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XXIV e FORUM DE CANCÉROLOGIE


Bulletin du Cancer. Volume 91, Numéro 6, 471-568, Juin 2004, XXIVe FORUM DE CANCÉROLOGIE



ARTICLE

Recherche fondamentale

n 1

Étude transcriptomique in vivo de l’action de l’hormone thyroïdienne sur la différenciation, la migration, l’apoptose et la prolifération des cellules du cervelet

Flamant F1, Walker R2, Meltzer P2, Samarut J1

1 Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire de l’Ecole Normale Supérieure de Lyon UMR CNRS 5665 LA INRA913, IFR 128 Lyon Gerland, 46 allée d’Italie, 69364 Lyon Cedex 07, France ;
2 Cancer Genetics Branch NHGRI/NIH Bethesda MD, USA.

L’hormone thyroïdienne (T3) contrôle le développement des neurones et cellules gliales du cerveau à de multiples niveaux. Elle active la prolifération et la migration des précurseurs des neurones granulaires du cervelet tout en limitant leur apoptose et en stimulant l’arborisation des cellules de Purkinje. Elle favorise également la différenciation des précurseurs d’oligodendrocytes et la prolifération des astrocytes. T3 agit directement au niveau transcriptionnel en se fixant à des récepteurs nucléaires (TR), encodés par les deux gènes TRα et TRβ. Très peu des gènes contrôlés par T3 dans les différents types cellulaires sont aujourd’hui connus. Dans le but d’établir un recensement exhaustif de ces gènes, nous avons utilisé des biopuces portant 19 000 fragments d’ADN couvrant une majorité du transcriptome de la souris. Nous avons construit une base de données contenant plus de 500 000 mesures de niveau d’expression de gène dans le cervelet de souris différant par leur génotype (TRα KO, TRβ KO, sauvage), leur âge, et leur statut hormonal. L’hypothyroïdie congénitale a été provoquée soit par un traitement au propyl-thio-uracyl, soit en utilisant la mutation KO du gène Pax8, qui conduit à une agenèse de la thyroïde. L’analyse de la banque de données, inachevée, a déjà permis d’identifier de nouveaux gènes cibles potentiels de la T3 dans le cervelet, et les résultats d’hybridation sur biopuces ont été confirmés et complétés par RT-PCR quantitative. Ces nouvelles données offre un nouvel apercu sur la régulation génétique du développement normal du cervelet.

n 2

Regulation of epithelial-mesenchymal transition by ARF6 GTPase

Janssens B1, Aresta S2, Chavrier P1

1 Institut Curie, Membrane and Cytoskeleton Dynamics, CNRS UMR144, 26 rue d’Ulm, 75248 Paris Cedex 05 ;
2 Hybrigenics, 3-5 impasse Reille, 75014 Paris.

When epithelial cells detach from each other during early stages of cell migration or invasion, the adherens junction (AJ) complex (consisting of transmembrane cadherin and anchoring catenin proteins) is disassembled. This process is known as epithelial-mesenchymal transition (EMT). One of the ways to induce EMT of epithelial cells is by treatment with HGF (scatter factor), where the small GTPase ARF6 has recently been proposed as an important mediator. We recently found the tyrosine phosphatase LAR-PTP, a constituent and regulator of the AJ complex, to specifically interact with activated ARF6. In two independent yeast two-hybrid screenings, using human and Drosophila ARF6-Q67L (which share 96 % identity) as baits, we identified an interaction with a LAR-PTP C-terminal domain. Human and Drosophila LAR-PTPs share an overall 48 % identity, while the identified ARF6 binding domains are 89 % identical. This points to evolutionary conserved pathways in which ARF6 binding influences LAR-PTP function. We confirmed the interaction by co-immunoprecipitation of the second LAR phosphatase domain with HA-tagged ARF6-Q67L. By use of the LAR-specific antibody 11.1 detecting endogenous LAR-PTP in HeLa and MCF-7 cells, we could also co-immunoprecipitate ARF6-Q67L-HA. We found LAR-PTP to be only weakly expressed at cell-cell contacts in confluent epithelial cells. In order to find a functional implementation of the interaction between ARF6 and LAR-PTP, we studied the activity of LAR-PTP in MDCK Tet-Off cells stably transfected with ARF6 mutants. Cells expressing ARF6-T27N-HA show no morphological change, whereas ARF6-Q67L-HA clearly induces cell scattering. We are currently addressing the consequence of targeting domains of LAR-PTP to the adherens junction by overexpression of chimeric fusions with N-cadherin. In particular, it will be interesting to study changes in tyrosine phosphorylation of beta-catenin, an important substrate of LAR-PTP. Increased tyrosine phosphorylation of beta-catenin is known to inhibit the E-cadherin adhesion system at the invasive front of cancers.
An effect of ARF6 activation on beta-catenin phosphorylation would be an indication for implication of ARF6 in cancer progression.

