Verotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) and Escherichia coli O157:H7 in medicine and food industry

ARTICLE

De nombreuses souches de l'espèce Escherichia coli
(E. coli) sont des hôtes normaux du tractus gastro-intestinal de l'homme et des animaux, mais elles peuvent également être à l'origine de désordres gastro-intestinaux. Il est possible de trouver ces bactéries dans d'autres localisations, par exemple l'appareil génito-urinaire ou des plaies chirurgicales. Les souches produisant les toxines dangereuses mises en évidence sur des cultures cellulaires, cellules Vero (cellules rénales du singe vert d'Afrique), sont appelées Escherichia coli producteurs de vérocytotoxines ou VTEC. Ces souches sont à l'origine de colites hémorragiques chez l'homme et peuvent entraîner, dans certains cas, la mort.

En 1947, une classification utilisant le sérotypage a été développée ; elle était basée sur l'identification des antigènes de surface des bactéries E. coli (antigènes O somatiques). Cette classification a permis de diviser le groupe E. coli en 170 sérogroupes différents. Dans chacun de ces sérogroupes, un nombre variable de sérotypes a pu être caractérisé en utilisant d'autres structures présentes à la surface des bactéries : les antigènes H flagellaires. Le sérotype particulier E. coli O157:H7 est fréquemment producteur de vérocytotoxines ou vérotoxines.

Tout au long de cette revue, une convention d'écriture va être utilisée. Quand le terme VTEC est indiqué, il inclut les E. coli producteurs de vérotoxines appartenant à tous les sérogroupes. Le terme E. coli O157 est utilisé, quant à lui, lorsque l'on fait référence à des souches de E. coli de ce sérogroupe sans préciser l'antigène flagellaire, soit parce qu'il n'est pas connu, soit parce qu'il n'est pas spécifié dans la littérature. Enfin, le terme E. coli O157:H7 est employé quand on fait référence à la bactérie de ce sérotype particulier seulement, intéressant car fréquemment producteur de vérotoxines.

Étude clinique et pathogénicité des VTEC

Symptômes et évolution

L'incubation est normalement de trois à quatre jours, mais des périodes plus longues de cinq à huit jours ou plus courtes de un à trois jours ne sont pas exceptionnelles. Les infections au VTEC sont associées à des tableaux cliniques variés, allant de diarrhées bénignes à des colites hémorragiques pour la moitié des cas. Ces dernières se compliquent parfois au bout de quelques jours d'un syndrome hémolytique urémique. On observe plus rarement des purpuras thrombocytopéniques thrombotiques, généralement sans prodrome diarrhéique. Syndromes hémolytiques urémiques et purpuras thrombocytopéniques thrombotiques peuvent entraîner la mort. Du pus est rarement trouvé dans les selles et la fièvre est inhabituelle pendant les épisodes de diarrhée. Les symptômes rétrocèdent généralement au bout de deux semaines. Il est probable que les cas de diarrhées non hémorragiques soient plus nombreux que ceux effectivement rapportés, compte tenu de leur moindre gravité. Une faible proportion des infections, habituellement entre 2 et 7 %, mais jusqu'à 30 % selon une publication anglo-saxonne, évolue réellement en syndrome hémolytique urémique [1]. Les enfants de moins de 5 ans et, à un moindre degré, les personnes âgées sont plus sujets à développer le syndrome hémolytique urémique. Ce dernier est caractérisé par une anémie hémolytique micro-angiopathique, une thrombocytopénie, une insuffisance rénale et des symptômes nerveux centraux. C'est une affection sévère, nécessitant souvent une réanimation du patient, avec 3 à 5 % de mortalité chez les jeunes enfants et 12 % de séquelles rénales sévères, de lésions neurologiques ou d'hypertension [2].

Le purpura thrombocytopénique thrombotique, quant à lui, doit être considéré comme une extension du syndrome hémolytique urémique avec en plus de la fièvre, une thrombopénie importante, de sérieux désordres neurologiques et circulatoires. Il affecte plus souvent les enfants et son pronostic est sombre. Le taux de syndromes hémolytiques urémiques dans les infections sporadiques à E. coli O157:H7 avec diarrhées sanglantes est estimé à 10 %. Il dépasse 10 % parmi les personnes ayant des diarrhées sanglantes assez sévères pour décider une hospitalisation [1, 3].

Facteurs de virulence

Les VTEC ont plusieurs facteurs de virulence actuellement bien connus. Ils produisent une ou plusieurs vérotoxines, possèdent le gène d'attachement et d'effacement (eaeA), des hémolysines apparentées à l'hémolysine a et un plasmide codant pour une protéine de 60 MDa pour les souches E. coli O157:H7.

