CD44 et pathologies colorectales

ARTICLE

CD44 : organisation génomique et structure

CD44 est une famille de glycoprotéines membranaires ubiquitaires, comportant de nombreuses isoformes qui diffèrent par leurs structures et leurs fonctions [pour revue : 1, 2]. Cette diversité moléculaire a plusieurs origines. CD44 est codé par un gène unique localisé sur le bras court du chromosome 11 chez l'homme, couvrant approximativement 50 kb et comportant 20 exons. Les 5 premiers exons codent pour l'extrémité amino-terminale du domaine extracellulaire [3] (figure 1) et sont retrouvés dans tous les transcrits CD44. Les 10 exons suivants (exons 6 à 15) sont sujets à un épissage alternatif générant une région variable pouvant contenir différentes combinaisons d'exons [4] (v1 pour l'exon 6 à v10 pour l'exon 15, figure 1). L'exon 16 code pour la région proximale membranaire du domaine extracellulaire
et l'exon 17 code pour le domaine hydrophobe transmembranaire. Enfin
le domaine cytoplasmique est aussi sujet à un épissage alternatif des exons 19 et 20 générant une version courte (3 acides aminés) ou longue (70 acides aminés) de la queue cytoplasmique [3].

En théorie, les possibilités de combinaisons d'exons dépassent en complexité les variations potentielles de la famille des intégrines d'autant plus que les modifications post-traductionnelles enrichissent le répertoire CD44. L'isoforme la plus abondante est l'isoforme standard CD44H dépourvue de la région variable codée par les exons 6 à 15 (figure 2). Elle est largement exprimée par les cellules sanguines excepté les plaquettes. La taille attendue pour la chaîne protéique de cette isoforme est de 37 kDa. Des modifications post-traductionnelles portant sur 6 sites de N-glycosylation et 7 sites de O-glycosylation conduisent à la taille observée proche de 90 kDa. Par ailleurs,
4 motifs Ser-Gly peuvent être modifiés par des glycosaminoglycanes de type chondroïtine sulfate (figure 2) convertissant la glycoprotéine en un protéoglycane de 180 à 200 kDa.

Les isoformes de haut poids moléculaire sont exprimées pour leur part à la surface d'un grand nombre de cellules normales, mais aussi à la surface de cellules tumorales [5]. L'insertion entre les acides aminés 202 et 203 de séquences codées par les exons 7 (v2) à 15 (v10) génère un domaine comportant au maximum 381 acides aminés. Cette région variable présente 4 sites supplémentaires de N-glycosylation et de nombreux sites de O-glycosylation (figure 2). La taille observée pour ces isoformes CD44v varie de 120 à plus de 200 kDa.

L'extrémité cytoplasmique inter-agit avec les composants du cytosquelette [6]. Un certain nombre de modifications incluant la phosphorylation médiée par la protéine kinase C [7] ou la palmitoylation peuvent réguler l'interaction entre la queue et les protéines du cytosquelette.

Des isoformes solubles de CD44 ont été mises en évidence dès 1989 par Lucas et al. [8]. L'hétérogénéité de ces isoformes, dont l'origine, la fonction et le mode de relargage sont partiellement connus, est comparable à celle des isoformes membranaires.

CD44 : molécule multifonctionnelle

Cette hétérogénéité de structure est en grande partie en rapport avec l'hétérogénéité de fonction de CD44 (tableau 1). La fonction principale de CD44 est celle de récepteur de l'acide hyaluronique [9], appartenant à la famille des hyaladhérines. Le site de liaison de l'acide hyaluronique a été localisé à l'extrémité amino-terminale du domaine constant (figure 2). CD44 peut également interagir avec différents composants de la matrice extracellulaire ou molécules matricielles, comme par exemple le collagène, la fibronectine, la laminine ou l'ostéopontine [10, 11].

Les mécanismes susceptibles de réguler l'interaction du CD44 avec ses ligands, l'acide hyaluronique et les autres composants de la matrice extracellulaire sont nombreux. Les principaux sont regroupés sur le tableau 2.

