Growth factors and treatment of diabetic foot ulcers

ARTICLE

L'évolution chronique des ulcérations du pied chez le diabétique, leur récidive fréquente, leur pronostic réservé lié avant tout au taux élevé d'amputation [1] ont stimulé la recherche de modalités thérapeutiques innovantes dans le domaine de la cicatrisation. Parmi celles-ci, l'administration de facteurs de croissance grâce aux progrès de la biotechnologie et de la bio-ingénierie constitue une approche originale intéressante. Dix ans après la publication dans ce journal de l'article de P. Dang [2] qui posait la question de l'utilisation thérapeutique des facteurs de croissance, il nous a paru intéressant de faire le point sur ce sujet, à la lumière des résultats des essais cliniques. Auparavant, un rappel bref sur les principaux facteurs de croissance impliqués dans la cicatrisation cutanée sera donné, en insistant plus particulièrement sur ceux ayant fait l'objet d'une application thérapeutique en diabétologie.

Les facteurs de croissance

Sont regroupés sous ce terme un grand nombre de polypeptides impliqués non seulement dans les phénomènes de la croissance cellulaire mais aussi dans d'autres processus physiologiques importants et notamment dans la cicatrisation, dont ils coordonnent les différentes étapes par des interrelations complexes et ce, à des concentrations très faibles, de l'ordre du picogramme du moins in vitro. La dénomination des facteurs de croissance prête à confusion car selon les cas, elle fait appel à l'origine cellulaire du facteur (PDGF), à son action (TGF), aux cellules cibles sur lesquelles il agit (FGF) voire à sa structure (IGF) ; d'autre part, la multiplicité des actions des facteurs de croissance, leur fréquente coopération, la synthèse d'un même facteur de croissance par plusieurs types cellulaires, la dissociation souvent observée entre l'action in vitro (que décrit le nom de certains facteurs de croissance) et in vivo, rendent ces dénominations encore plus confuses [3].

Synthétisés et sécrétés par un grand nombre de cellules différentes, les facteurs de croissance peuvent agir à distance (voie endocrine) ou à proximité (figure 1) [4]. Leur effet cellulaire passe par leur liaison à des récepteurs membranaires spécifiques sur les cellules cibles y induisant la phosphorylation de protéines (en particulier sur des résidus de tyrosine), soit directement (le récepteur du facteur de croissance est alors une protéine kinase), soit indirectement par l'intermédiaire de seconds messagers : il s'ensuit des activations en cascade dans le cytoplasme et le noyau qui aboutissent in fine à une augmentation de la synthèse protéique, une modification de l'activité et/ou une prolifération des cellules. Dans la cicatrisation, trois grandes fonctions peuvent être reconnues aux facteurs de croissance : un rôle mitogène, un pouvoir de chémo-attraction et l'induction d'un nouveau phénotype dans les cellules cibles. On distingue parmi les mitogènes les facteurs de compétence, qui font passer les cellules du stade quiescent (G0) au stade actif de réplication de l'ADN (G1) et les facteurs de progression qui permettent à la cellule de passer au stade G2 de la mitose ; la chémo-attraction fait appel avant tout à la chimiotaxie, où un contingent cellulaire se déplace en fonction du gradient de concentration de la substance. Les facteurs de croissance sont dégradés sous l'action de protéases locales, métallo-protéases (MMP) et élastases d'origine leucocytaire ; l'action de ces protéases est contre-balancée par les inhibiteurs tissulaires des métallo-protéases (TIMP) [5].

Physiologie de la cicatrisation

La cicatrisation cutanée est un phénomène dynamique, complexe et plusieurs revues récentes en ont détaillé les différents stades [6-8].

La phase inflammatoire fait suite à l'hémostase dans laquelle les plaquettes jouent un rôle capital avec formation d'un caillot de fibrine qui, en plus de son rôle hémostatique, sert de matrice extra-cellulaire provisoire facilitant la migration des cellules impliquées dans la cicatrisation. Au cours de la coagulation, de nombreuses substances vaso-actives et chémotactiques sont libérées, recrutant les cellules inflammatoires, d'abord neutrophiles puis monocytes secondairement activés en macrophages au contact de la plaie ; ces cellules contribuent à la détersion de la plaie par phagocytose des micro-organismes, des débris tissulaires et des corps étrangers. Les macrophages ont de plus un rôle fondamental par la sécrétion de facteurs de croissance, amplifiant ainsi les signaux précoces de la cicatrisation libérés lors de la dégranulation plaquettaire.

La phase de reconstruction se caractérise par plusieurs phénomènes : l'épithélialisation, la fibroplasie et l'angiogenèse. L'épithélialisation débute rapidement : les kératinocytes en bordure de la plaie subissent de profondes transformations phénotypiques, leur permettant de migrer dans la plaie, au travers de la matrice extra-cellulaire, grâce à la production de collagénase et selon un phénomène d'épibolie (« saute-mouton »). Une fois que la plaie est recouverte par une mono-couche de cellules épidermiques, la migration cesse, la prolifération et la différenciation commencent : les kératinocytes retrouvent progressivement leur phénotype, se stratifient et la membrane basale se reforme, à laquelle les cellules épidermiques s'attachent fermement.

Parallèlement, dans le derme lésé, se produisent fibroplasie et angiogenèse, aboutissant au tissu de granulation ; les macrophages, fibroblastes et cellules endothéliales migrent simultanément dans la plaie, en une unité fonctionnelle (wound module) : les macrophages libèrent des facteurs attirant et activant les cellules endothéliales et les fibroblastes ; les fibroblastes peuvent ainsi élaborer la matrice extra-cellulaire nécessaire à la migration et à la croissance des macrophages, des cellules endothéliales et des fibroblastes ; les cellules endothéliales forment des néovaisseaux apportant oxygène et nutriments indispensables au fonctionnement cellulaire. La migration et la colonisation de la plaie par les fibroblastes sont essentielles pour la production des composants extra-cellulaires du tissu de granulation, initialement riche en fibronectine puis en collagène, d'abord de type III puis de type I. Une fois que la matrice extra-cellulaire est suffisamment riche en collagène, les fibroblastes diminuent leur activité de synthèse et subissent une apoptose, si bien que la cellularité du tissu de granulation se raréfie. L'angiogenèse se produit en même temps que la fibroplasie. Issues de petites veinules encore fonctionnelles et proches de la plaie, les cellules endothéliales migrent vers la matrice extra-cellulaire, bourgeonnent et prolifèrent, formant ainsi des anses capillaires qui se canalisent, permettant l'établissement du flux sanguin et s'organisent en réseaux, parallèlement à la raréfaction cellulaire du tissu de granulation.