* Vérotoxines. Les VTEC sont caractérisés par leur capacité à produire une ou plusieurs cytotoxines appelées vérotoxines car elles sont capables de tuer in vitro les cellules Vero ou HeLa en stoppant de façon irréversible leur multiplication par inhibition de la synthèse protéique. Elles sont regroupées sous le terme de vérotoxines, appelées également Shiga-like toxin en raison de leurs similitudes avec la toxine de Shigella dysenteriae type 1. Actuellement, une nouvelle nomenclature les nomme toxines STX.

Des études ont montré qu'il existait plusieurs types de vérotoxines : STX1, STX2 (les plus fréquentes) et plusieurs variants de STX2 (STX2c et STX2e) [4]. STX2c est surtout retrouvée chez les souches de E. coli impliquées dans la maladie de l'œdème du porc. L'effet cytopathogène de la vérotoxine STX1 est neutralisé par des anticorps anti-Shiga toxin, les deux protéines ayant des activités biologiques similaires [5]. En revanche, STX2 et les variants de STX2 sont antigéniquement différents de STX1, leur action n'est pas neutralisable par l'antisérum polyclonal anti-Shiga toxin. La majorité des VTEC produisent STX2 avec ou sans STX1, une minorité produisant STX1 seule.

L'homologie entre STX1 et STX2 (séquences nucléotidiques et acides aminés) varie de 55 à 60 % avec des régions de faible ou de très haute homologie. Ces gènes stx1 et stx2 sont composés d'une sous-unité A et de sous-unités B, organisées en un seul opéron. La sous-unité A code pour la sous-unité A de la toxine. Il s'agit d'une enzyme qui coupe le lien glycosidique au site 4234 de l'ARN ribosomal 28S appartenant à la sous-unité ribosomale 60S des cellules hôtes, bloquant ainsi l'élongation peptidique. Les 5 sous-unités B fixent la toxine au niveau d'un glycolipide membranaire des cellules, appelé globotriosylcéramide (Gb3). Certains variants de STX2, cependant, se lieraient plus facilement aux globotétraosylcéramides (Gb4) [3].

Ainsi, dès que la toxine est attachée au récepteur cellulaire par les sous-unités B, sa sous-unité A entre dans la cellule et inhibe la synthèse protéique, entraînant dans certains cas la mort cellulaire. Les gènes de structure codant pour les toxines STX1 et STX2 sont portés par des bactériophages convertisseurs (les souches lysogénisées par ces phages acquièrent la capacité de produire la toxine correspondante) [5]. Les gènes de la Shiga toxin de Shigella dysenteriae type 1 ressemblant par leurs structures et leurs fonctions à STX1 sont situés sur le chromosome [6].

De très grandes quantités de vérotoxines peuvent être mises en évidence dans les selles de malades atteints de diarrhées hémorragiques ou de syndromes hémolytiques urémiques, mais aussi dans les selles de malades sans diarrhées hémorragiques. Les vérotoxines sont à l'origine de la destruction des cellules intestinales, surtout du côlon, expliquant les épisodes nombreux de diarrhées aqueuses puisque les cellules intestinales ont perdu leur capacité d'absorption des liquides, fonction normale de celles-ci. Lorsque les vérotoxines endommagent la paroi des vaisseaux du côlon, les malades présentent du sang dans les selles (diarrhées hémorragiques) [3].

Les vérotoxines injectées par voie intraveineuse à des souris se localisent dans l'intestin mais aussi dans la moelle épinière et le cerveau et, d'une manière générale, dans tous les organes possédant les sites ou récepteurs d'attachement des vérotoxines. Les malades présentant de graves syndromes hémolytiques urémiques ont des lésions rénales et d'autres organes comme le pancréas et le cerveau. Il a été émis l'hypothèse que ces effets systémiques sur des organes éloignés pouvaient résulter d'une distribution sanguine des vérotoxines à ces organes vitaux. Cependant, à l'heure actuelle, il n'y a pas de preuve évidente de la présence de vérotoxines dans le sang des patients atteints d'infection au VTEC ou ayant de graves complications.

* Attachement et effacement. Des études ont montré que les VTEC ont la capacité de causer des lésions d'attachement et d'effacement (A/E) et possèdent le gène « d'attachement et d'effacement » ou eaeA localisé sur le chromosome. Ce dernier code pour une protéine de la membrane externe, l'intimine, qui provoque une accumulation de microfilaments d'actine plus ou moins dépolymérisés aux zones de contact cellules-bactéries, causant des lésions d'attachement-effacement dans la muqueuse intestinale. Selon Pearson et al. [7], pendant l'attachement la cellule se comporte comme un véritable socle très solidaire de la bactérie. Dans les jours qui suivent, la bactérie pénètre dans les espaces intercellulaires entraînant une ulcération, un gonflement des tissus atteints et la destruction (effacement) des microvillosités. Même si les études faites en laboratoire ont pu dévoiler quelques aspects du mécanisme d'adhésion des VTEC aux cellules intestinales, il reste encore à l'heure actuelle à élucider quels sont les autres facteurs également mis en cause dans ce processus d'attachement-effacement [2].