n 3

Mécanisme de régulation de la réponse transcriptionnelle aux rétinoïdes

Flajollet S1, Lefebvre B1, Cambula L1, Formstecher P1, Rachez C1, Lefebvre P1

1 Equipe « labellisée » Ligue nationale cantre le cancer, Inserm U459, Faculté de Médecine H. Warembourg, Pôle recherche, 59045 Lille.

Les rétinoïdes, molécules impliquées dans des processus biologiques fondamentaux tels que la croissance cellulaire et la différenciation, sont de puissants anticancéreux et anti-inflammatoires, dont l’usage est restreint par leurs effets secondaires. Ils exercent leurs effets par le biais de facteurs de transcription, les récepteurs nucléaires (RAR et RXR) dont l’activité est conditionnée par le recrutement de complexes multi-protéiques (coactivateurs et corépresseurs) ayant des fonctions diverses. La cinétique de l’assemblage et l’importance fonctionnelle relative de ces différents complexes dans le mécanisme de transactivation par les rétinoïdes sont encore assez peu connus à ce jour.
L’utilisation des rétinoïdes de synthèse in vitro a permis de mettre en évidence des différences d’activités biologiques et de recrutement de certains coactivateurs, suggérant un éventuel recrutement différentiel de ces co-activateurs selon le rétinoïde utilisé. Nous nous sommes donc focalisés sur deux co-activateurs qui sont impliqués dans deux étapes distinctes du processus d’activation de la transcription par le RAR. Nous avons inhibé l’expression de ces protéines par la technique du siRNA dans les cellules pluripotentes de tératocarcinome P19. Ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules neuronales après traitement à l’acide rétinoïque. Après induction de ces cellules knocked-down pour l’un ou l’autre coactivateur, nous avons pu caractériser les effets sur l’expression des gènes régulés par les rétinoïdes, l’apoptose et la différenciation cellulaire.
Cette approche permet d’apprécier la contribution respective de ces deux co-activateurs dans la réponse transcriptionnelle aux rétinoïdes et dans des processus biologiques tels que l’apoptose et la différenciation cellulaire.

n 4

L’inhibition de la glycogène synthétase kinase-3β est un nouveau mécanisme de chimiorésistance du carcinome hépatocellulaire

Beurel E, Kornprobst M, Blivet-Van Eggelpoël MJ, Cadoret A, Capeau J, Desbois-Mouthon C

Inserm U402, Faculté de Médecine Saint-Antoine, 27 rue Chaligny, 75571 Paris Cedex 12. 
E-mail : beurel@st-antoine.inserm.fr.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente la cinquième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement résistant à la chimiothérapie. Dans ce contexte, il apparaît important d’approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à sa chimiorésistance. Récemment, nous avons mis en évidence une inhibition constitutive par phosphorylation de la glycogène synthétase kinase-3β (GSK-3β) dans certaines lignées d’hépatomes humains (telles que Hep3B) ainsi qu’au cours de la carcinogenèse hépatique murine [1, 2]. Ban et al. [3] ont par la suite rapporté une hyperphosphorylation de la GSK-3β dans des échantillons de CHC humains. Dans les lignées d’hépatomes, nous avons montré que l’inhibition de la GSK-3β est le résultat d’une boucle autocrine impliquant l’activation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K).
L’objectif du présent travail était d’examiner la contribution de l’inhibition de la GSK-3β à la chimiorésistance des hépatomes. Dans les cellules HepG2, nous avons observé que l’inhibition de la GSK-3β avec le lithium ou le SB-415286 confère une résistance à l’apoptose induite par la camptothécine ou l’étoposide, deux drogues utilisées en chimiothérapie. Cette résistance résulte de l’incapacité des agents anticancéreux à activer la p53 (localisation et activité nucléaires), la voie des récepteurs de mort (expression membranaire de Fas, activité de la caspase-8) ainsi que la voie mitochondriale (translocation de Bax, relargage cytosolique du cytochrome c, activité de la caspase-3). Réciproquement, nous avons montré que, dans la lignée Hep3B qui présente une inhibition constitutive de la GSK-3β, la réactivation de la GSK-3β par le LY294002, un inhibiteur de la PI3K, ou par surexpression d’une GSK-3β constitutivement active, augmente la sensibilité des cellules aux effets cytotoxiques des agents anticancéreux. La réactivation de la GSK-3β potentialise l’apoptose induite par les agents anticancéreux en augmentant l’expression du récepteur de mort DR5, l’activation de la caspase-8 et de la voie mitochondriale. L’ensemble de ces résultats suggère que la GSK-3β est un important régulateur de la chimiosensibilité du CHC en agissant sur les voies pro-apoptotiques médiées par les récepteurs de mort et la mitochondrie [4]. Ces données pourraient permettre à plus long terme d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques du CHC.