La dernière phase de la cicatrisation est le remodelage : s'il commence en même temps que la formation du tissu de granulation, il se poursuit pendant plusieurs mois voire plusieurs années après l'involution du tissu de granulation. Celui-ci se modifie et la matrice extra-cellulaire s'appauvrit en fibronectine et acide hyaluronique au profit du collagène, des protéoglycanes et des fibres élastiques. Le collagène de type I, fait de longues fibrilles qui gagnent en épaisseur et s'orientent selon les forces de tension s'exerçant sur la plaie, devient le plus abondant. Parallèlement, la plaie se contracte sous l'effet des myofibroblastes, fibrocytes ayant acquis des propriétés contractiles. Ces modifications aboutissent à une augmentation de la résistance à l'étirement et de la résilience de la plaie, bien que cette résistance dans les meilleurs des cas n'atteigne que 70 à 80 % de sa valeur normale.

Au total, la cicatrisation procède de phénomènes cellulaires et extra-cellulaires complexes, organisés et régulés, se télescopant dans le temps et l'espace, nécessitant la coopération de plusieurs types cellulaires (macrophages, fibroblastes, kératinocytes, cellules endothéliales) : ces interactions nécessitent un système de messagerie dans lequel les facteurs de croissance jouent un rôle clé.

Facteurs de croissance et cicatrisation

Parmi les nombreux facteurs de croissance identifiés jusqu'à maintenant, le PDGF, le FGF, les TGF-alpha et -beta, ainsi que l'EGF jouent le rôle le plus important dans la réparation cutanée (tableau).

Le platelet-derived growth factor (PDGF)

Structure et récepteurs [6, 9, 10]

Il s'agit en fait de trois isoformes glycoprotéiques, chacune constituée d'un dimère dont les deux chaînes polypeptidiques sont reliées par deux ponts disulfures. La combinaison entre les deux chaînes A et B donne naissance à deux homodimères, le PDGF-AA et -BB et à un hétérodimère, le PDGF-AB qui serait le plus abondant dans l'organisme. Les chaînes A et B ont un contenu en acides aminés homologue à 60 % et sont synthétisées sous forme de précurseurs qui se dimérisent semble-t-il au hasard. Après clivage protéolytique, le PDGF biologiquement actif (PM ± 24 kDa) est libéré. Les différentes isoformes ont des effets qui se recoupent mais qui peuvent parfois différer, de par leur affinité de liaison variable avec deux récepteurs différents, alpha et beta. Ces récepteurs se regroupent sur la membrane cellulaire et se dimérisent lors de la liaison au PDGF pour former trois complexes alphaalpha, betabeta et alphabeta. Comme le récepteur alpha lie aussi bien la chaîne A que la chaîne B alors que le récepteur beta ne lie que la chaîne B (figure 2), l'effet dépend du type de récepteurs (beta est cinq fois plus abondant qu'alpha) et de l'isoforme du PDGF en présence.

Origine

Le PDGF est présent en grande quantité dans les plaquettes (granules alpha) où l'isoforme AB représente 63 % du PDGF total [9]. Il est également sécrété par les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses des vaisseaux lésés, les fibroblastes et les kératinocytes [4, 6, 10].

Rôle [6, 7]

Il s'exerce avant tout sur les fibroblastes qui répondraient plus au PDGF-BB qu'aux deux autres isoformes. Associé au TGF-beta2 et aux molécules de la matrice extra-cellulaire, le PDGF stimule la prolifération des fibroblastes péri-lésionnels, l'expression de récepteurs membranaires de type intégrine appropriés et ainsi la migration dans le lit de la plaie. Il participe à l'élaboration de la matrice extra-cellulaire, en stimulant la formation de fibronectine et d'acide hyaluronique par les fibroblastes : cet effet est cependant moins marqué que celui induit par le TGF-alpha. Le PDGF (et le TGF-beta) stimulerait aussi la production des MMP par les fibroblastes, facilitant leur migration au travers de la matrice extra-cellulaire.

Le PDGF exerce également un chimiotactisme positif sur les macrophages qu'il active pour sécréter d'autres facteurs de croissance. Son action de recrutement s'exerce aussi sur les cellules musculaires lisses des vaisseaux lésés et les neutrophiles mais non sur les cellules épithéliales dépourvues de récepteurs au PDGF. L'activité angiogénique du PDGF est faible et peut être indirecte par l'induction de la sécrétion de facteurs angiogéniques par les fibroblastes. Le PDGF enfin a un rôle important dans le remodelage : il constituerait le signal initiant la contraction de la plaie.

Le VEGF (vascular endothelial growth factor), homodimère de PM ± 45 kDa, a une structure voisine du PDGF, partageant une homologie d'environ 24 % avec la chaîne B. Il a comme caractéristique de se lier à l'héparine. Produit et sécrété par les macrophages et les kératinocytes, peut-être sous l'action d'autres facteurs de croissance (KGF et TGF-alpha) [12], il agit spécifiquement sur les cellules endothéliales, étant à ce titre un puissant facteur angiogénique [8, 9, 11].

Le fibroblast growth factor (FGF)

Structure et récepteurs [6, 9]

Plusieurs facteurs de croissance sont regroupés sous cette dénomination, constituant la « famille FGF » : on dénombre au moins neuf polypeptides présentant de fortes homologies structurales, présents dans un grand nombre de cellules et de tissus, numérotés de 1 à 9 (FGF-1 à FGF-9). Parmi ceux-ci, les mieux étudiés et les plus impliqués dans la cicatrisation sont le FGF-1 ou FGF acide (aFGF), le FGF-2 ou FGF basique (bFGF) et le FGF-7 ou keratinocyte growth factor (KGF).

Les FGF-1 et -2 sont des polypeptides monocaténaires de 154 acides aminés (PM ± 18 kDa) ayant 55 % de leur séquence peptidique identique ; la différence porte essentiellement sur le nombre de résidus cystéine et sur leur point isoélectrique, d'où leur appellation de facteur acide et basique.