* Hémolysine. Une hémolysine est produite par toutes les souches de E. coli O157:H7 et par environ 90 % des souches de VTEC. L'entérohémolysine (E-Hly), produite par E. coli O26, semblerait être génétiquement et immunologiquement distincte de l'a-hémolysine de E. coli. Elle est codée par un bactériophage convertisseur. L'hémolysine spécifique de E. coli O157 est apparentée à l'hémolysine a. Son gène est porté par un plasmide de 90 Kpb appelé pO157 [8].

Épidémiologie

La plupart des infections à E. coli O157:H7 sont d'origine alimentaire. Il est vrai toutefois que la transmission de type oro-fécal et interhumaine a été citée dans la littérature, mais elle demeure rare. C'est la raison pour laquelle nous nous limiterons dans ce chapitre à l'origine alimentaire et à l'étude des aliments responsables d'infections à E. coli O157:H7.

Accidents alimentaires et aliments responsables

De 1982 à 1993, 19 accidents alimentaires à E. coli O157:H7 ont été répertoriés aux États-Unis. Ils sont apparus dans des écoles, des centres de soins journaliers, des maisons de retraite et des prisons. Ces accidents alimentaires ont pu être mis en évidence grâce à l'émergence de nombreuses hospitalisations dues à des syndromes hémolytiques urémiques ou des purpuras thrombocytopéniques thrombotiques, ou plus généralement des diarrhées hémorragiques. La plupart de ces accidents alimentaires étaient dus à des aliments d'origine bovine et, plus précisément, à des steaks hachés qui avaient eu une cuisson insuffisante pour inactiver ou détruire les coliformes. D'une manière générale, quand la viande est impliquée dans ces accidents, soit elle est insuffisamment cuite, soit elle est restée pendant une durée suffisamment longue à une température permettant la croissance bactérienne [2].

En janvier 1993, la plus grande épidémie à E. coli O157:H7 est survenue dans l'État de Washington ; quelques cas ont également été mis en évidence dans le Nevada, en Californie et en Idaho. Tous ces accidents étaient rattachés à une même origine alimentaire : des hamburgers commercialisés par des restaurants appartenant à une même chaîne de restauration rapide. Au total, 732 personnes ont été infectées. Parmi elles, 195 ont été hospitalisées et 55 ont développé un syndrome hémolytique urémique ou un purpura thrombocytopénique thrombotique ; il y eut 4 morts. L'âge moyen des malades était de 7 ans et demi. Depuis lors, d'autres épidémies à E. coli O157:H7 sont apparues aux États-Unis et ont mis également en cause des steaks hachés de bœuf insuffisamment cuits [9-11].

Les steaks hachés de bœuf ont également été à l'origine d'épidémies à O157:H7 au Royaume-Uni [12], mais le plus grave accident alimentaire survenu dans ce pays a concerné plus de 100 Écossais en 1994. L'infection était associée à la consommation de lait très certainement contaminé après pasteurisation [13].

Un accident important survenu dans le Missouri entre décembre 1989 et janvier 1990 était, quant à lui, certainement rattaché à l'eau de boisson. E. coli O157 n'a pu être isolé des échantillons d'eau analysés, mais le nombre de malades a décliné de manière spectaculaire après la chloration de l'eau. C'est ainsi que Swerdlow et al. [14] ont émis l'hypothèse d'une contamination de l'eau par des eaux d'égout lors de travaux de réparation des canalisations.

Un autre cas d'accident alimentaire et de syndrome hémolytique urémique a été cité dans le Massachusetts en 1991. La maladie était associée à l'absorption de cidre de pommes non fermenté. Le cidre de pommes utilisé aux États-Unis est comparable au jus de fruits consommé en France, à la différence toutefois que les pommes sont simplement ramassées sur le sol et ne sont pas du tout lavées avant leur utilisation. D'autre part, ce cidre de pommes n'était pas pasteurisé et aucun conservateur n'était ajouté. Des études complémentaires ont montré que E. coli O157 était tout à fait capable de survivre pendant plusieurs jours dans des cidres de pommes réfrigérés présentant un pH inférieur à 4 [15, 16]. La même année (1991), en Angleterre, était isolée dans des yaourts au lait cru une souche de E. coli O157:H7, à l'origine de 49 malades dont 11 étaient des enfants de moins de 10 ans ; 5 d'entre eux ont développé un syndrome hémolytique urémique.

