
Le FGF1 et le FGF2 ont un poids moléculaire de 18 kDa et une homologie d’environ 50 %. Ces deux facteurs se lient à des récepteurs de surface cellulaire spécifiques. Quatre types de récepteurs à activité tyrosine kinase ont été caractérisés, incluant FGFR1 (Fig), FGFR2 (bek), FGFR3 et FGFR4 [34]. Leur spécificité et leur affinité sont régulées par épissage alternatif d’exons codant pour la 3’ boucle d’immunoglobuline-like (Ig-like) extracellulaire. En particulier, la variante lg-like Ilc lie préférentiellement le FGF2. Les cellules endothéliales expriment les récepteurs FGFR1 et FGFR2, et l’autophosphorylation est stimulée par le FGF1 et le FGF2. Le FGF2 est synthétisé sous différentes formes [34]. Les formes de haut poids moléculaire du FGF2 (HPM FGF2), de 21 à 24 kDa, ont une extension N-terminale riche en motifs GC présentant des arginines méthylées. Ces formes sont localisées préférentiellement dans le noyau. À l’opposé, la forme standard du FGF2 (d’un poids moléculaire de 18 kDa) ne comporte pas d’extension N-terminale. Il semble que le FGF intracellulaire est capable de s’associer directement à des facteurs de transcription, ce qui pourrait médier son action [35, 37].
Le FGF1 et le FGF2 stimulent l’angiogenèse in vitro et in vivo. Les FGF activent au niveau de la cellule endothéliale non seulement la voie classique des MAP kinases, mais aussi la p38 kinase qui semble jouer un rôle capital dans la morphogenèse tubulaire des vaisseaux capillaires [38]. Par ailleurs, syndecan 4 est impliqué dans l’action du FGF2 sur l’endothélium vasculaire [39]. En effet, la transfection de récepteurs dominant-négatifs de syndecan 4 bloque complètement l’activité du FGF2.
Des observations récentes confirment l’implication du FGF2 dans l’angiogenèse tumorale. L’expression du FGF2 est fortement associée à la densité microvasculaire dans des tumeurs synthétisant le FGF2 comme les mélanomes cutanés [28] et l’expression du FGFR1 est stimulée dans les vaisseaux angiogéniques. L’injection de molécules anti-sens pour le FGF2 ou le FGFR1 inhibe le développement de mélanomes [40]. De même, l’injection d’adénovirus recombinant codant pour l’ADNc du récepteur soluble du FGFR1 (qui inhibe l’activité des FGF) dans des souris RipTag entraîne une inhibition de l’angiogenèse et du développement tumoral in vivo 41]. Aussi, le traitement de souris présentant une xénogreffe de mélanome, avec des anticorps neutralisants inhibant à la fois le FGF et le VEGF, est plus efficace que le traitement avec un inhibiteur mono-spécifique inhibant seulement le VEGF [42]. Par ailleurs, une protéine de liaison du FGF2, le FGF-BP1, a été identifiée 43]. Il a été proposé que cette molécule agisse comme un chaperon qui lie le FGF2 et mobilise la molécule liée à la matrice extracellulaire pour stimuler l’angiogenèse. Le FGF-BP1 pourrait participer de cette manière au switch angiogénique.
Il est probable que l’action du FGF dans l’angiogenèse est à la fois directe et indirecte. Auguste et al. [44] ont montré que des cellules de gliome C6 transfectées avec le récepteur dominant-négatif R1 ou R2 du FGF (FGFR1-DN, FGFR2-DN) présentaient une inhibition de la prolifération et de la migration cellulaire des cellules tumorales mais également une capacité réduite d’induire l’angiogenèse in vitro et in vivo et une inhibition de l’expression du VEGF-A. Par ailleurs, les cellules MCF7 transfectées avec une autre forme de FGF, le FGF4, présentent une croissance tumorale in vivo augmentée et une induction de la synthèse du VEGF-A [45]. Le FGF2 est aussi capable d’induire l’expression d’un autre membre de la famille des VEGF, le VEGF-C, et de participer à la lymphangiogenèse.

Angiopoïétines

L’angiopoïétine 1 (Ang1) a été identifiée comme le ligand de la kinase transmembranaire Tie2 par une approche de clonage appelée secretion trap expression cloning [46]. C’est une protéine glycosylée de 70 kDa. Elle est formée de deux régions : la région amine-terminale contient un motif de type coiled-coil caractéristique des protéines capables d’hétérodimériser ; la région carboxyle-terminale est homologue au fibrinogène. L’Ang1 se lie à Tie2 et active sa phosphorylation.
Au cours du développement embryonnaire de la souris, son expression est localisée, à un stade précoce, au niveau du myocarde et du mésenchyme et, à un stade ultérieur, dans les cellules environnant les vaisseaux en développement. La rupture du gène codant pour l’Ang1 conduit à une létalité des embryons au stade 12,5 jours, qui est vraisemblablement la conséquence de modifications profondes de l’architecture vasculaire.
L’Ang1 semble induire la formation de tubes capillaires in vitro à partir de sphéroïdes de cellules endothéliales [47]. Par ailleurs, le ciblage de l’Ang1 dans la peau de souris transgéniques utilisant le promoteur K14 ou par l’injection d’adénovirus entraîne une augmentation du diamètre des vaisseaux sans extravasation [48]. L’implication de l’Ang1 dans l’angiogenèse semble indirecte par l’induction, au niveau des cellules endothéliales, des facteurs responsables du recrutement des cellules mésenchymateuses (cellules accessoires, péricytes). Des données récentes indiquent que l’Ang1 peut aussi contribuer au remodelage vasculaire en l’absence de cellules mésenchymateuses accessoires [49].
Différents autres types d’angiopoïétines ont été identifiés incluant l’angiopoïétine 2, 3, 4 et 5 (Ang2, Ang3, Ang4 et Ang5). S’il est établi que l’Ang2 est un antagoniste de l’Ang1, le rôle des autres angiopoïétines n’est pas clairement connu. Il semble que l’Ang2 joue un rôle primordial dans l’angiogenèse tumorale grâce à son effet antagoniste sur l’Ang1 [50]. Une étude récente montre que l’expression de l’Ang2 est significativement corrélée à un mauvais prognostic et à une angiogenèse tumorale très importante [51]. Cela est encore plus prononcé quand l’expression du VEGF est élevée dans ces tumeurs.