Une de leurs caractéristiques est de ne pas porter de peptide signal qui permettrait leur sécrétion, si bien que leur libération dans l'environnement de la plaie, bien qu'attestée par leur présence dans la matrice extra-cellulaire, reste problématique. Une deuxième caractéristique est leur capacité à se lier à des molécules héparinoïdes, notamment aux protéoglycanes de la surface cellulaire et de la matrice extra-cellulaire. Cette dernière liaison forme un complexe stable, considéré comme une forme de stockage et de protection de ces facteurs de croissance d'où ils seraient libérés « à la demande » sous l'action combinée d'héparinases et de protéases.

Le FGF-7 (KGF), constitué d'une chaîne de 194 acides aminés (PM ± 22 kDa), possède, lui, un peptide signal. Comme FGF-1 et -2, il se lie à l'héparine.

Les récepteurs aux FGF forment également une famille d'au moins quatre membres à activité tyrosine kinase (FGFR1 à FGFR4), de structure similaire. Cependant, de très nombreux variants d'épissage existent, ce qui multiplie le nombre des formes possibles de ce récepteur. Les récepteurs et leur variants ont des spécificités différentes : ils peuvent tous lier FGF-1, mais leur capacité à lier FGF-2 est variable. FGF-7 se lie préférentiellement à un variant de FGFR2 (type IIIb).

Origine [9, 11]

De nombreuses cellules synthétisent FGF-1 et -2 : macrophages et cellules endothéliales semblent en être la source principale durant la cicatrisation.

Le FGF-7 est en revanche produit essentiellement par les fibroblastes.

Rôle [4, 6, 9, 11]

Ce sont les fonctions de FGF-2 qui ont été les plus étudiées mais il est vraisemblable que celles de FGF-1 sont identiques. Il s'agit avant tout d'agents angiogéniques stimulant la prolifération et la migration des cellules endothéliales selon un mécanisme en partie autocrine. Ils activent également la multiplication des fibroblastes et favorisent leur migration ainsi que celle des kératinocytes.

L'action du FGF-7 est spécifique des kératinocytes dont il stimule non seulement la prolifération mais aussi la migration par un mécanisme probablement paracrine. Le FGF-7 apparaît donc comme un modulateur important de la ré-épithélialisation de la plaie.

Le transforming growth factor beta (TGF-beta)

Structure et récepteurs [4, 6, 9]

Le même terme regroupe trois isoformes beta1, beta2 et beta3, dont les structures chimiques sont très voisines de même que leur activité biologique. L'isoforme beta1, la plus abondante et la mieux connue, est un homodimère (PM ± 25 kDa) dont chaque unité est reliée à l'autre par un pont disulfure. Le TGF-beta est en fait libéré sous une forme incapable de se lier à ses récepteurs car complexé à une protéine : c'est le TGF-beta « latent » dont il existe deux formes. Ces complexes peuvent être stockés dans la matrice extra-cellulaire ou activés par protéolyse : la mise en réserve extra-cellulaire du TGF-beta constituerait un réservoir facilement disponible après activation pour la cicatrisation.

Contrairement à la plupart des autres facteurs de croissance, le récepteur du TGF-beta n'est pas doué d'une activité tyrosine kinase mais il contient vraisemblablement un site cytoplasmique sérine-thréonine kinase. Il existerait en fait plusieurs types de récepteurs du TGF-beta (I à III) dont le rôle est mal élucidé.

Origine [6, 12]

Le TGF-beta est sécrété par un très grand nombre de cellules impliquées dans la cicatrisation : fibroblastes, macrophages, cellules endothéliales et musculaires lisses, plaquettes (granules alpha) : dans ces dernières, seul le TGF-beta-1 est exprimé.

Rôle [6, 7, 11, 12]

Il est en général admis que le TGF-beta est le facteur de croissance dont l'activité est la plus étendue dans le domaine de la cicatrisation, d'où le nom de « panréguline » qui lui est parfois donné, agissant soit directement soit indirectement, en modulant l'action ou la production d'autres facteurs de croissance, comme le PDGF ou le FGF. C'est le plus puissant agent chimiotactique connu, agissant sur les macrophages, les neutrophiles et les fibroblastes. Son action sur la néovascularisation semble moins marqué. Son effet sur la matrice extra-cellulaire est en revanche fondamental : il active la transcription d'un grand nombre de protéines matricielles dans les fibroblastes ainsi que l'expression des MMP et des TIMP. Il module aussi l'expression des intégrines, si bien que l'adhésion des cellules à la matrice extra-cellulaire est augmentée. Le TGF-beta intervient donc non seulement dans l'élaboration mais aussi dans le remodelage de la matrice extra-cellulaire. Au cours de l'épidermisation, le TGF-beta stimulerait l'expression de certaines sous-unités intégrines, facilitant la migration des kératinocytes. Le TGF-beta aurait enfin une action importante dans la contraction de la plaie, peut-être en favorisant la conversion des fibrocytes en myofibroblastes.

L'epidermal growth factor (EGF) et facteurs apparentés

Structure et récepteurs [4, 6, 9]

Depuis la découverte de l'EGF, plusieurs molécules de structure proche et se liant au même récepteur ont été identifiées, notamment TGF-alpha (transforming growth factor-alpha) et HB-EGF (heparin-binding EGF). L'EGF est un polypeptide monocaténaire de 53 acides aminés (PM ± 6 kDa) agencés selon trois boucles reliées par un pont disulfure : cette conformation particulière aux membres de la « famille EGF », est indispensable à l'activité biologique. La séquence de 50 amino-acides du TGF-alpha (PM ± 5,6 kDa) a une homologie de 30 % avec celle de l'EGF. L'HB-EGF a un PM plus important (± 22 kDa).

Le récepteur (EGF-R) est une glycoprotéine transmembranaire à activité tyrosine kinase. La liaison avec l'EGF induit un changement conformationnel des récepteurs avec dimérisation de ceux-ci et stimulation de l'activité tyrosine kinase.

Origine [8, 11]

L'EGF est avant tout localisé dans les plaquettes (granules alpha), l'HB-EGF dans les macrophages et le TGF-alpha dans les macrophages et kératinocytes.

Rôle [6, 11]

Ces trois facteurs de croissance jouent un rôle clé sur les cellules épidermiques, induisant la migration, la division et la différenciation des kératinocytes, aboutissant à la ré-épithélialisation avec rétablissement d'une barrière épidermique imperméable. L'effet sur la fibroplasie et l'angiogenèse reste minime.