Pour illustrer encore l'extrême variété des aliments pouvant être responsables des accidents à E. coli O157, citons également l'exemple de cette mayonnaise expliquant l'émergence de nombreux cas de syndromes hémolytiques urémiques en 1993 aux États-Unis. Weagant et al. [17] ont démontré par la suite la possibilité qu'avait E. coli O157 de survivre pendant un temps court dans une mayonnaise stockée à 25 °C et pendant des périodes longues lorsque cette mayonnaise était stockée à des températures de réfrigération.

Un autre exemple d'accident alimentaire met en cause cette fois-ci des produits végétaux, et plus particulièrement des salades. Cet accident est survenu dans le Maine et concernait une famille dont les habitudes alimentaires consistaient à ne manger que des légumes produits dans le jardin, ce dernier étant régulièrement fertilisé avec le fumier de la vache et du veau de l'exploitation [16]. Bien que la présence de E. coli O157 n'ait pu être démontrée dans des échantillons de selles des deux animaux responsables, ces derniers présentaient des taux importants d'anticorps anti-E. coli O157. D'autre part, E. coli O157:H7 a pu être isolé dans le sol fertilisé du jardin. Selon Cieslak et al. [16], il est important de garder à l'esprit que les engrais d'origine animale (fumier) peuvent contenir des souches de E. coli O157:H7. Il faudrait par conséquent éviter de contaminer les récoltes, les salades et les fruits en n'utilisant plus ce type d'engrais.

L'importante épidémie survenue au Japon en juillet 1996 a concerné 9 000 malades, dont 6 000 enfants scolarisés dans la ville de Sakaï et 2 000 autres dans des crèches à Habikino près d'Osaka. Neuf enfants sont morts à la suite d'un syndrome hémolytique et urémique. L'aliment incriminé n'est pas encore déterminé de manière formelle. Cependant, il y a de fortes présomptions qu'il s'agisse de pousses de radis mises en culture dans une ferme à Habikino [18].

Le Center for Diseases Control d'Atlanta estime que 20 000 infections avec 250 morts sont liées à E. coli O157:H7 aux États-Unis [3].

Les VTEC sont également des agents pathogènes importants dans les pays de l'hémisphère Sud, comme l'Argentine, l'Australie et l'Afrique du Sud. Outre le sérotype O157:H7, les sérotypes les plus fréquemment rencontrés sont O26, O111 et O103.

En France, une étude sur les patients atteints de syndrome hémolytique urémique hospitalisés entre 1975 et 1991 a pu mettre en évidence six souches de VTEC isolées dans les selles de 69 enfants. Ces six souches étaient toutes du sérotype O103:H2. Ce sérotype est communément associé à la diarrhée chez les lapins. Cependant, une étude génotypique menée chez les souches de lapins interdit l'hypothèse d'une transmission horizontale du lapin vers l'homme [19]. D'une manière générale, la situation en France est mal connue avec des phénomènes épidémiques de faible importance. Plusieurs éclosions de cas groupés de syndromes hémolytiques urémiques ont été signalées (Tarn-et-Garonne en 1989, Oise en 1992, Cher en 1992-1993, Ardèche en 1994). L'épidémie de l'Oise a concerné 10 enfants ayant un âge moyen de 6 ans. Le VTEC O111:H38 a pu être isolé chez 5 enfants. La transmission interhumaine et la consommation d'un aliment commun actuellement non identifié ont été suggérées. L'épidémie du Cher (4 cas incluant 3 enfants de moins de 2 ans atteints d'un syndrome hémolytique urémique) a pu être reliée à une origine alimentaire : fromage frais au lait cru de fabrication artisanale. L'épidémie de l'Ardèche (4 cas) est en cours d'investigation.

Fréquence de E. coli O157:H7 et des VTEC
chez l'animal et dans les denrées alimentaires

* Chez l'animal. Une étude de E. coli isolé d'animaux malades en Angleterre et au Pays de Galles entre 1986 et 1991 a été réalisée par Wray et al. [20] ; 2,8 % des souches isolées d'origine bovine, 6,1 % de celles isolées chez le mouton et 4 % des souches isolées chez le porc produisaient des vérotoxines. Les souches d'origine porcine étaient regroupées principalement dans les sérogroupes O138, O139 et O141 communément associés dans la maladie de l'œdème du porc.