CD44 : molécule impliquée dans la progression tumorale

La progression tumorale fait intervenir une cascade d'altérations génétiques et épigénétiques, chacune essentielle mais non suffisante, attribuant à la cellule tumorale un avantage de croissance. Un certain nombre d'éléments expérimentaux, obtenus par des expériences in vitro ou grâce à des modèles animaux, indiquent que CD44 est impliqué dans la progression tumorale.

CD44 est une molécule accessoire coopérant avec d'autres molécules dans la délivrance de signaux entraînant la prolifération, comme cela a été démontré dans le cas des cellules endothéliales [23]. C'est également un élément favorisant la migration péritumorale en raison de son rôle de récepteur de composants de la matrice [13]. CD44, par sa participation à des interactions hétérophiliques, favorise la formation d'aggrégats cellulaires qui augmente la survie des cellules tumorales dans le secteur vasculaire. Enfin, c'est également le récepteur responsable de la domiciliation des lymphocytes dans les ganglions [14]. Certains travaux démontrent que l'endothélium des tissus inflammatoires induit l'adhérence « CD44-dépendante » des lymphocytes [24]. Par homologie, l'interaction CD44-endothélium pourrait être fondamentale dans la dissémination des cellules tumorales par voie sanguine.

De nombreux travaux sur des modèles animaux ont permis de rendre compte de l'importance des variants de CD44 dans la dissémination métastatique. La première observation a été faite à partir d'un modèle de cellules non métastatiques d'adénocarcinome du pancréas de rat transfectées avec CD44v4-v7. Le gain d'un potentiel métastatique après transfection a été démontré chez l'animal syngénique [25]. L'influence décisive de la région v6 a ensuite été confirmée par la prévention de formation de métastases par des anticorps monoclonaux dirigés contre un épitope localisé sur la région peptidique codée par l'exon variant v6 [26]. Des analyses expérimentales ont également été réalisées sur des lignées tumorales colorectales. L'une d'elles, HT29, exprime des isoformes de haut poids moléculaire de CD44 [27]. Sa capacité métastatique chez la souris immunodéficiente SCID est inhibée lorsque l'expression du CD44v6 est réduite par transfection d'un ARN antisens [28].

Techniques d'évaluation de l'expression cellulaire de CD44

Immuno-histochimie

L'expression membranaire des isoformes du CD44 peut être évaluée par immunohistochimie. L'immunomarquage permet d'apprécier la diversité cellulaire, de distinguer les cellules positives tout en conservant l'intégrité du tissu analysé. La diversité des anticorps anti-CD44 et des épitopes reconnus au niveau de cette glycoprotéine (figure 3) rendent l'interprétation d'un immunomarquage très délicate. L'utilisation d'un anticorps anti-CD44, dont l'épitope se situe sur la partie constante de la glycoprotéine, révèle l'expression de l'isoforme standard de CD44 mais aussi de tous les variants. Un anticorps monoclonal dirigé contre un variant révélera l'expression des isoformes possédant cet épitope sans précision sur la combinaison précise des associations des différents variants.

Tous les tissus normaux ont ainsi été examinés et analysés [5, 29, 30]. La majorité des tissus normaux expriment CD44H et également certains variants (tableau 3). Concernant les tumeurs, les auteurs attribuent généralement un score relatif au nombre de cellules positives dans un tissu tumoral. Ainsi, un seuil entre 10 % et 25 % des cellules positives est généralement utilisé pour affirmer qu'une tumeur exprime significativement CD44. Deux points méritent d'être soulevés. L'intensité du marquage, qui est généralement évaluée, dépend de l'affinité des anticorps monoclonaux et de la densité des épitopes présents à la surface des cellules. De plus, la diversité cellulaire au sein d'une tumeur oblige l'observateur à distinguer les cellules tumorales, les cellules stromales et les lymphocytes infiltrants.