TGFβ

Le TGFβ est secrété dans une forme inactive latente et peut être activé par l’action de protéases. La dimérisation du TGFβ actif entraîne l’hétérodimérisation des récepteurs de types I et II et conduit à la phosphorylation du TGFβ-RI. TGFβ-RI agit ensuite sur des substrats de type CO-SMAD et SMAD4 qui sont ensuite transloqués dans le noyau et se lient aux SMAD binding elements (SBE) qui entraînent l’activation de la transcription [52].
Le TGFβ exerce une action biphasique sur les cellules endothéliales in vitro, stimulatrice à faible concentration, inhibitrice à plus forte concentration. In vivo cependant, cet effet semble être stimulateur sur l’angiogenèse tumorale.
Par exemple, le traitement des tumeurs de la prostate LNCaP par le latency activating peptide (LAP) ou par des anticorps anti-TGFβ neutralisants entraîne une inhibition de l’angiogenèse et du développement tumoral [53].

Régulateurs du développement

Des études récentes ont montré qu’un certain nombre de gènes possédant un rôle général dans le développement embryonnaire régulent aussi le développement vasculaire, dont des membres de la famille des éphrines et leurs récepteurs, Notch et Notch ligands, et des molécules de la famille des hedghog et leurs récepteurs.
La famille Notch comprend des récepteurs transmembranaires (Notch 1, 2, 3 et 4) qui lient un certain nombre de ligands dont Delta et Jagged [54-56]. Grâce à des expériences de trangenèse et d’invalidation des différentes formes de Notch chez la souris, il a été clairement établi que Notch participe au remodelage de la vascularisation embryonnaire, à la spécification des artères et des veines et à l’angiogenèse [54, 55]. Il a été récemment montré que Delta4, un ligand de Notch, est fortement exprimé au cours de la néoangiogenèse chez l’adulte et dans des tumeurs [56]. Cela indique que ces récepteurs et ligands sont potentiellement importants dans l’angiogenèse tumorale. Le Sonic hedgehog (shh) et l’indian hedhog (ihh) participent eux aussi au remodelage de la vascularisation embryonnaire. Par ailleurs, le shh est exprimé dans le tissu cardiovasculaire post-natal et induit la formation de vaisseaux de plus grand diamètre et l’augmentation du flux sanguin après ischémie [57]. Son rôle dans l’angiogenèse tumorale n’a pas encore été documenté mais est très probable.

Facteurs neuronaux

Récemment, il est devenu clair que nombre de gènes tenus pour être spécifiques pour les neurones ont aussi un rôle dans l’angiogenèse. Cela indique que les systèmes nerveux et cardiovasculaire ont des similarités d’un point de vue de leur développement. Récemment, il a été montré que deux d’entre eux, la NRP1 et les éphrines, interviennent dans l’angiogenèse tumorale [27, 58]. La NRP1 intervient dans l’angiogenèse tumorale de deux manières. D’une part, au niveau de la cellule endothéliale, la NRP1 est le co-récepteur du VEGFR2, indispensable à l’activation de ce récepteur par le VEGF-A¹⁶⁵. D’autre part, la NRP1 peut être exprimée au niveau de la cellule tumorale et former un complexe ternaire avec le VEGF-A et le VEGFR2 au niveau de la cellule endothéliale. Par ailleurs, il a été rapporté qu’elle pourrait faire partie d’une boucle autocrine de survie au niveau de la cellule tumorale elle-même [59].
Si les rôles de l’éphrine B2 et de l’éphrine EphB4 dans le développement ont été bien étudiés et si l’éphrine B2 est exprimée dans certaines tumeurs, leur rôle dans l’angiogenèse tumorale n’est pas encore établi [58]. En revanche, une étude récente montre l’implication de l’éphrine A1 et de son récepteur EphA2 dans l’angiogenèse tumorale [60]. En effet, l’éphrine A1 est exprimée dans les cellules tumorales et endothéliales, mais l’ephA2 l’est seulement au niveau des cellules endothéliales. Par ailleurs, l’EphA2 soluble fusionné avec le fragment Fc des immunoglobulines inhibe l’angiogenèse et le développement tumoral in vivo.

Inhibiteurs

Un certain nombre de molécules inhibitrices de l’angiogenèse ont été identifiés [8, 10, 61]. Certaines sont des molécules endogènes de régulation ou des fragments de ces molécules générés par clivage protéolytique. Des informations plus détaillées sont données plus loin sur les thrombospondines, l’angiostatine, l’endostatine, le fragment hémopexine (PEX) de la métalloprotéinase MMP2 et le facteur plaquettaire 4 (PF4) ainsi que sur de nouveaux inhibiteurs récemment identifiés.