Les VTEC ont été également isolés dans le tractus gastro-intestinal d'animaux sains. Dans une étude réalisée aux États-Unis, les VTEC ont été mis en évidence chez 8,4 % de vaches laitières saines et 19 % de génisses et de veaux [21]. Des résultats similaires ont été obtenus dans une étude canadienne qui indiquait que le taux d'infection des cheptels variait de 0 à
60 % pour les vaches et de 0 à 100 % pour les veaux [22]. Les souches de VTEC isolées dans ces différentes études appartenaient à différents sérogroupes, dont certains étaient connus pour être pathogènes pour l'homme.

Ces résultats suggèrent que les bovins constituent un réservoir pour la diffusion des VTEC.

Outre les VTEC, de nombreuses études ont concerné le seul sérotype O157:H7. Ce dernier a été isolé dans des cheptels apparemment sains, et plus précisément des veaux laitiers et des vaches laitières. Selon Garber et al. [23], les veaux seraient trois fois plus susceptibles d'héberger des E. coli O157:H7 après le sevrage qu'avant. À l'occasion d'une étude dans 28 États différents des États-Unis, concernant plus de 1 000 cheptels de vaches laitières et incluant l'examen d'échantillons de fèces provenant de 7 000 veaux non sevrés, E. coli O157:H7 ont pu être isolé chez 25 veaux appartenant à 19 cheptels. Dans une étude ultérieure, Zhao et al. [24] ont pu montrer que 11 cheptels préalablement négatifs pour E. coli O157:H7 devenaient positifs pour cette bactérie ; inversement, 7 des cheptels positifs pour la présence de E. coli O157:H7 se retrouvaient 3 mois après négatifs. Ces résultats suggèrent que l'infection des cheptels à E. coli O157:H7 est transitoire et qu'elle nécessite l'examen de nombreux animaux sur une période assez longue.

Ainsi, il semblerait que les VTEC non-O157 soient plus répandus chez l'animal que les E. coli O157:H7. Mais la pauvreté de la bibliographie sur les VTEC non-O157 explique qu'à l'heure actuelle nous ne sachions pas si réellement les VTEC non-O157 doivent dans tous les cas être considérés comme pathogènes pour l'homme.

* Fréquence dans les denrées alimentaires. La fréquence importante des VTEC chez les animaux explique la présence de ces bactéries dans les denrées alimentaires. Dans une étude menée au Royaume-Uni, E. coli O157:H7 a été isolé dans de la viande hachée de bœuf (3,7 %), porc (1,5 %), volaille (1,5 %), agneau (2 %). Dans une autre étude, les VTEC non-O157:H7 ont été isolés dans de la viande de bœuf (23 %), porc (4 %), agneau (48 %), veau (63 %), poulet (12 %), dinde (7 %), poisson (10 %) et coquillage (5 %). D'une manière générale, la contamination des denrées alimentaires par les VTEC est toujours plus importante que leur contamination par le seul sérotype O157:H7 [9].

* Doses infectieuses. Le nombre de bactéries nécessaires pour produire l'infection semble être bas et la maladie peut apparaître après l'ingestion de moins de 100 bactéries. En effet, dans l'important accident alimentaire à O157:H7 survenu aux États-Unis en 1993, seulement
40 bactéries par gramme ont provoqué la maladie. D'autre part, dans un épisode récent survenu au Pays de Galles, seulement 2 bactéries par 25 grammes ont été isolées de la viande hachée à l'origine de l'accident alimentaire. En outre, Burnens et al. [25] rapportent une infection à O157:H7 acquise au laboratoire mettant en cause un très faible nombre de bactéries [2].

Méthodes d'isolement et d'identification des E. coli O157:H7 et des VTEC dans l'aliment

De nombreuses techniques permettant l'isolement et la détection des E. coli vérotoxiques dans les aliments ont été mises au point. D'une manière générale, elles peuvent être divisées en trois catégories : l'utilisation des caractéristiques biochimiques spécifiques à E. coli O157:H7 (c'est-à-dire l'incapacité à fermenter le sorbitol et une activité b-glucuronidase négative), l'utilisation de sondes ADN-spécifiques des vérotoxines ou de marqueurs associés aux E. coli producteurs de vérotoxines, des tests immunologiques utilisant des anticorps dirigés contre les vérotoxines ou l'antigène O157:H7 avec l'utilisation conjointe de membranes filtrantes hydrophobes.

Isolement et détection de E. coli O157:H7

* Utilisation des caractéristiques biochimiques de E. coli O157:H7. La plupart des réactions biochimiques de E. coli O157:H7 sont typiques des E. coli, avec l'exception toutefois du sorbitol et de l'activité
b-glucuronidase. Environ 93 % des souches de E. coli d'origine humaine fermentent le sorbitol en 24 heures ; à l'inverse, E. coli O157:H7 ne fermente pas le sorbitol [26]. Mais, dans différentes études récentes, les souches VTEC du sérotype O157 fermentaient le sorbitol en 24 heures. La prévalence de ces souches particulières est actuellement non connue, mais il apparaît évident que ces dernières n'auraient pu être mises en évidence par les méthodes officielles de contrôle des aliments décrites ci-après.