Analyse de l'ARNm

L'analyse qualitative et semi-quantitative des transcrits codant pour les isoformes de CD44 peut être abordée par hybridation d'ARNm extraits de tissus normaux ou de tumeurs préalablement homogénéisées. Une alternative consiste à amplifier, par des amorces spécifiques des exons constants ou variants, l'ADNc synthétisé à partir des ARNm (RT-PCR). Les amplicons obtenus sont alors séparés par électrophorèse et identifiés par hybridation de sondes marquées (figure 3). Pour un gène d'expression aussi ubiquitaire que le CD44, l'information apportée par ces techniques est délicate à interpréter car l'hétérogénéité cellulaire d'une tumeur ou d'un tissu normal ne peut pas être prise en compte. Ce problème peut être contourné en procédant à une hybridation in situ de sondes spécifiques.

CD44 et côlon sain

La glycoprotéine est exprimée de façon prédominante dans des régions à multiplication cellulaire active. Dans la muqueuse colique normale, l'expression de CD44 est strictement confinée aux zones épithéliales prolifératives de la base des cryptes [31]. Dans le reste de l'épithélium colique l'expression est quasiment absente. D'autre part, CD44 est également présent dans les muscles lisses, les fibroblastes, la lamina propria ainsi que dans toutes les cellules immunocompétentes comme les lymphocytes et les macrophages. Ces cellules expriment préférentiellement la forme standard CD44H, mais un changement de répertoire peut être observé après activation cellulaire. Lymphocytes et macrophages peuvent ainsi exprimer des formes contenant la partie codée par l'exon v6 [32]. L'expression des variants est uniquement retrouvée à un niveau beaucoup plus faible à la base des cryptes alors que les autres cellules épithéliales sont négatives pour ces isoformes [31].

CD44 et cancer colorectal

Le contraste entre l'expression faible et restreinte du CD44 par les cellules épithéliales coliques et la surexpression de certaines isoformes dans les cellules de tumeurs colorectales a été constaté dès 1993 par Heider et al. [29]. Depuis cette date, de nombreuses équipes ont évalué l'expression de CD44 au niveau d'adénomes, de carcinomes et de métastases hépatiques. Certaines équipes ont recherché une valeur pronostique d'un immunomarquage anti-v6 positif ainsi qu'une relation entre l'expression de CD44v6 et la progression tumorale. D'autres équipes ont recherché l'implication des isoformes CD44v6 dans la progression adénome * carcinome * métastase.

Analyse immuno-histologique de l'expression membranaire

Les études destinées à mettre en évidence la valeur pronostique de l'immunomarquage CD44 sont nombreuses [33-43], mais avec des résultats discordants (tableau 4). Ces différences peuvent être expliquées par l'absence de standardisation des méthodes d'immunomarquage, de la lecture des lames histologiques et de la définition d'un seuil de positivité. Il est donc difficile de tirer des conclusions définitives sur la valeur pronostique d'un immunomarquage positif anti-CD44 de tumeur colique. Une standardisation des réactifs et des modes opératoires apparaît nécessaire pour évaluer objectivement l'impact pronostique de la surexpression des isoformes telles que CD44v6 par les adénocarcinomes colorectaux.

Deux études publiées en 1998 illustrent bien ces discordances. L'étude de Coppola et al. [35] porte sur l'analyse immunohistochimique de 95 prélèvements : 35 adénomes, 34 carcinomes et 26 métastases. La surexpression de CD44v6 a été observée dans 100 % des adénomes et 91 % des carcinomes. Aucune corrélation n'a été constatée entre cette expression de v6 et les paramètres cliniques, le stade, le grade de la tumeur ou la survie des patients. A contrario, l'étude de Ropponen et al. [33], portant sur 194 patients atteints d'un adénocarcinome, démontre qu'il existe une relation entre l'expression de CD44H ou de CD44v6 et le grade de la tumeur. De plus, il est constaté une relation entre l'intensité de l'immunomarquage CD44v6 et le stade de la tumeur, mais aussi la survie des patients.

Les différentes analyses immunohistochimiques de l'expression membranaire des isoformes de CD44 permettent d'établir que la surexpression apparaît aux stades les plus précoces de la carcinogenèse colorectale. Même les plus petits adénomes présentent un immunomarquage anti-CD44 positif dès lors qu'un anticorps monoclonal de très bonne affinité est utilisé. Au sein même d'une tumeur, il existe une très grande hétérogénéité d'expression : dans chaque tumeur un profil complexe de variants est détectable. La composition précise des associations de variants reste difficile à établir bien que certains variants soient prédominants [31].