Au total, les facteurs de croissance apparaissent comme des facteurs critiques de la cicatrisation cutanée physiologique, orchestrant toutes les phases de ce processus, d'une façon concertée. Il est ainsi concevable qu'une anomalie quantitative et/ou qualitative de ces facteurs de croissance ou qu'une diminution de la réponse des cellules cibles puissent entraver profondément la réparation cutanée après une blessure.

Plaies du pied chez le diabétique et facteurs de croissance

Les plaies du diabétique sont longues à cicatriser et récidivent fréquemment. Le pied est une cible « privilégiée », du fait de son atteinte préférentielle par la neuropathie sensitivo-motrice (expliquant le peu de perception des microtraumatismes locaux), de la distalité des lésions d'artériopathie et de la susceptibilité particulière aux infections liée à l'hyperglycémie chronique et à l'anatomie particulière du pied [13]. Ainsi, moins d'un tiers des ulcérations neuropathiques du pied sont cicatrisées au bout de 20 semaines, malgré des soins locaux optimisés [14]. Plusieurs facteurs peuvent expliquer la chronicité de ces ulcères : le déficit d'apport artériel, l'infection extrêmement fréquente sur ce terrain, enfin et surtout la persistance des microtraumatismes locaux ; c'est souligner l'importance dans la prise en charge de ces plaies du rétablissement d'un apport vasculaire satisfaisant, d'un contrôle rigoureux de la glycémie, d'une lutte active contre l'infection et de la décharge de la zone lésée de toute pression [15]. Néanmoins, on peut se demander si la chronicité de ces ulcérations ne s'expliquerait pas non plus par des déficits intrinsèques de la cicatrisation et notamment des facteurs de croissance. Force est de reconnaître que les arguments en faveur de cette hypothèse restent grandement spéculatifs, du moins chez l'homme.

Certaines données expérimentales chez les animaux diabétiques ont étayé l'existence d'anomalies des facteurs de croissance. Ainsi, chez la souris génétiquement diabétique db/db, l'augmentation de FGF-7 (KGF) par plaie expérimentale est beaucoup plus faible que celle observée chez l'animal non diabétique ; de même, en réaction à une plaie, l'expression cutanée de FGF-1 est diminuée à l'état basal et augmente peu ; enfin, la cinétique d'apparition de FGF-1 et -2 est également anormale [11]. Chez les rats diabétiques, le taux de PDGF 5 jours après la création d'une plaie est significativement inférieur à celui chez les rats non diabétiques mais ne diminue pas par la suite [16]. D'autre part, plusieurs auteurs ont rapporté une amélioration voire une normalisation de la cicatrisation des plaies chez les animaux diabétiques après application locale de facteurs de croissance, FGF-1 et -2, PDGF et TGF-alpha [6, 17, 18].

Chez l'homme, les données sont rares et parfois contradictoires (figure 3). Shaw a montré sur des biopsies cutanées que le taux de TGF-beta1 était diminué chez le diabétique aussi bien au niveau de l'ulcération qu'en peau saine, par rapport aux plaies non diabétiques (ulcères veineux ou ischémiques) ou en peau saine de témoins non diabétiques ; en outre, la concentration des TGF-beta ou de leurs récepteurs n'est pas augmentée dans la plaie ni dans son voisinage immédiat, par rapport au taux observé à distance de l'ulcération, et ce contrairement aux constatations faites dans les autres types d'ulcérations [19]. Comparé aux plaies aiguës, l'exsudat des plaies chroniques présente en général des taux diminués des principaux facteurs de croissance [20, 21] : bien qu'il s'agisse essentiellement dans ces études d'ulcères veineux, certains ont avancé que tous les ulcères chroniques procéderaient de mécanismes voisins, caractérisés par la persistance de stimuli inflammatoires et la diminution de l'activité mitogène [4]. Cependant, la baisse locale des facteurs de croissance ne pourrait expliquer à elle seule le retard de cicatrisation [21]. Une diminution du potentiel de multiplication cellulaire a été suggérée et de fait, les fibroblastes isolés d'ulcères chroniques diabétiques ont un taux de prolifération diminué [22]. De même, l'augmentation de l'activité protéasique locale a été avancée, avec en conséquence une dégradation accrue des constituants essentiels de la matrice extra-cellulaire mais aussi de facteurs de croissance, notamment PDGF, EGF et TGF-beta [4] : en effet, une élévation du taux de MMP-2 (gélatinase) a été notée sur des biopsies d'ulcères diabétiques comparés à des plaies traumatiques [23]. Enfin, il a été proposé que dans les ulcères plantaires du diabétique les facteurs de croissance puissent être enserrés dans des réseaux de fibrine et ainsi ne soient plus fonctionnels pour agir sur la plaie [24].

Facteurs de croissance et cicatrisation des plaies du pied chez le diabétique

L'hypothèse d'un déficit relatif en facteurs de croissance et/ou d'une diminution de leur action dans les plaies chroniques a fait réaliser de nombreuses études visant à apprécier l'éventuelle efficacité des facteurs de croissance en application locale pour accélérer la cicatrisation de ces ulcères « récalcitrants ». Quelques essais concernent spécifiquement les plaies du pied diabétique, utilisant un facteur donné ou l'association de plusieurs facteurs.

Les extraits plaquettaires

De par leur richesse en facteurs de croissance, les plaquettes ont été la première source d'obtention de ceux-ci. Isolées par centrifugation à partir du sang du patient (150 mL) ou d'un pool de donneurs (CT-102), les plaquettes sont mises en présence de thrombine provoquant ainsi la dégranulation et la libération du contenu des granules alpha : PDGF, TGF-beta surtout, et à un moindre degré EGF et bFGF. Ces facteurs de croissance sont mis en suspension dans une solution assurant leur stabilité. La solution est versée sur une gaze jusqu'à saturation, appliquée sur le lit de la plaie et recouverte d'une interface grasse pour éviter son évaporation.