En outre, 93 % des E. coli sont b-glucuronidase positifs ; à l'inverse, la grande majorité des VTEC ne produisent pas de b-glucuronidase [27].

Des études concernant la croissance de E. coli O157:H7 dans le bouillon trypticase-soja ont montré que cette bactérie se développait rapidement à des températures comprises entre 30 et 42 °C, avec un temps de génération de 0,49 heure à 37 °C atteignant 0,64 heure à 42 °C.

Ainsi, cette bactérie croît difficilement à des températures de 43-44 °C et ne présente aucune croissance au bout de 48 heures à 10 ou 45 °C [28]. Les méthodes d'isolement et de dénombrement des coliformes fécaux dans les aliments utilisent des températures d'incubation de 44 °C à 45 °C. À ces températures, E. coli O157:H7 ne pourrait pas être détecté.

Le fait que la dose infectieuse de E. coli soit basse a obligé les chercheurs à mettre au point des systèmes d'identification suffisamment sensibles (en tout cas plus sensibles qu'un simple repiquage) et les a conduit à développer de nombreux milieux d'enrichissement pour permettre aux cellules bactériennes de se multiplier jusqu'à des niveaux détectables.

De nombreux milieux d'enrichissement pour les VTEC O157 ont été étudiés. Citons notamment une modification du bouillon trypticase-soja additionné de novobiocine ou d'acriflavine pour réduire le nombre des organismes à Gram positif. Un autre milieu d'enrichissement consiste en de l'eau peptonée tamponnée additionnée de vancomycine, de cefsulodine et de céfixime pour empêcher la croissance des bactéries à Gram négatif comme Aeromonas spp. et Proteus spp. [29].

Après croissance dans le milieu d'enrichissement, un grand nombre de méthodes peuvent être utilisées pour la détection des colonies de E. coli O157.

Dans le but de réduire notamment la durée des analyses microbiologiques et pour éviter les faux négatifs associés aux systèmes de détection rapide (interférences avec la matrice alimentaire et bruits de fond des autres micro-organismes présents dans l'aliment, manque de sensibilité), de nombreuses équipes de chercheurs se sont intéressées au développement de techniques de type séparation-concentration. Ces techniques sont représentées notamment par la centrifugation, la filtration, des systèmes bio-absorbants à base de lectine, des systèmes biphasiques aqueux et les ultrasons.

Il semblerait que la technique la plus efficace soit la séparation immunomagnétique. Son utilisation peut réduire le temps total de l'analyse tout en augmentant la sensibilité de la détection. Des particules paramagnétiques couvertes d'anticorps spécifiques de l'organisme cible sont ajoutées à l'échantillon d'aliment à analyser. L'organisme cible est capturé à la surface des particules magnétiques et l'ensemble est retiré de l'aliment par application d'un champ magnétique. Les organismes cibles sont ainsi séparés, par centrifugation, des débris alimentaires et des micro-organismes qui peuvent interférer avec les différents systèmes de détection. En rediluant les cellules cibles ainsi isolées dans un volume inférieur à celui duquel elles proviennent, on obtient un effet de concentration des cellules bactériennes et on augmente ainsi l'apparente sensibilité des systèmes de détection.

Après enrichissement, les billes sont généralement mises en culture sur des milieux sélectifs.

E. coli O157:H7 ne fermente pas le sorbitol à l'opposé des autres E. coli. Cette propriété biochimique a justifié l'utilisation de la gélose MacConkey au sorbitol (SMAC). Les modifications de la gélose MacConkey au sorbitol ont été mises au point dans l'objectif d'augmenter le caractère sélectif vis-à-vis de O157 VTEC.

Okrend et al. [27] ont montré que l'addition de 5 bromo-4 chloro-indoxi-b-D-glucuronide (BCIG) ajouté à raison de 0,1 g/l à une gélose MacConkey sorbitol favorise l'isolement de E. coli O157 inoculé volontairement dans des échantillons de viande de bœuf. En effet, le BCIG permet de différencier les colonies b-glucuronidase-positives de celles qui sont négatives. E. coli 0157:H7 présente des colonies sorbitol-négatives et b-glucuronidase-négatives ; ces colonies restent blanches alors que les colonies sorbitol-négatives et b-glucuronidase-positives virent au vert ou au bleu. L'ajout de BCIG à la gélose SMAC réduit par conséquent le nombre de faux positifs de 36 % par rapport à la simple utilisation du SMAC sans BCIG. En effet, E. coli O157:H7 a pu être isolé à partir de 11 des 12 échantillons de viande inoculés en utilisant le SMAC-BCIG contre 8 sur 12 avec la seule utilisation du SMAC sans BCIG.