Concernant les métastases, l'importance des isoformes contenant le variant v6 (CD44v6) a été démontrée sur des modèles expérimentaux. L'expression membranaire de CD44v6 a été étudiée par immunomarquage dans des tumeurs primaires et des métastases hépatiques chez des patients au stade métastatique (tableau 5). Aucune corrélation entre l'immunomarquage anti-v6 de la tumeur primaire et la présence de métastases n'a pu être démontrée. Pour certains auteurs, l'acquisition des fonctions migratoires des cellules tumorales s'accompagne de la perte d'expression de v6. Cette hypothèse se fonde sur l'observation que de nombreuses métastases (hépatiques) ont une plus faible expression de CD44v6 que la tumeur primaire. Cependant, d'autres résultats viennent en contradiction et rapportent une expression de CD44v6 identique dans les métastases et dans les adénomes ou les carcinomes. En fait, une telle analyse de l'expression membranaire d'une isoforme comme CD44v6 dans une tumeur primaire ou de ses métastases ne constitue qu'un cliché instantané des cellules qui ne présentent à cet instant aucune activité migratoire. L'implication de CD44v6 dans les fonctions métastatiques de cellules ne peut être affirmée sur la seule analyse immunohistochimique de coupes de tumeurs ou de métastases.

Analyse par biologie moléculaire des transcrits du gène CD44

Dès 1992, la surexpression de transcrits codant pour l'isoforme standard et différents variants est mise en évidence dans les tumeurs colorectales [29, 42, 44, 45]. Les différentes techniques révèlent que l'isoforme standard CD44H prédomine aussi bien dans le tissu sain que dans le tissu tumoral. Cependant, des transcrits de taille plus importante, codant pour l'isoforme CD44v8-v10, sont présents en quantité significativement plus importante dans les adénocarcinomes colorectaux [46]. D'autres études démontrent que tous les adénocarcinomes présentent un taux très important de transcrits v6, v7, v8 sans aucune corrélation avec le stade ou le statut métastatique. La persistance d'une séquence intronique (intron 9), mise en évidence dans les tumeurs de la vessie, a été également recherchée au sein des tumeurs colorectales [47, 48]. Cette anomalie de l'épissage est significativement présente dans les adénocarcinomes colorectaux. Elle n'est pas spécifique des néoplasies car elle a été retrouvée à un taux très faible dans l'intestin sain. D'autre part, des transcrits CD44v6 et CD44v7 sont également détectés dans les polypes de très petite taille et, malheureusement, il est impossible de différencier par ces techniques très sensibles et sur ce seul critère un polype d'un carcinome [49]. Aucun transcrit spécifique d'un variant donné n'est clairement associé à la progression tumorale dans la transition adénome * carcinome. Tous les variants sont détectés à tous les stades [36].

L'hybridation in situ constitue une bonne alternative à la RT-PCR pour évaluer le niveau de transcription du gène CD44. Le niveau de transcription peut être évalué dans chaque cellule en conservant l'intégrité du tissu observé [50, 51]. Gorham et al. ont ainsi utilisé deux sondes anti-sens hybridant pour la première avec les transcrits des exons 3-4-5-16-17-18 codant pour la région constante du domaine extracellulaire (CD44H) et pour la seconde avec les transcrits des exons variables 7 à 15 (CD44v). Dans le côlon sain, l'hybridation de la sonde CD44H est observée au niveau des cellules de la lamina propria, des fibroblastes, des lymphocytes, des macrophages et des cellules épithéliales de la base des cryptes. L'hybridation de la sonde CD44v n'est pas observée dans le tissu sain. Dans le cas des adénomes et des carcinomes, l'hybridation des deux sondes est très importante dans les cellules tumorales alors que la sonde CD44v n'hybride pas dans les cellules stromales et les lymphocytes infiltrants. L'hybridation avec les deux sondes est plus importante dans les carcinomes que dans les adénomes sans relation avec le stade de la tumeur. Ces résultats sont tout à fait cohérents avec ceux obtenus par immunomarquage.