• Thrombospondines

La thrombospondine 1 (TSP1) appartient à une famille de glycoprotéines produites par nombre de cellules normales et transformées. Il a été montré qu’elle est un inhibiteur puissant de l’angiogenèse in vivo et in vitro et joue un rôle dans le switch angiogénique [16, 62]. Par exemple, sa surexpression dans des lignées cellulaires A431 et SCC-13 inhibe fortement le développement tumoral in vivo chez la souris sans pour autant modifier la croissance in vitro [63]. La perte d’un gène suppresseur de tumeur dans les fibroblastes de hamster induit aussi une réponse angiogénique par diminution de la sécrétion de la TSP1.
La nature du gène suppresseur capable de réguler l’expression de la TSP1 a été élucidée en utilisant les fibroblastes isolés de patients présentant la maladie de Li-Fraumeni. Il est identique à la protéine p53 [16]. Finalement, la TSP1 est régulée par Id1 qui est aussi un répresseur de la transcription [64].
La TSP1 inhibe l’angiogenèse tumorale grâce à des effets directs sur la prolifération, la migration et la survie des cellules endothéliales mais aussi grâce à des effets indirects sur la mobilisation des facteurs pro-angiogéniques. En effet, la TSP1 est capable de lier et d’activer CD36 à la surface des cellules endothéliales mais aussi d’empêcher la mobilisation du VEGF de la cellule tumorale vers la cellule endothéliale grâce à une inhibition de l’activation de MMP9 [65].
La TSP1 inhibe le développement des vaisseaux sanguins mais non celui des vaisseaux lymphatiques et par conséquent seulement la dissémination des métastases par voie hématogène. L’expression de la thrombospondine 2 (TSP2), contrairement à celle de la TSP1, est induite dans un modèle de carcinogenèse cutanée au niveau du stroma tumoral [66]. Les souris TSP2^-/- ont un développement tumoral accéléré dans le même modèle tumoral. La TSP2 semble donc participer à un mécanisme de défense antitumoral de l’hôte. Par ailleurs, son expression dans des cellules tumorales A431 entraîne une forte inhibition du développement tumoral in vivo sans altérer la croissance ou la survie in vitro. Cet effet semble être additif, voire synergique, avec la TSP1. Aussi, le relargage continu systémique de TSP2 par des implants de fibroblastes transfectés avec l’ADNc de la TSP2 chez la souris entraîne une inhibition considérable de la croissance tumorale in vivo.

• Angiostatine

L’angiostatine a été découverte et isolée à partir d’urine de souris présentant une tumeur pulmonaire de Lewis [8, 24, 61, 67]. C’est un fragment de la plasmine de 56 kDa représentant quatre boucles Kringle. Son action est principalement endothéliale. Récemment, le rôle des différentes boucles Kringle a été élucidé. Il semble que la boucle IV présente une activité d’auto-inhibition moléculaire. Si des molécules de liaison pour l’angiostatine ont été identifiées, on ne sait pas comment elles interviennent dans la signalisation de l’angiostatine.
L’action inhibitrice de l’angiostatine s’exerce probablement sur le développement des métastases latentes. En effet, l’exérèse de la tumeur primaire de Lewis entraîne le développement de métastases en corrélation étroite avec une chute du taux urinaire en angiostatine.
L’administration d’angiostatine juste après l’exérèse inhibe le développement des métastases. Ces résultats indiquent que l’angiostatine joue un rôle dans le maintien de la latence des métastases.

• Endostatine

L’endostatine est un inhibiteur de l’angiogenèse identifié dans les cellules endothéliales hémangiomateuses [61, 68]. C’est une molécule de 20 kDa correspondant au fragment C-terminal du collagène de type XVIII.
Les souris déficientes en collagène XVIII présentent des anomalies vasculaires importantes, notamment une absence totale de la formation de vaisseaux rétiniens réminescents du syndrome de Knobloch [69]. L’endostatine inhibe fortement l’angiogenèse in vitro et in vivo ainsi que la croissance tumorale. Il a été proposé que le relargage continu d’endostatine in vivo fasse régresser complètement la tumeur primaire vers l’état d’îlot microscopique latent. La validité de cette dernière observation n’est cependant pas acceptée d’une façon générale [70].

• Fragment hémopexine (PEX)

Le PEX est l’extrémité C-terminale de la métalloprotéase MMP2 ; il possède une forte activité anti-angiogénique et antitumorale in vivo [71]. Ce fragment inhibe la fixation de la proMMP2 à l’intégrine αvβ3 et à la MT1-MMP et inhibe ainsi l’activité catalytique de MMP2.
Son effet biologique semble donc résider dans une inhibition de la dégradation de la matrice extracellulaire et une inhibition de la migration cellulaire. Le PEX est une molécule très puissante dans l’inhibition du développement tumoral et notamment celui des glioblastomes [72].

• Facteur plaquettaire 4

Le facteur plaquettaire 4 (PF4) est un polypeptide de 7 kDa qui est produit dans les plaquettes sous forme de complexe tétramérique. Il a été montré qu’il inhibe l’angiogenèse in vitro et in vivo [73, 74]. Par ailleurs, les plaquettes libèrent lors de l’activation un inhibiteur de l’activité du FGF2 qui est identique au PF4.
Il a été proposé que le PF4 exerce son effet par inhibition de la liaison du FGF2 et du VEGF à leurs récepteurs. Le PF4 empêche aussi l’activation des récepteurs aux FGF par inhibition de la liaison et de la dimérisation du récepteur [75].
L’activité inhibitrice est due à une interaction directe entre PF4 et molécule angiogène [75, 76]. Un mécanisme alternatif intracellulaire a été également proposé. Des fragments du PF4 dérivés de la partie C-terminale présentant une activité inhibitrice très puissante dans l’inhibition du développement tumoral ont été également identifiés [77, 78].