Thompson et al. [30] ont développé un test rapide fluorescent pour la détection de E. coli O157. Ce test utilise la 4-méthylumbelliféryl b-D-glucuronide comme indicateur hydrolysé en un composé fluorescent par l'enzyme b-glucuronidase.

Zadik et al. [31] ont décrit une autre modification dans laquelle le SMAC contient du tellurite et du céfixime parce que les concentrations minimales inhibitrices sont plus élevées pour les O157 VTEC que pour les autres E. coli et les bactéries sorbitol-négatives telles que Aeromonas, Plesiomonas, Morganella morganii, Providencia spp. et Hafnia alvei.

* Tests immunologiques utilisant des anticorps dirigés contre l'antigène O157. Les tests immunologiques sur colonies ont été employés pour détecter E. coli O157. Les cultures sont étalées sur des géloses et les colonies transférées sur des membranes de nitrocellulose. Un antisérum O157 conjugué à la phosphatase alcaline est utilisé pour détecter les colonies positives.

L'empreinte immunologique de chacune de ces membranes de nitrocellulose était réalisée en utilisant un antisérum dirigé contre E. coli O157:H7. Les colonies positives étaient confirmées comme appartenant réellement au sérotype O157:H7 par des tests biochimiques, l'utilisation d'un antisérum dirigé contre les antigènes O157 et H7 et le contrôle de la cytotoxicité sur les cellules Vero. D'après Doyle et Schoeni [32], cette méthode peut permettre l'isolement d'un faible nombre de bactéries (1,5 E. coli par gramme d'aliment). Mais elle est difficile d'utilisation parce qu'elle exige une grande technicité et demande beaucoup de temps. Un autre inconvénient serait son manque de spécificité. En effet, l'antisérum polyclonal O157 réagit également avec Brucella abortus, Brucella melitensis, Yersinia enterocolitica sérogroupe 0:9, Salmonella groupe N et Pseudomonas maltophilia 555 [33]. L'épitope commun à toutes ces bactéries responsables des réactions croisées est le sucre 4-amino-4,6 didésoxy-D-mannose présent sur le lipopolysaccharide [20].

Un test d'agglutination rapide avec des particules de latex (E. coli latex test, Oxoid Ltd) est désormais disponible. Il permet une détection rapide d'Escherichia coli appartenant au sérogroupe O157. March et Ratman [34] ont évalué ce test d'agglutination utilisant des souches de E. coli O157:H7 d'origine clinique.

Padhye et Doyle [8] ont décrit, quant à eux, un système immuno-enzymatique sandwich Elisa (EHEC-Teck, Organon Tecknica) pour la détection des O157 VTEC dans l'aliment. Dans ce test, des anticorps polyclonaux anti-O157 sont utilisés comme anticorps de capture ainsi qu'un anticorps monoclonal marqué à la peroxydase (Mab 4E8C12), certifié comme spécifique pour la détection des VTEC appartenant aux sérogroupes O157 et O6 [29].

Méthode de détection de la production de vérotoxine ou des gènes codant les vérotoxines

* Effet cytopathogène des vérotoxines. Le pouvoir cytopathogène des vérotoxines est mis en évidence sur les lignées cellulaires Vero [35]. Ainsi peuvent être testés des échantillons fécaux, des cultures cellulaires et des aliments. Les colonies se développent en bouillon trypticase-soja ; les cultures filtrées sont ajoutées à la lignée cellulaire Vero. Ces dernières prennent une forme ronde et se détachent les unes des autres en présence de vérotoxines. Dans des études récentes, la croissance des VTEC dans des milieux, dépourvus de fer permet la production augmentée des STX1 mais pas des STX2. Pour les tests de routine, les concentrations de vérotoxines obtenues dans les bouillons décrits plus haut sont suffisantes. Une grande quantité des vérotoxines n'est pas libérée dans les milieux mais reste liée à la bactérie. Elle peut être relarguée par sonication, par l'utilisation d'une presse de Franck ou par traitement à la polymyxine. Ces techniques ont été utilisées pour la préparation de grandes quantités de vérotoxines. Aucun VTEC ne peut être trouvé en l'absence de vérotoxines libres dans le milieu alors que les vérotoxines peuvent être présentes sans que l'on puisse isoler la bactérie [36].