L'utilisation comme outil de diagnostic de cette surexpression très précoce de transcrits CD44 a été proposée par les équipes de Yoshida et al. [52] et Yamao et al. [53]. L'analyse des transcrits présents dans des cellules obtenues après lavages de la lumière de pièces opératoires ou à partir d'un échantillon de selles a été réalisée par RT-PCR suivie d'hybridation. Les transcrits de CD44H sont retrouvés chez tous les individus sains. Ceux de CD44v6 sont retrouvés chez 68 % des patients atteints de cancer colorectal. L'origine cellulaire de ces transcrits n'a pas été déterminée. Un faible pourcentage de sujets sains présentent également des transcrits CD44v6. Cette technique amène à un certain nombre de faux positifs et de faux négatifs et une approche diagnostique semble donc relativement délicate et limitée.

Surexpression du gène CD44 et altérations génétiques

La surexpression du gène CD44 a été recherchée parallèlement à d'autres altérations génétiques comme la mutation du gène suppresseur p53 ou de l'oncogène K-RAS [40, 54, 55]. Dans ces études, la surexpression de CD44 a été évaluée par immuno-histologie conjointement à la recherche de mutations de K-RAS et de p53. La première étude de Kim et al. [55] porte sur 30 adénomes et 8 carcinomes. La surexpression de CD44 est retrouvée dans 53 % des adénomes pour seulement 20 % de mutation K-RAS et 13 % d'expression de p53. De même, la surexpression de CD44 est retrouvée dans 62 % des carcinomes, la mutation de K-RAS est retrouvée dans 50 % des cas et p53 est révélée dans 75 %. Mulder et al. [40] confirment ces résultats et retrouvent une surexpression de v5 et de v6 dans 83 % et 21 % des adénomes, respectivement, pour seulement 29 % d'expression de p53. Concernant les carcinomes, la surexpression de v5 et de v6 est retrouvée dans 95 % et 75 % des cas pour 62 % d'expression de p53.

Toutes ces études confirment que la surexpression de CD44 est un événement très précoce dans la séquence adénome * carcinome et semble être indépendante des altérations génétiques étudiées ci-dessus.

CD44 soluble (sCD44) et cancer colorectal

Dès 1994, Guo et al. proposent les isoformes solubles de CD44 comme des marqueurs tumoraux potentiels [56]. CD44 soluble, toutes isoformes confondues, est présent dans le plasma [8] à une concentration de l'ordre de 300 ng/ml. L'origine cellulaire de ces isoformes demeure plus ou moins certaine. Au niveau sanguin, il peut être envisagé une origine leucocytaire [57], par un mécanisme de relargage qui demeure hypothétique. Ces isoformes peuvent provenir d'un clivage protéolytique [58] ou d'un mécanisme d'épissage alternatif comme cela a été mis en évidence chez la souris [59]. Weg-Remers et al. ont montré que la concentration en sCD44 et en sCD44v6 est significativement plus importante chez les patients atteints d'un cancer du côlon que chez les sujets sains [60]. Cependant, comme nos résultats le démontrent, cette augmentation n'est pas en corrélation avec la présence de métastases hépatiques et/ou le stade tumoral. Aucun profil d'expression de variants n'est retrouvé spécifiquement associé avec les critères anatomo-cliniques. Cette augmentation n'est pas spécifique car elle est retrouvée chez les patients atteints d'une pathologie inflammatoire comme la maladie de Crohn ou la rectocolite inflammatoire. sCD44 demeure donc un test peu spécifique et peu sensible.