Autres acteurs récemment identifiés

• EG-VEGF

L’endocrine gland VEGF (EG-VEGF) a été récemment identifié comme un mitogène spécifique pour les cellules endothéliales des glandes endocrines [79]. Il active un récepteur à 7 domaines transmembranaires couplé aux protéines G et induit la phosphorylation de P42/44 MAP kinases et de Akt/PKB par la PI3 kinase. Par ailleurs, eNOS semble être une cible secondaire de Akt/PKB au cours de cette activation. Ce facteur pourrait contribuer à l’angiogenèse tumorale des tumeurs endocriniennes.

• Molécules identifiées par display de phage (vascular maping tumoral)

Ruoslahti et Pasqualini ont identifié un certain nombre d’étiquettes moléculaires par display de phage in vivo se fixant sur différents types de cellules endothéliales en fonction de leur distribution tissulaire ou de leur état d’activation [80, 81]. Ainsi, une étiquette NGR se fixant sur l’endothélium tumoral de souris a été identifiée. Ce motif lie, au niveau de la cellule endothéliale, une aminopeptidase de surface qui est absente dans l’endothélium non tumoral. Le rôle de cette aminopeptidase dans l’angiogenèse tumorale n’est pas encore élucidé.

• Cornea-derived transcription 6 (CDT6)

Le CDT6, apparenté aux angiopoïétines, est un facteur qui a été identifié après hybridation différencielle dans le stroma de la cornée humaine [82]. Des cellules de mélanome humain transfectées avec le CDT6 présentent une inhibition de la croissance tumorale et de l’angiogenèse et une induction de la production de collagène I et V.

• Endorépelline

L’endorépelline comporte la partie C-terminale du perlecan incluant les trois domaines laminine 1, 2 et 3 de la molécule [83]. Ce fragment possède un effet anti-angiogénique in vitro et in vivo prononcé.
Par ailleurs, des sites de haute affinité au niveau de la cellule endothéliale ont été mis en évidence. Curieusement, l’endorépelline est capable de se lier à l’endostatine et de neutraliser son effet inhibiteur.

• Proliférine

La proliférine est exprimée au cours du développement dans le trophoblaste du placenta, dans la peau et dans des tumeurs de type fibrosarcome [84]. Son expression est corrélée avec la progression tumorale, faible dans les fibromes, forte dans les fibrosarcomes chez les souris transgéniques pour le gène transformant du virus de papillome de type 1. L’inhibition de la proliférine par des anticorps anti-proliférine bloque l’activité angiogénique des cellules tumorales. Ainsi, la proliférine pourra participer au switch angiogénique dans le fibrosarcome.

• RECK

Le RECK est une glycoprotéine de membrane qui inhibe les métalloprotéinases de la matrice (MMP). Des souris RECK^-/- meurent à E10.5 en raison d’un développement vasculaire anormal. RECK surexprimée dans des cellules de fibrosarcome entraîne une réponse angiogénique et une croissance in vivo altérée [85].

Facteurs de régulation de la lymphangiogenèse et leur rôle dans la dissémination métastatique

Depuis la description du développement du système lymphatique par Florence Sabin au début du siècle, on ne savait rien jusqu’à très récemment de sa régulation au niveau moléculaire. Florence Sabin avait clairement montré que le système lymphatique est dérivé du système veineux et que son développement est amorcé par la formation de sacs lymphatiques.
Les travaux de Oliver, Alitalo et Detmar ont permis de jeter les bases pour l’étude moléculaire de la lymphangiogenèse [86, 87]. Oliver a identifié et cloné un gène, le gène Prox, qui est le gène responsable de l’induction du phénotype lymphangiogénique. Des analyses récentes par puce d’ADN de cellules endothéliales microvasculaires transfectées par l’ADN codant pour Prox montrent l’acquisition du phénotype lymphatique. Par ailleurs, le développement des vaisseaux lymphatiques est stimulé par le VEGF-C in vitro et in vivo.
Par exemple, le VEGF-C induit la prolifération et la migration des cellules endothéliales lymphatiques. Son expression dans la peau sous la dépendance du promoteur K14 stimule aussi la formation des vaisseaux lymphatiques cutanés. Pour induire la lymphangiogenèse, le VEGF-C se lie exclusivement au récepteur VEGFR3 (FLT4). Ce récepteur peut aussi être activé par le VEGF-D. Cependant, le VEGF-D est aussi un inducteur non négligeable de l’angiogenèse, ce qui peut être expliqué par sa forte affinité pour le VEGFR2. Le seul autre facteur identifié à ce jour possédant la capacité de stimuler la lymphangiogenèse est le FGF2. Il a été montré que le FGF2 exerçait cet effet d’une manière indirecte par stimulation de l’expression du VEGF-C.
La dissémination tumorale par voie lymphatique est une caractéristique de certaines tumeurs. Le système lymphatique participe-t-il passivement ou activement à la dissémination métastatique  ? Des résultats intéressants ont été publiés récemment appuyant la thèse d’une participation active de la lymphangiogenèse dans ce processus [88]. Par exemple, la souris RipTag, qui développe des insulinomes spontanés, ne montre normalement pas de métastases. Son croisement avec une souris présentant une expression ciblée du VEGF-C sous la dépendance du même promoteur dans le pancréas endocrine montre une lymphangiogenèse tumorale et une dissémination lymphatique de la tumeur.