Plusieurs études ont été publiées dans les plaies diabétiques mais il est difficile de se faire une idée objective de l'efficacité de ce produit car très souvent les plaies diabétiques étaient « noyées » au sein de plaies chroniques, et/ou l'effectif était très faible, et/ou les études étaient rétrospectives et/ou non contrôlées. La seule étude « exploitable », de type dose-efficacité, chez 97 diabétiques (dont seulement 70 évaluables) rapporte la supériorité de cette solution comparée au placebo, en termes de cicatrisation complète à la 20^e semaine et de diminution de surface et de volume des ulcères : l'efficacité était particulièrement nette pour la solution à 1 % avec une cicatrisation complète dans 80 % des cas (vs 29 % dans le groupe témoin) et une réduction moyenne de 93 % de la surface des ulcères (vs 72 %) [25]. Ce produit a été également testé en France mais les résultats n'ont jamais été publiés. Quoi qu'il en soit, cette solution non disponible en France est fabriquée aux États-Unis sous le nom de Procuren^® (Cytomedix Inc, Deerfield, Illinois) à partir de plaquettes autologues et distribuée exclusivement dans certains centres de soins des plaies.

L'Autologel^TM (Cytomedix) est fondé sur le même principe, à partir de plaquettes obtenues par aphérèse (40-50 mL), les autres constituants du sang étant réinjectés au patient. L'efficacité de ce gel est également discutable car la seule étude sur les plaies (plantaires) diabétiques est rétrospective, non contrôlée et ouverte [26].

Les facteurs de croissance obtenus par génie génétique

Les progrès du génie génétique ont permis d'obtenir de nombreux facteurs de croissance purifiés, identiques aux facteurs de croissance naturels humains, dont certains ont été expérimentés dans les plaies diabétiques.

Le FGF basique (FGF-2)

C'est un des premiers facteurs de croissance qui aient fait l'objet d'une étude en double insu, prospective et randomisée, contre placebo dans les ulcères neuropathiques diabétiques [27] : les résultats ont été décevants, puisque aucun bénéfice n'a pu être obtenu, tant sur le taux de cicatrisation que sur la diminution de la surface des plaies. Le nombre de patients était cependant faible et la forme galénique du rh-bFGF loin d'être optimale. Un essai de phase III a été rapporté par Abraham [6] dans les « ulcères de jambes diabétiques », mais cette étude a dû être arrêtée prématurément en raison de l'absence d'amélioration des plaies sous traitement par FGF-2 par rapport au groupe témoin, lors d'une analyse intermédiaire portant sur la moitié du nombre de sujets prévus ; aucune autre information n'est disponible.

Le TGF-beta

Une seule étude sur les plaies diabétiques, randomisée et en double insu, a été présentée sous forme de communication par Robson [28], comparant sur vingt semaines l'adjonction à des soins standard de TGF-beta2, inclus à trois doses différentes dans une éponge à base de collagène, contre une éponge placebo et contre les soins habituels. Dans les groupes traités par TGF-beta2, le pourcentage de cicatrisation à la 21^e semaine (± 60 %) était significativement supérieur à celui du groupe traité par éponge placebo. Néanmoins le taux de cicatrisation le plus élevé (71 %) a été observé dans le groupe traité uniquement par soins standard, jetant un doute sur la conclusion optimiste des auteurs quant à l'efficacité thérapeutique de ce facteur de croissance.

Le PDGF

C'est actuellement le seul facteur de croissance qui soit commercialisé (Régranex^®, Janssen Cilag, Issy-les-Moulineaux). Il s'agit de l'isoforme BB (rh-PDGF-BB ou bécaplermine) obtenue par insertion du gène de la chaîne B dans Saccharomyces cerevisiae et conditionnée sous forme d'un gel à base de méthylcellulose sodique.

Plusieurs études ont été menées spécifiquement sur les ulcères neuropathiques du pied chez le diabétique mais les résultats prêtent à discussion [29] (figure 4). En effet, la première étude, en double insu et randomisée contre placebo, sur 118 patients, a montré que l'application locale quotidienne du gel de bécaplermine, à une concentration de 30 mug.g^{­ 1} et sur une période maximale de 20 semaines, permettait d'atteindre un taux de cicatrisation (48 %) significativement supérieur à celui constaté dans le groupe traité par un gel placebo (25 %). Une autre étude de dessin similaire sur 383 patients mais comprenant un troisième groupe traité par bécaplermine à 100 mug.g^{­ 1} n'a pas retrouvé de différence entre le gel placebo et la bécaplermine à 30 mug.g^{­ 1} (taux de cicatrisation respectivement de 35 et 36 % à la 20^e semaine) alors qu'à la concentration de 100 mug.g^{­ 1}, la bécaplermine était supérieure au gel placebo avec une cicatrisation de 50 % des ulcères. Cependant, dans un troisième essai, la comparaison entre soins locaux optimisés seuls ou associés soit à un gel placebo soit à un gel de rh-PDGF-BB à 100 mug.g^{­ 1} ne montre aucune différence significative, bien que le taux de cicatrisation soit plus élevé avec la bécaplermine (44 %) qu'avec le gel (36 %) ou les soins locaux seuls (22 %). Enfin une quatrième étude, toujours randomisée contre placebo, sur 250 patients ne trouve pas de différence significative du taux de cicatrisation entre bécaplermine à 100 mug.g^{­ 1} (36 %) et soins locaux optimisés seuls (32 %).

Afin d'éclaircir ces résultats, ces quatre études dont les critères d'inclusion étaient très voisins, ont été regroupées en analysant l'évolution des ulcères dont la surface ne dépassait pas 5 cm² (surface habituelle des maux perforants plantaires) : le taux de cicatrisation complète à 20 semaines était de 41 % dans le groupe traité par bécaplermine à 30 mug.g^{­ 1} et 47 % avec 100 mug.g^{­ 1}, taux significativement supérieur aux 35 % obtenus avec le gel placebo et 30 % avec les soins locaux seuls [29]. Au total, avec le rh-PDGF-BB à 100 mug.g^{­ 1}, 10 à 15 % de cicatrisation supplémentaire pourraient être obtenus par rapport aux soins locaux seuls. Le gel semble par lui-même avoir une certaine efficacité que l'on pourrait rapporter à sa composition, voisine des hydrogels, pansements utilisés dans les plaies pour ses propriétés hydratantes.