CD44 et pathologies non cancéreuses

L'expression de CD44 a été étudiée dans la muqueuse intestinale de patients atteints de rectocolite hémorragique ou de maladie de Crohn [61-65]. Dans deux études menées par Rosenberg et al. [61] et Kitano et al. [62], réalisées respectivement sur 25 et 12 rectocolites et sur 18 et 12 maladies de Crohn, il est montré que les cellules épithéliales expriment significativement les exons v3 et v6 dans les rectocolites alors que l'immunomarquage v3 et v6 n'est positif que dans la base des cryptes dans la maladie de Crohn. Cependant, les études de Papadogianakis et al. [63] et Reinisch et al. [64], réalisées sur des populations comparables, n'ont pas confirmé cette différence. Parallèlement, Yoshida et al. [52] ont analysé les transcrits codant pour l'exon 11 (v6) dans les biopsies de 4 maladies de Crohn et de 5 colites. Les transcrits sont présents sans différence significative dans les deux groupes. Les profils obtenus sont équivalents, mais cependant différents de ceux observés dans les carcinomes. Très récemment, en complément des travaux antérieurs, Reinisch et al. [65] ont confirmé une surexpression de CD44 préférentiellement dans les rectocolites mais avec une différence non significative par rapport aux maladies de Crohn. Des études complémentaires standardisées, réalisées sur de plus larges séries, confirmeront peut-être les premiers résultats. Cela constituera un progrès significatif pour le diagnostic de la rectocolite hémorragique et de la maladie de Crohn sans pour autant démontrer l'implication de CD44 dans la pathogénie de ces affections.

CONCLUSION

La surexpression membranaire de CD44 peut être considérée comme l'un des événements les plus précoces observé lors de la tumorigenèse colorectale. Cette surexpression de CD44 est hétérogène, elle concerne la quasi-totalité des isoformes mais à des niveaux d'expression très variables et elle est observée à la surface de 10 % à 100% des cellules tumorales. Cette surexpression n'est pas spécifique du tissu cancéreux, elle est aussi observée à la surface des cellules épithéliales de polypes ou lors de pathologies inflammatoires. Dans le cas des cellules tumorales coliques, cet événement peut précéder d'autres altérations génétiques touchant des gènes suppresseurs de tumeurs ou des oncogènes. Elle s'inscrit dans le cadre très complexe des modifications phénotypiques qui touchent les cellules tumorales, incluant la néoexpression ou la disparition de molécules d'adhérence ou de récepteurs de cytokines. Cette surexpression membranaire de CD44 révélée par immunohistologie apparaît pour l'instant, en l'absence de toute standardisation rigoureuse de la technique, sans valeur pronostique. D'autre part, elle n'est pas strictement associée à la présence de métastases, qui, lorsqu'elles existent, expriment elles aussi avec la même hétérogénéité différentes isoformes de CD44.

Les multiples fonctions de CD44, démontrées in vitro sur des lignées cellulaires et in vivo sur des modèles animaux, font de cette glycoprotéine une molécule d'adhérence clé de certains processus physiologiques et pathologiques. La perturbation de l'expression de certaines isoformes de CD44 attribue aux cellules tumorales de nouvelles fonctions pouvant privilégier leur croissance et leur mobilité. La surexpression membranaire de CD44 s'accompagne d'une augmentation de la concentration plasmatique en isoformes solubles. Celle-ci n'est pas spécifique d'un processus tumoral et peut être observée lors de certaines pathologies inflammatoires. Les isoformes solubles de CD44 ne peuvent donc pas être considérées comme marqueurs tumoraux. Leurs concentrations n'ont aucune valeur prédictive.

La surexpression membranaire de CD44 a pour origine une surexpression du gène CD44 et un certain nombre d'anomalies de l'épissage alternatif des exons variants. L'épissage alternatif des pré-ARNm est un mécanisme aboutissant à la production de protéines de structures et de fonctions différentes à partir d'un gène unique. Des facteurs très variés incluant hormones, facteurs de croissance ou cytokines, sont à l'origine du changement du profil d'expression adapté au développement et à la différenciation cellulaire. L'épissage alternatif du gène CD44 est ainsi sous le contrôle d'éléments transrégulateurs associés à des séquences cis-régulatrices situées au sein même des exons [66, 67]. L'identification de ces facteurs transrégulateurs et des effecteurs contrôlant l'épissage alternatif des transcrits CD44 permettra de mieux comprendre cette modification phénotypique précoce de la carcinogenèse colorectale.

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