Paradigme fondamental de la régulation de l’angiogenèse et son rôle dans l’angiogenèse tumorale

Le paradigme fondamental de l’angiogenèse concerne la formation, la maturation et le remodelage vasculaire. Le développement vasculaire normal a besoin de l’action concertée de plusieurs facteurs. Des facteurs comme le VEGF entraînent la prolifération, la migration et la survie des cellules endothéliales qui induisent la formation de vaisseaux désordonnés, non hirarchisés et immatures (facteurs de classe I). D’autres facteurs, comme l’Ang1, activent ensuite le programme de stabilisation et de remodelage vasculaire (facteurs de classe II) dont le PDGF est l’un des principaux effecteurs entraînant le recrutement des péricytes (facteurs de classe III). Le recrutement péricytaire est indispensable pour stabiliser les vaisseaux et les rendre insensibles aux facteurs de prolifération et de survie, mais il ne semble pas requis pour le remodelage et la hiérarchisation de l’arbre vasculaire. Il semble donc que l’action concertée de trois classes de facteurs est requise pour former un arbre vasculaire correctement hiérarchisé.
La vascularisation tumorale est caractérisée par son développement anarchique fait de vaisseaux défectueux, présentant une couverture péricytaire incomplète et une association péricytaire faible au tube vasculaire. On peut donc inférer que les rapports entre les facteurs de classes I, II et III sont perturbés avec une augmentation relative de facteurs de classe I par rapport aux facteurs de classes II et III.
On peut appeler ce modèle le modèle minimal de l’angiogenèse tumorale. L’action des inhibiteurs endogènes de l’angiogenèse se situe principalement au niveau des facteurs de classe I mais, très vraisemblablement, non exclusivement. L’inhibition de facteurs de classe II concomitante à celle des facteurs de classe I pourrait contribuer au maintien d’un arbre vasculaire immature et le rendre sensible à l’inhibition des facteurs de classe I.

Corrélations cliniques et perspectives thérapeutiques

Stratégies anti-angiogéniques versus stratégies de ciblage vasculaire

Comme il a été dit plus haut, un certain nombre de cancers humains sont dépendants de l’angiogenèse et traversent deux phases, une phase préangiogénique latente et une phase angiogénique agressive.
Des corrélations cliniques significatives ont été établies entre le pouvoir invasif et métastasiant d’un certain nombre de cancers, la présence d’une néoangiogenèse intratumorale, la surexpression des ARNm de facteurs angiogéniques comme le VEGF et le FGF2 dans les cellules tumorales et un taux sérique ou urinaire anormalement élevé des molécules correspondantes. Les inhibiteurs de ces facteurs tels que des anticorps spécifiques, des oligonucléotides anti-sens ou encore des molécules pharmacologiques inhibant les voies de signalisation correspondantes, comme les inhibiteurs du VEGFR2, sont très étudiés actuellement (ZD6474 de Astra Zeneca, SU5416 de Sugen, PTK/ZK 222584 de Novartis-Schering) [8, 61] (les différentes possibilités pour inhiber l’angiogenèse sont illustrées dans la figure 4, A). Ces inhibiteurs sont actuellement en étude clinique (phase I-III) et pourraient intervenir avec succès dans des protocoles thérapeutiques en association avec les traitements classiques. De même, des molécules mimant l’activité anti-angiogénique de la TSP1, du PF4 et de l’endostatine pourraient offrir une perspective d’utilisation thérapeutique séduisante.
Un peptidomimétique de la TSP1 activant le récepteur CD36 est actuellement en étude clinique [89]. Par ailleurs, des fragments mutés du PF4 présentent une activité anti-angiogénique significativement augmentée par rapport au fragment sauvage et inhibent très fortement le développement tumoral in vivo chez la souris [78]. Ces fragments pourraient être utilisé pour le développement thérapeutique. Par ailleurs, la chimiothérapie à faible dose par voie orale, comme cela a été montré pour le cyclophosphamide, agit principalement comme un traitement anti-angiogénique et pourrait constituer une nouvelle arme dans l’arsenal thérapeutique [90]. On est en droit de spéculer sur une faible toxicité de ces molécules sur l’arbre vasculaire normal du fait de l’état quiescent des cellules endothéliales de la plupart des tissus de l’adulte.
Une autre approche constitue le ciblage vasculaire de la tumeur (vascular tumor targeting) (figure 4, B). Burrows et Thorpe [91] ont été les premiers à montrer la validité de cette approche. Ils ont couplé un anticorps dirigé contre le complexe majeur d’histocompatibilité de classe II avec la chaîne A de la ricine et montré qu’il se fixait spécifiquement à l’endothélium tumoral et entraînait une régression de la tumeur. Plus récemment, Halin et al. [92] ont obtenu un anticorps monoclonal de très haute affinité (L19) dirigé spécifiquement contre le domaine ED-B de la fibronectine. La fusion de cet anticorps avec l’interleukine 12 augmente considérablement l’effet de l’IL12 seule et diminue considérablement la masse tumorale. L’approche du ciblage de la vascularisation tumorale est très certainement prometteuse.

Thérapie combinée

Une question importante concerne l’utilisation et l’efficacité thérapeutique des inhibiteurs de l’angiogenèse à plus au moins long terme. L’angiostatine, l’endostatine ou le PEX ont été utilisés en « thérapie combinée » à une chimiothérapie à faible dose. Kerbel et al. [90, 93] ont proposé que la chimiothérapie à faible dose cible principalement l’arbre vasculaire tumoral. Ils avaient aussi montré que l’association de vinblastine à faible dose et d’un anticorps neutralisant bloquant l’activité du récepteur VEGF2 avait une efficacité considérable dans l’inhibition tumorale [93]. Utilisant un autre protocole qui associe le PEX avec l’étoposide et le carboplatine, Bello et al. [67] ont obtenu des résultats spectaculaires sur l’inhibition du développement des glioblastomes chez la souris. Par ailleurs, l’association de plusieurs molécules anti-angiogéniques a été également proposée.
L’association de plusieurs molécules anti-angiogéniques pourrait avoir un effet additif, voire synergique, sur l’inhibition de la progression tumorale dans le modèle de souris transgéniques Rip-Tag [94]. Il est donc important de clairement valider une stratégie thérapeutique anti-angiogénique combinée sur le plan clinique afin d’augmenter le bénéfice à long terme pour les malades atteints de cancer.
Finalement, la thérapie anti-angiogénique est également capable de ralentir l’apparition de la récidive tumorale. Le fragment anti-angiogène du PF4 (PF4 CTF) ou le PEX sont capables d’inhiber la récidive des gliomes chez la souris après exérèse chirurgicale [95]. Néanmoins, le traitement, pour être efficace, doit être commencé rapidement après chirurgie. ▼

Références

1. Algire GH, HW Chalkely, FY Legallais, Park H. Vascular reactions of normal and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J Natl Cancer Inst 1945 ; 6 : 73-85.

2. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications N Engl J Med 1971 ; 285 : 1182-6.

3. Folkman J, Merler E, Abernathy C, Williams G. Isolation of a tumor factor responsible or angiogenesis. J Exp Med 1971 ; 133 : 275-88.

4. Shing Y, Folkman J, and Sullivan R, et al. Heparin affinity: purification of a tumor-derived capillary endothelial cell growth factor. Science 1984 ; 223 : 1296-8.

5. Klagsbrun M, Sasse J, Sullivan R, Smith JA. Human tumor cells synthetize an endothelial cell growth factor that is structurally related to basic fibroblast growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ; 83 : 2448-52.

6. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989 ; 246 : 1306-9.

7. Plouet J, Schilling J, Gospodarowicz D. Isolation and characterization of a newly identified endothelial cell mitogen produced by AtT-20 cells. EMBO J 1989 ; 8 : 3801-6.

8. Hagedorn M, Bikfalvi A. Target molecules for anti-angiogenic therapy: from basic research to clinical trials. Crit Rev Oncol Hematol 2000 ; 34 : 89-110.

9. Lyden D, Hattori K, Dias S, et al. Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and haematopoietic precursor cells blocks tumour angiogenesis and growth. Nature Med 2001 ; 7 : 1194-201.

10. Bikfalvi A, Bicknell R. Recent advances in angiogenesis, anti-angiogenesis and vascular targeting. Trends Pharmacol Sci 2002 ; 23 : 576-82.

11. Javerzat S, Auguste P, Bikfalvi A. The role of fibroblast growth factors in vascular development. Trends Mol Med 2002 ; 8 : 483-9.

12. Christofori G, Hanahan D. Molecular dissection of multi-stage tumorigenesis in transgenic mice. Semin Cancer Biol 1994 ; 5 : 3-12.

13. Inoue, M, Hager JH, Ferrara N, et al. VEGF-A has a critical, non-redundant role in angiogenic switching and pancreatic cell carcinogenesis. Cancer Cell 2002 ; 193-202.

14. Bergers G, Brekken R, McMahon G, et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nature Cell Biol 2000 ; 2 : 737-44.

15. Rak J, Kerbel RS. Ras regulation of vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Methods Enzymol 2001 ; 333 : 267-83.

16. Dameron KM, Volpert OV, Tainsky MA, Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994 ; 265 : 1582-4.

17. Zhang L, Yu D, Hu M, et al. Wild-type p53 suppresses angiogenesis in human leiomyosarcoma and synovial sarcoma by transcriptional suppression of vascular endothelial growth factor expression. Cancer Res 2000 ; 60 : 3655-61.

18. Yu JL, Rak JW, Coomber BL, et al. Effect of p53 status on tumor response to antiangiogenic therapy. Science 2002 ; 295 : 1526-8.

19. O’Reilly MS, L Holmgren, Chen C, Folkman J. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Med 1996 ; 2 : 689-92.

20. Harris AL. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth. Nature Rev Cancer 2002 ; 2 : 38-47.

21. Elvert G, Kappel A, Heidenreich R, et al. Cooperative interaction of hypoxia inducible factor (HIF)-2a and Ets-1 in the transcriptional activation of vascular endothelial growth factor receptor-2 (Flk-1). J Biol Chem 2002 (in press).

22. Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nature Rev Cancer 2002 ; 2 : 795-803.

23. Jussila L, Alitalo K. Vascular growth factors and lymphangiogenesis. Physiol Rev 2002 ; 82 : 673-700.

24. Shibuya M. Structure and function of VEGF/VEGF-receptor system involved in angiogenesis. Cell Struct Funct 2001 ; 26 : 25-35.

25. Cross MJ, Claesson-Welsh L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends Pharmacol Sci 2001 ; 22 : 201-7.

26. Rafii S, Meeus S, Dias S, et al. Contribution of marrow-derived progenitors to vascular and cardiac regeneration. Semin Cell Dev Biol 2002 ; 13 : 61-7.

27. Miao HQ, Klagsbrun M. Neuropilin is a mediator of angiogenesis. Cancer Metastasis Rev 2000 ; 19 : 29-37.

28. Straume, O, Akslen LA. Importance of vascular phenotype by basic fibroblast growth factor, and influence of the angiogenic factors basic fibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor-1 and ephrin-A1/EphA2 on melanoma progression. Am J Pathol 2002 ; 160 : 1009-19.

29. Freeman MR, Schneck FX, Gagnon ML, et al. Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor: a potential role for T cells in angiogenesis. Cancer Res 1995 ; 55 : 4140-5.

30. Millauer B, LK Shawver, Plate KH, et al. Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. Nature 1994 ; 367 : 576-9.

31. Hiratsuka S, Maru Y, Okada A, Seiki M, et al. Involvement of Flt-1 tyrosine kinase (vascular endothelial growth factor receptor-1) in pathological angiogenesis. Cancer Res 2001 ; 61 : 1207-13.

32. Holash J, Davis S, Papadopoulos N, et al. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proc Natl Acad Sci USA 2002 ; 99 : 11393-8.

33. Kim ES, Serur A, Huang J, et al. Potent VEGF blockade causes regression of coopted vessels in a model of neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci USA 2002 ; 99 : 11399-404.

34. Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome Biol 2001 ; 2.

35. Bikfalvi A, Klein S, Pintucci G, Rifkin DB. Biological roles of fibroblast growth factor-2. Endocr Rev 1997 ; 18 : 26-45.

36. Friesel R, Maciag T. Fibroblast growth factor prototype release and fibroblast growth factor receptor signaling. Thromb Haemost 1999 ; 82 : 748-54.

37. Goldfarb M. Signaling by fibroblast growth factors: the inside story. Sci STKE 2001 ; 106 : PE37.

38. Matsumoto T, Turesson I, Book M, et al. p38 MAP kinase negatively regulates endothelial cell survival, proliferation, and differentiation in FGF-2-stimulated angiogenesis. J Cell Biol 2002 ; 156 : 149-60.

39. Horowitz A, Tkachenko E, Simons M, et al. Fibroblast growth factor-specific modulation of cellular response by syndecan-4. J Cell Biol 2002 ; 157 : 715-25.

40. Wang Y, Becker D. Antisense targeting of basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor-1 in human melanomas blocks intratumoral angiogenesis and tumor growth. Nature Med 1997 ; 3 : 887-93.

41. Compagni, A. Wilgenbus P, Impagnatiello MA, Cotten M, Christofori G. Fibroblast growth factors are required for efficient tumor angiogenesis. Cancer Res 2000 ; 60 : 7163-69.

42. Rofstad EK, Halsor EF. Vascular endothelial growth factor, interleukin 8, platelet-derived endothelial cell growth factor, and basic fibroblast growth factor promote angiogenesis and metastasis in human melanoma xenografts. Cancer Res 2000 ; 60, 4932-8.

43. Tassi E, Al-Attar A, Aigner A, et al. Enhancement of fibroblast growth factor (FGF) activity by an FGF-binding protein. J Biol Chem 2001 ; 276 : 40247-402.

44. Auguste P, Gursel DB, Lemiere S, et al. Inhibition of fibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor activity in glioma cells impedes tumor growth by both angiogenesis-dependent and -independent mechanisms. Cancer Res 2001 ; 61 : 1717-26.

45. Deroanne CF, Hajitou A, Calberg-Bacq CM, et al. Angiogenesis by fibroblast growth factor 4 is mediated through an autocrine up-regulation of vascular endothelial growth factor expression. Cancer Res 1997 ; 57 : 5590-7.

46. Davis S, Yancopoulos GD. The angiopoietins: Yin and Yang in angiogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 1999 ; 237 : 173-85.

47. Koblizek TI, Weiss C, Yancopoulos GD, et al. Angiopoietin-1 induces sprouting angiogenesis in vitro. Curr Biol 1998 ; 8 : 529-32.

48. Thurston G. Complementary actions of VEGF and angiopoietin-1 on blood vessel growth and leakage. J Anat 2002 ; 200 : 575-80.

49. Uemura A, Ogawa M, Hirashima M, et al. Recombinant angiopoietin-1 restores higher-order architecture of growing blood vessels in mice in the absence of mural cells. J Clin Invest 2002 ; 110 : 1619-28.

50. Hawighorst T, Skobe M, Streit M, et al. Activation of the tie2 receptor by angiopoietin-1 enhances tumor vessel maturation and impairs squamous cell carcinoma growth. Am J Pathol 2002 ; 160 : 1381-92.

51. Tanaka F, Ishikawa S, Yanagihara K, et al. Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2002 ; 62 : 7124-9.

52. Rich JN. The role of transforming growth factor-β in primary brain tumors. Front Biosci 2003 ; 8 : E245-60.

53. Tuxhorn JA, McAlhany SJ, Yang F, et al. Inhibition of transforming growth factor-beta activity decreases angiogenesis in a human prostate cancer-reactive stroma xenograft model. Cancer Res 2002 ; 62 : 6021-5.

54. Lawson, ND, Scheer N, Pham VN, et al. Notch signaling is required for arterial-venous differentiation during embryonic vascular development. Development 2001 ; 128 : 3675-83.

55. Uyttendaele, H, Ho J, Rossant J, Kitajewski J. Vascular patterning defects associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 5643-8.

56. Mailhos, C, Modlich U, Lewis J, et al. Delta4, an endothelial specific notch ligand expressed at sites of physiological and tumor angiogenesis. Differentiation 2001 ; 69 : 135-44.

57. Pola, R, Ling LE, Silver M, et al. The morphogen Sonic hedgehog is an indirect angiogenic agent upregulating two families of angiogenic growth factors. Nat Med 2001 ; 7 : 706-11.

58. Adams RH, Klein R. Eph receptors and ephrin ligands. essential mediators of vascular development. Trends Cardiovasc Med 2000 ; 10 : 183-8.

59. Bachelder RE, et al. Vascular endothelial growth factor is an autocrine survival factor for neuropilin-expressing breast carcinoma cells. Cancer Res 2001 ; 61 : 5736-40.

60. Brantley DM, Cheng N, Thompson EJ, et al. Soluble Eph A receptors inhibit tumor angiogenesis and progression in vivo. Oncogene 2002 ; 21 : 7011-26.

61. Kerbel R, Folkman J. Clinical translation of angiogenesis inhibitors. Nature Rev Cancer 2002 ; 2 : 727-39.

62. Lawler J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell Mol Med 2002 ; 6 : 1-12.

63. Streit M, Velasco P, Brown LF, et al. Overexpression of thrombospondin-1 decreases angiogenesis and inhibits the growth of human cutaneous squamous cell carcinomas. Am J Pathol 1999 ; 155 : 441.