En pratique, le Régranex^® est disponible en France sous forme d'un gel à 100 mug.g^{­ 1} de rhPDGF-BB en tube multidose de 15 grammes, non stérile avec conservateurs, à conserver au réfrigérateur. Ses indications découlent directement des études cliniques décrites plus haut, à savoir les ulcères neuropathiques du pied chez le diabétique, de surface ¾ 5 cm², non infectés ou dont l'infection est contrôlée par antibiothérapie, en complément de soins locaux optimisés. Le gel doit être appliqué une fois par jour en couche mince sur toute la surface de l'ulcération, après nettoyage au sérum salé, et recouvert d'un pansement humide. La durée maximale du traitement est de 20 semaines mais il est recommandé de faire le point après 10 semaines : en l'absence d'amélioration, une infection ou une insuffisance artérielle doivent être recherchées.

La prescription se fait sur une ordonnance de médicaments d'exception. Il est important que les indications soient scrupuleusement respectées pour obtenir un bénéfice clinique compte tenu du prix élevé de ce produit (357,80 euros le tube). Dans ces conditions, le Régranex^® pourrait avoir un profil coût/efficacité intéressant [30].

Le granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)

Ce facteur doit être abordé à part car il ne contribue pas directement à la cicatrisation mais il joue un rôle important dans la défense contre l'infection, en stimulant la production et la libération médullaires des polynucléaires neutrophiles. Ainsi, chez le diabétique, il a été testé non sur la cicatrisation d'ulcères mais sur l'infection sévère de plaies d'origine neuropathique. Dans une première étude, randomisée contre placebo et en double insu, son association à une antibiothérapie générale, à raison d'une injection quotidienne pendant une semaine, a permis d'augmenter le taux de guérison, d'en réduire le délai, d'écourter la durée de l'antibiothérapie et le temps d'hospitalisation [31]. Malheureusement, ces résultats n'ont pas été confirmés par une deuxième étude, utilisant un protocole très voisin dans une population dont l'infection était cependant plus sévère [32]. Cette absence de bénéfice vient d'être confirmée récemment avec une durée d'hospitalisation et d'antibiothérapie parentérale, un délai d'éradication de l'infection et un taux d'amputation identiques dans le groupe témoin et celui traité par rhG-CSF injecté par voie sous-cutanée quotidiennement, à raison de 5 mug.kg^{­ 1} de poids [33].

Cette molécule ne doit pas être confondue avec le GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). Si ce facteur injecté en sous-cutané dans la zone péri-lésionnelle a donné de bons résultats au cours dans les ulcères veineux [34], il n'a pas fait l'objet d'étude chez le diabétique.

Les substituts cutanés

L'un des mécanismes par lesquels les substituts cutanés amélioreraient la cicatrisation serait l'apport in situ de facteurs de croissance [35] : c'est la raison pour laquelle nous les envisagerons ici. Deux substituts ont été testés dans les plaies diabétiques : l'Apligraf^® et le Dermagraft™.

Apligraf ^®

Il s'agit d'un équivalent cutané humain « composite » avec reconstitution à la fois de l'épiderme et du derme. Le matériel cellulaire est issu de prépuces néonatals : après élimination du tissu sous-cutané, les fibroblastes sont obtenus par digestion protéolytique et mis en culture ; le reste du tissu est découpé et placé sur un support recouvert de collagène, permettant la culture des kératinocytes. Des banques de cellules sont ainsi créées. Du collagène stérile bovin de type I est alors fixé sur une membrane poreuse en polycarbonate, sur lequel est déposée une suspension de fibroblastes et l'ensemble réchauffé piégeant ainsi les cellules dans une matrice lâche : celle-ci se modifie progressivement et se densifie du fait de la présence des fibroblastes fonctionnels. Les kératinocytes sont alors ensemencés sur ce néoderme et l'équivalent dermo-épidermique est plongé dans un milieu de culture permettant la formation d'un épithélium rudimentaire après quelques jours ; une fois exposée à l'air, cette structure se différencie, se stratifie avec apparition notamment d'un stratum corneum [35]. Le milieu est alors modifié pour réduire la croissance cellulaire jusqu'à ce que le produit soit expédié. L'analyse histologique montre que la structure d'Apligraf^® est très proche de celle de la peau normale. Cependant, cet équivalent est dépourvu de cellules immuno-compétentes et notamment de lymphocytes, de macrophages et de cellules de Langerhans, expliquant peut-être l'absence de rejet [35]. Sur le plan microbiologique, un dépistage complet de la mère est effectué de même que sur les kératinocytes et les fibroblastes (HIV, HTLV, hépatites A et B, EBV, CMV...) ; le collagène bovin est analysé pour sa stérilité et sa composition. Sur le plan biochimique, l'ARN messager d'un très grand nombre de facteurs de croissance présents dans la peau normale est exprimé dans Apligraf^® (FGF-1, -2 et -7, PDGF-A et -B, TGF-alpha, -beta1 et -beta2, VEGF, notamment) : la présence de ces facteurs de croissance serait un des mécanismes d'action d'Apligraf^® pour induire la cicatrisation cutanée [35].

Apligraf^® se présente comme une pellicule circulaire d'environ 7,5 cm de diamètre et de 0,75 mm d'épaisseur reposant sur la membrane de polycarbonate la séparant d'un milieu nutritif (agarose), l'ensemble étant conditionné dans une conteneur en plastique transparent. Celui-ci est placé dans une enveloppe en polythène hermétiquement fermée sous atmosphère contrôlée et expédiée dans un incubateur régulant la température entre 20C et 31 °C et muni d'un indicateur de pH. Le substitut cutané, conservé dans l'incubateur, doit être utilisé dans les cinq jours après son envoi et être appliqué dans les 30 minutes qui suivent l'ouverture du conteneur. En pratique, la plaie doit être largement débridée et non infectée ; avant son application, il est nécessaire de réaliser plusieurs perforations au travers d'Apligraf^® et une certaine habitude est recommandée pour détacher l'équivalent de son support et l'étendre uniformément sur la plaie, en s'assurant que le néo-épiderme est bien à l'extérieur. Apligraf^® est ensuite recouvert d'un pansement primaire non adhésif, à changer au bout d'une à deux semaines, puis d'un pansement secondaire, comme des compresses de gaze, remplacé tous les cinq à sept jours.