* Tests immunologiques. Pour confirmer que l'effet cytopathogène exercé sur les cellules Vero est effectivement dû aux vérotoxines, il faut réaliser des tests de neutralisation en utilisant des anticorps dirigés contre les STX1 et les STX2. La thermostabilité de la toxine devra également être confirmée après chauffage à 100 °C pendant 15 min des échantillons.

Quelques techniques Elisa permettant la détection des vérotoxines ont été décrites. Les systèmes permettant la fixation des vérotoxines sont variés : des glycolipides contenant un composé terminal a D-Gal-(1 => 4)-D-Gal, le céramide globotriosyl (Gb3), lyso-Gb3 et le liquide des vésicules hydatiques provenant de moutons infectés par Echinococcus granulosus. Dans d'autres études, les anticorps monoclonaux antivérotoxine ont été utilisés. En général, ces tests sont moins performants parce que moins sensibles que le test utilisant les cellules Vero. En outre, comme ces toxines ont des propriétés antigéniques très variables, une grande vigilance doit exister à l'occasion du choix des réactifs lorsque l'on se propose de détecter toutes les vérotoxines dans un échantillon [3].

* Tests génétiques. Outre l'utilisation des anticorps dirigés contre les vérotoxines, de nombreuses sondes polynucléotidiques dérivées des gènes clonés de VT1 et VT2 ont été utilisées. Des sondes synthétiques oligonucléotidiques permettant la détection des différents gènes des vérotoxines ont également été construites.

L'amplification génique d'une partie du gène codant pour les vérotoxines utilisant la méthode PCR (polymerase chain reaction) a également été utilisée pour rechercher les VTEC dans les aliments et les selles de malades. Ces « PCR » utilisent des amorces oligonucléotidiques ciblées sur des séquences conservées des gènes eaeA, stx1, stx2.

Tous les protocoles de PCR appliqués directement sur les aliments se sont heurtés au problème des inhibiteurs de la polymérase. Pour éviter cela, il était alors nécessaire d'isoler les bactéries ou d'extraire leur ADN. Cependant, récemment, plusieurs protocoles ont été mis au point directement à partir des aliments. En diluant 1 000 fois les échantillons de viande de bœuf par exemple, il a été possible de réduire la concentration des composés inhibant la polymérase. Avec cette technique, même si un enrichissement de 6 heures était indispensable pour 6 des échantillons, il était alors possible de détecter 30 VTEC/ml de bouillon de culture [3].

CONCLUSION

Les infections à E. coli O157:H7 peuvent survenir à l'occasion de l'ingestion d'un faible nombre de bactéries. Le tableau clinique le plus fréquent est caractérisé par des diarrhées qui peuvent être hémorragiques dans la moitié des cas. Une faible proportion (2-5 %) des malades, surtout les enfants de moins de 5 ans ou les personnes âgées, développent un syndrome hémolytique et urémique parfois mortel. Les lésions des vaisseaux provoquées par les vérotoxines constituent, avec les lésions d'attachement et d'effacement, les principaux éléments du pouvoir pathogène des E. coli vérotoxiques. De nombreuses études révèlent que les animaux de boucherie, et surtout les bovins, représentent un réservoir très important de VTEC. Cet élément épidémiologique peut expliquer que les steaks hachés de bœuf insuffisamment cuits et les fromages au lait cru de vaches soient les aliments le plus souvent incriminés dans les accidents alimentaires à E. coli O157:H7.

Les méthodes de détection et d'isolement de E. coli O157:H7 sont nombreuses et basées essentiellement sur les particularités biochimiques de cette bactérie sorbitol-négative et b-glucuronidase-négative. Mais l'émergence de mutants sorbitol-positifs et b-glucuronidase-positifs, ainsi que l'identification d'autres sérotypes de VTEC responsables de syndromes hémolytiques et urémiques, au Canada notamment, limitent l'intérêt de ces techniques et justifient l'utilisation de méthodes qui permettent la détection et l'isolement de l'ensemble des VTEC par la mise en évidence des vérotoxines ou des gènes codant pour ces vérotoxines.

Même si, en France, E. coli O157:H7 n'est pas actuellement à l'origine d'accidents alimentaires, aucune étude épidémiologique ne permet de savoir si nos denrées alimentaires sont fréquemment contaminées. Compte tenu de la thermosensibilité de cette bactérie, les aliments « crus » de type viande hachée de bœuf, lait cru, fromages au lait cru devront être préférentiellement étudiés, tout en gardant à l'esprit que les denrées à pH acide peuvent être potentiellement dangereuses du fait de la grande tolérance à l'acidité de E. coli O157:H7.

Remerciements. L'auteur tient à remercier Évelyne Dimier pour son travail de secrétariat.

Article reçu le 5 février 1999, accepté le 27 mars 1999.

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