64. Volpert OV, Pili R, Sikder HA, et al. Id1 regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin-1. Cancer Cell 2002 ; 2 : 473-83.

65. Rodriguez-Manzaneque JC, Lane TF, Ortega MA, et al. Thrombospondin-1 suppresses spontaneous tumor growth and inhibits activation of matrix metalloproteinase-9 and mobilization of vascular endothelial growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 12485-90.

66. Hawighorst T, Velasco P, Streit M, et al. Thrombospondin-2 plays a protective role in multistep carcinogenesis: a novel host anti-tumor defense mechanism. EMBO J 2001 ; 20 : 2631-40.

67. Bello L, Carrabba G, Giussani C, et al. A low-dose chemotherapy combined with an antiangiogenic drug reduces human glioma growth in vivo. Cancer Res 2001 ; 61 : 7501-6.

68. O’Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997 ; 88 : 277-85.

69. Fukai N, Eklund L, Marneros AG, et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. EMBO J 2002 ; 21 : 1535-44.

70. Marshall E. Setbacks for endostatin. Science 2002 ; 295 : 2198-9.

71. PC Brooks, S Silletti, von Schalscha TL, et al. Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Cell 1998 ; 92 : 391-400.

72. Bello L, Lucini V, Carrabba G, et al. Simultaneous inhibition of glioma angiogenesis, cell proliferation, and invasion by a naturally occurring fragment of human metalloproteinase-2. Cancer Res 2001 ; 61 : 8730-6.

73. Maione TE, Gray GS, Petro J, et al. Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet factor-4 and related peptides. Science 1990 ; 247 : 77-9.

74. Tanaka T, Manome Y, Wen P, Kufe D, Fine HA. Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor-4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth. Nature Med 1997 ; 3 : 437-42.

75. Perollet C, Han ZC, Savona C, Caen JP, Bikfalvi A. Platelet factor 4 modulates fibroblast growth factor 2 (FGF-2) activity and inhibits FGF-2 dimerization. Blood 1998 ; 91 : 3289-96.

76. Lozano RM, Redondo-Horcajo M, Jimenez MA, et al. Solution structure and interaction with basic and acidic fibroblast growth factor of a 3-kDa human platelet factor-4 fragment with antiangiogenic activity. J Biol Chem 2001 ; 276 : 35723-34.

77. Hagedorn M, Zilberberg L, Lozano RM, et al. A short peptide domain of platelet factor 4 blocks angiogenic key events induced by FGF-2. FASEB J 2001 ; 15 : 550-2.

78. Hagedorn M, Zilberberg L, Wilting J, et al. Domain swapping in a COOH-terminal fragment of platelet factor-4 generates potent angiogenesis inhibitors. Cancer Res 2002 ; 62 : 6884-90.

79. LeCouter J, Ferrara N. EG-VEGF and the concept of tissue-specific angiogenic growth factors. Semin Cell Dev Biol 2002 ; 13 : 3-8.

80. Ruoslahti, E. Specialization of tumour vasculature. Nature Cancer Rev 2002 ; 2 : 83-90.

81. Pasqualini R, Arap W, McDonald DM. Probing the structural and molecular diversity of tumor vasculature. Trends Mol Med 2002 ; 8 : 563-71.

82. Peek R, Kammerer RA, Frank S, Otte-Holler I, Westphal JR. The angiopoietin-like factor cornea-derived transcript 6 is a putative morphogen for human cornea. J Biol Chem 2002 ; 277 : 686-93.

83. Mongiat M, Sweeney S, San Antonio JD, Fu J, Iozzo RV. Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the carboxyl terminus of perlecan. J Biol Chem 2002.

84. Toft DJ, Rosenberg SB, Bergers G, Volpert O, Linzer DI. Reactivation of proliferin gene expression is associated with increased angiogenesis in a cell culture model of fibrosarcoma tumor progression. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 13055-9.

85. Oh J, Takahashi R, Kondo S, et al. The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis. Cell 2001 ; 107 : 789-800.

86. Oliver G, Detmar M. The rediscovery of the lymphatic system: old and new insights into the development and biological function of the lymphatic vasculature. Genes Dev 2002 ; 16 : 773-83.

87. Alitalo K, Carmeliet P. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health and disease. Cancer Cell 2002 ; 1 : 219-27.

88. Stacker SA, Achen MG, Jussila L, Baldwin ME, Alitalo K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nature Rev Cancer 2002 ; 2 : 573-83.

89. Reiher FK, Volpert OV, Jimenez B, et al. Inhibition of tumor growth by systemic treatment with thrombospondin-1 peptide mimetics. Int J Cancer 2002 ; 98 : 682-9.

90. Man S, Bocci G, Francia G, Green SK, Jothy S, Hanahan D, et al. Antitumor effects in mice of low-dose (metronomic) cyclophosphamide administered continuously through the drinking water. Cancer Res 2002 ; 62 : 2731-5.

91. Burrows, FJ, Thorpe PE. Eradication of large solid tumours in mice with an immunotoxin directed against tumour vasculature. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : 8996-9000.

92. Halin C, Rondini S, Nilsson F, et al. Enhancement of the antitumor activity of interleukin-12 by targeted delivery to neovasculature. Nat Biotechnol 2002 ; 20 : 264-9.

93. Klement G, Baruchel S, Rak J, et al. Continuous low-dose therapy with vinblastine and VEGF receptor-2 antibody induces sustained tumor regression without overt toxicity. J Clin Invest 2000 ; 105 : R15-24.

94. Bergers G, Javaherian K, Lo KM, et al. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science 1999 ; 284 : 808-12.

95. Bello L, Giussani C, Carrabba G, et al. Suppression of malignant glioma recurrence in a newly developed animal model by endogenous inhibitors. Clin Cancer Res 2002 ; 8 : 3539-48.