Sur le plan clinique, une seule étude prospective a été publiée concernant les ulcères neuropathiques diabétiques : elle comparait, en double insu, les soins optimisés seuls et associés à Apligraf^®, sur une période de douze semaines, chez 208 diabétiques [36]. Apligraf^® était appliqué initialement et cette application était éventuellement renouvelée avec un intervalle minimum d'une semaine si la plaie ne montrait pas de signes évident d'amélioration. Après 5 semaines, les patients sous Apligraf^® recevaient le traitement optimisé seul et ce jusqu'à la 12^e semaine ou avant, en cas de cicatrisation. Dans le groupe Apligraf^®, le taux de cicatrisation complète a été de 56 %, significativement supérieur à celui constaté avec les soins optimisés seuls (39 %) ; le temps médian pour atteindre la cicatrisation complète était également significativement réduit dans le groupe Apligraf^® (65 vs 90 jours). En revanche, le taux de récidive des ulcères, jugé à 6 mois, n'était pas différent entre les deux groupes (5,9 % dans le groupe Apligraf^® vs 12,9 %). Une étude multicentrique européenne est actuellement en cours, dont les résultats devraient être connus d'ici deux à trois ans.

Au total, cette première étude d'Apligraf^® dans les ulcères neuropathiques du diabétique est très encourageante, mais doit être corroborée par d'autres essais. Le prix probablement élevé de ce substitut cutané justifiera en outre une analyse coût-efficacité.

Dermagraft^®

Ce substitut est uniquement dermique, produit à partir d'une banque de fibroblastes issus de prépuces néonatals et cultivés sur une matrice synthétique résorbable, tridimensionnelle (polyglactine). Colonisant cette matrice et y proliférant, les fibroblastes secrètent de nombreux facteurs de croissance (PDGF-A, TGF-alpha, -beta1 et beta3, KGF et VEGF) et des protéines de la matrice extra-cellulaire (collagène I et III, ténascine, fibronectine, glycosaminoglycanes) dans laquelle ils s'incrustent. Toutes ces étapes s'effectuent dans un « bioréacteur » qui assure la stérilité du produit et fournit des conditions optimales de production. Sur le plan de la sécurité, les échantillons sanguins maternels sont testés pour s'assurer de l'absence de risque infectieux ; les fibroblastes en culture subissent des test de stérilité, un dépistage extensif à la recherche d'une contamination virale ou rétrovirale et d'un éventuel potentiel tumorigène. Chaque lot est issu d'un seul donneur, qui peut fournir jusqu'à 22 500 m² de produit final. La viabilité et l'activité métabolique du néo-tissu sont jugées par un test spécifique [37]. Le produit est cryopréservé, sous forme de pièce individuelle à utilisation unique de 5 x 7,5 cm, conditionnée dans un étui transparent, lui-même à l'intérieur d'une poche scellée en papier aluminium et stocké à ­ 70 °C. Conformément à la législation sur les tissus vivants, ce produit est distribué par une banque de tissus qui s'assure de sa traçabililité, de son stockage et de son acheminement vers l'utilisateur dans les conditions de température requises. Dermagraft^® doit être progressivement réchauffé en plongeant pendant deux minutes l'étui dans un bain-marie à 37 °C, avant d'être rincé plusieurs fois au sérum salé physiologique, découpé à la taille de l'ulcère si nécessaire et appliqué sur le lit de la plaie. Il est ensuite recouvert d'un pansement non adhérent, éventuellement de compresses humides, et sécurisé par une bande de gaze.

Plusieurs études randomisées et contrôlées ont donné des résultats encourageants dans les ulcères neuropathiques du pied chez le diabétique (figure 5). Dans l'étude « pilote » chez 50 patients suivis pendant un maximum de 12 semaines [38], l'application hebdomadaire d'une pièce de Dermagraft^® pendant huit semaines s'est révélée plus efficace qu'un pansement non adhérent associé à des compresses humidifiées, en termes de pourcentage de cicatrisation complète en fin d'étude (50 % vs 7,7 %). Cependant, le faible taux de cicatrisation dans le groupe témoin jette un doute sur la qualité des mesures locales adoptées dans cette étude et le petit nombre de patients n'autorise pas à des conclusions définitives. L'étude « pivot » chez 281 patients, selon un protocole identique au précédent [39], a donné des résultats plus mitigés : aucune différence significative dans le taux de cicatrisation à la 12^e semaine n'a été décelée entre les 109 patients du groupe Dermagraft^® et les 126 du groupe témoin ; cependant, l'analyse de l'activité métabolique a mis en évidence des différences importantes entre les lots, certains ayant une activité trop basse et d'autres trop élevée. Ainsi, en ne retenant que les patients ayant reçu un néoderme actif initialement et au moins une fois sur deux par la suite, le taux de cicatrisation devient significativement plus élevé comparé au placebo (50,8 % vs 31,7 %) ; en outre, cette différence se maintient à la 32^e semaine, alors que six mois s'étaient écoulés depuis la dernière application de Dermagraft^®. Une troisième étude plus récente [40], utilisant un néoderme dont l'activité était contrôlée chez 50 patients, va dans le même sens, mais est moins rigoureuse, le groupe témoin étant un groupe « historique », celui ayant participé à l'étude « pivot ».

Ainsi, il apparaît que Dermagraft^® est efficace pour augmenter le taux de cicatrisation des ulcères neuropathiques du diabétique, sous couvert d'une activité suffisante, ce qui est maintenant systématiquement contrôlé avant et après cryopréservation. Reste que son coût est élevé (2 600 F par pièce soit environ 396 euros) représentant un coût total de 18 200 à 20 800 F (2 775 à 3 171 euros) si l'on applique le protocole des études cliniques (une pièce chaque semaine, pendant 7 à 8 semaines). Néanmoins, une analyse coût-efficacité menée en France [41] fait ressortir un coût moyen par ulcère cicatrisé moins important avec Dermagraft^® qu'avec le traitement conventionnel, en raison d'un taux et d'une vitesse de cicatrisation plus élevés.

Problématique de l'utilisation thérapeutique des facteurs de croissance

L'utilisation des facteurs de croissance comme traitement local pour accélérer la cicatrisation pose plusieurs questions qui ne sont pas encore résolues et nécessite une mise au point.

Un ou plusieurs facteurs de croissance ?

La question reste ouverte de savoir si l'application locale d'un seul facteur de croissance suffit à stimuler de façon significative la cicatrisation ou s'il faut recourir à un « cocktail » de facteurs de croissance. En l'absence d'un déficit bien identifié portant sur un facteur de croissance individuel dans les plaies diabétiques, on serait tenté de se rallier à la 2^e proposition, d'autant que certains travaux chez l'animal montrent que l'association de facteurs de croissance peut être synergique [18, 21] : cette constatation n'est cependant pas toujours retrouvée [17].

Quel(s) facteur(s) de croissance ?

Dans l'hypothèse de l'application d'un seul facteur de croissance, on peut se demander si l'un en particulier est plus approprié pour un type donné de plaie : c'est ce que soutient Falanga [42], pour qui les ulcères profonds seraient justifiables préférentiellement des facteurs de croissance agissant sur la formation de la matrice extra-cellulaire et l'angiogenèse, comme le PDGF ou le FGF, alors que ceux où le problème de ré-épithélialisation est au premier plan relèveraient avant tout de facteurs de croissance stimulant les kératinocytes, comme l'EGF ou le KGF. On peut également se demander si le stade de la cicatrisation doit être un critère d'indication [5] : en suivant la suggestion précédente, il est tout à fait concevable de n'utiliser un facteur de croissance donné qu'à une phase précise, par exemple le PDGF au stade de réparation dermique. Tout aussi bien faut-il appliquer tel facteur de croissance à tel stade et un autre à un autre stade, selon une approche séquentielle.

Quelle dose de facteur de croissance ?

Faut-il appliquer de faibles doses de facteurs de croissance, comme c'est le cas avec les extraits plaquettaires, recourir à des doses plus physiologiques comme celles délivrées par les substituts cutanés ou employer de fortes doses comme celles contenues dans le Régranex^® ? L'avantage théorique d'une forte dose serait d'assurer une diffusion rapide et/ou de compenser la destruction protéolytique du facteur de croissance [21], mais une trop forte concentration pourrait avoir un effet inhibiteur.

Quelle forme galénique pour les facteurs de croissance ?

Plusieurs formes ont été utilisées dans les essais cliniques : liquide, gel, pâte, billes, éponge de collagène, etc., et certaines études n'ont pas abouti à des résultats concluants vraisemblablement en raison d'une présentation galénique inappropriée [27]. En général, la stimulation par un facteur de croissance demande une exposition prolongée [21] et l'importance critique du « véhicule » dans l'efficacité du facteur de croissance a été bien soulignée par Puolakkainen pour ce qui est du TGF-beta1 [43].

Qu'en est-il des effets à long terme des facteurs de croissance ?

La principale question est le risque oncogène des facteurs de croissance. Il est en effet bien reconnu que les facteurs de croissance peuvent participer à l'oncogenèse : ainsi, l'oncogène v-sis du virus du sarcome simien induit la formation d'une protéine identique à la chaîne B du PDGF ; cet oncogène ainsi que son homologue cellulaire (c-sis) peuvent transformer les lignées cellulaires portant des récepteurs au PDGF, par un mécanisme autocrine [7, 14, 45]. Le PDGF peut induire la transcription de certains proto-oncogènes (c-myc). Certains oncogènes codent des récepteurs des facteurs de croissance et certaines tumeurs expriment des facteurs de croissance et leurs récepteurs, posant le problème d'une stimulation autocrine dans la croissance des cellules tumorales [2, 3, 10]. Cependant, du moins pour le PDGF, l'absorption systémique après application locale est faible et la demi-vie rapide ; reste le problème du potentiel carcinogénique local mais jusqu'à maintenant aucun problème de ce type n'a été rapporté.

Limites et leçons des études cliniques

Les résultats des essais cliniques sur les facteurs de croissance doivent être interprétés dans leur contexte. D'abord les études ont porté essentiellement sur les ulcères neuropathiques ou à composante neuropathique prédominante. Il n'est donc pas légitime d'extrapoler les résultats aux plaies ischémiques du diabétique. En outre, il s'agissait de plaies non infectées ou dont l'infection était bien contrôlée par antibiothérapie. Enfin, ces études ont analysé l'efficacité de l'adjonction de facteurs de croissance à des soins locaux optimisés, en insistant sur l'importance de la décharge, du débridement et du bon contrôle glycémique. Il serait donc illusoire d'attendre un bénéfice de l'application locale de facteurs de croissance (et coupable de les prescrire) si ces mesures de bases ne sont pas respectées. Le meilleur exemple est apporté par Steed [44] qui a montré au cours d'une étude multicentrique sur le rh-PDGF qu'en général un faible taux de cicatrisation était noté dans les centres où les débridements étaient les moins fréquents et ce, indépendamment de l'option thérapeutique (PDGF ou placebo). Il est d'autre part vraisemblable que les taux de cicatrisation relativement élevés constatés dans le bras placebo de ces études sont à mettre sur le compte de l'application stricte de ces mesures locales.

MMP : Matrix Metallo-Proteinases (Métallo-protéases).

TIMP : Tissue Inhibitors of Metallo-Proteinase (Inhibiteurs tissulaires des métallo-protéases).

PM : Poids moléculaire.

rh- : recombinant human (obtenu par technique de recombinaison génétique).

CONCLUSION

L'utilisation des facteurs de croissance dans le traitement des ulcères neuropathiques du diabétique, en association avec des soins optimisés, constitue un progrès en termes d'efficacité, même si les résultats ne sont pas tout à fait à la hauteur des espoirs mis dans cette thérapeutique au vu des constatations expérimentales. Il serait de toute façon naïf de penser qu'un traitement puisse à lui seul cicatriser rapidement tous les ulcères, tant le phénomène de la réparation cutanée est complexe et parce que de nombreux autres facteurs interviennent, justifiant la prise en charge multidisciplinaire de cette pathologie. Jusqu'à maintenant, cette thérapeutique n'a provoqué aucun effet secondaire sérieux, notamment la survenue de néoplasie, de fibrose ou l'aggravation de rétinopathie. Restent que de nombreuses incertitudes persistent quant au mode de délivrance, à la concentration et aux indications précises.

Plusieurs voies de recherche sont en cours pour optimiser l'efficacité de ces facteurs : l'adjonction de dispositifs antiprotéases (molécules ou pansements) aux facteurs de croissance est une des solutions proposées [5, 21]. Le recours à la thérapie génique en est une autre. Ces développements passionnants ne doivent pas cependant faire oublier les mesures indispensables de base.

Les références bibliographiques ont été volontairement limitées ; une bibliographie plus importante est disponible en contactant les auteurs.

Remerciements

Les auteurs remercient les Dr Véronique Schiffer, Claude Yvon et Manfred Stahel pour leur avoir facilité l'accès à des données originales.

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