1. Desbois-Mouthon C, Blivet-Van Eggelpoel MJ, Beurel E et al. Hepatology 2002 ; 36 : 1528-36.

2. Boissan M, Beurel E, Wendum D et al., soumis.

3. Ban KC, Singh H, Krishnan R et al. Cancer Letter 2003 ; 199 : 201-8.

4. Beurel E, Kornprobst M, Blivet-Van Eggelpoel MJ et al., soumis.

n 5

La déposition ciblée de l’histone H3.3 précède l’activation de la transcription sur un promoteur cible de E2F, le promoteur DHFR

Daury L, Chailleux C, Trouche D

Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote, UMR5099, CNRS et Université Paul Sabatier, IFR 109, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 4, France.

La protéine du rétinoblastome (Rb) est mutée dans environ 30 % de l’ensemble des tumeurs et d’une manière ou d’une autre sa fonction est perdue dans la quasi-totalité des cancers. L’étude de cette protéine et de ses partenaires peut donc apporter de nombreuses informations sur les processus de tumorigenèse.
La protéine Rb fonctionne notamment en contrôlant la progression des cellules vers la phase S du cycle cellulaire. Une de ses cibles majeures est le facteur de transcription E2F qui est impliqué dans l’activation à la transition G1/S de gènes dont les produits sont requis pour la progression dans la phase S. Dans les cellules quiescentes et au début de la phase G1 du cycle cellulaire, la transcription de ces gènes est réprimée par les protéines de la famille Rb.
La répression transcriptionnelle de promoteurs cibles de E2F dans les cellules quiescentes est associée à la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3, une marque épigénétique de la chromatine réprimée. A la fin de la phase G1, cette modification n’est plus détectable, indiquant l’existence d’un événement de déméthylation. Comme aucune histone déméthylase n’est connue, cette déméthylation pourrait se produire par le remplacement des histones.
Nous avons montré que sur le promoteur DHFR (dihydrofolate reductase), régulé par E2F, un variant de l’histone H3, appelé H3.3, est déposé spécifiquement durant la progression en phase G1. A notre connaissance, nos résultats sont la première démonstration d’une telle déposition sur un promoteur endogène transcrit par l’ARN polymérase II. Ce ciblage pourrait faire intervenir le facteur de transcription E2F, puisque E2F1 peut interagir à la fois avec l’histone H3.3 et son chaperon HIRA, qui permet sa déposition de façon indépendante de la réplication. De plus, la déposition de H3.3 a lieu avant l’activation de la transcription du promoteur DHFR, indiquant que cette déposition n’est pas seulement une conséquence de la transcription.
Nos résultats suggèrent donc que la déposition contrôlée des histones participe à la régulation de l’expression des gènes peut-être en permettant d’enlever les marques épigénétiques pré-existantes.

n 6

Kinetochore localisation of spindle checkpoint proteins : who controls whom ?

Vigneron S, Prieto S, Bernis C, Labbé JC, Castro A, Lorca T

CRBM-CNRS, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier.

In eucaryotes, a series of control systems, termed checkpoints, ensure the maintenance of genomic integrity. The spindle checkpoint modulates the events required for chromosomes segregation by preventing anaphase onset until all the chromosomes have successfully attached to the spindle microtubules. This metaphase-to-anaphase delay is mediated by the inhibition of the E3 ubiquitin ligase APC. Unattached kinetochores are believed to release an activated form of a mitotic checkpoint complex that inhibits APC-dependent ubiquitination and subsequent proteolysis of components needed for anaphase onset. The mechanisms by which unattached kinetochores trigger a primary signal and how this signal is transmitted by the spindle checkpoint are poorly understood, however it seems to be dependent on the kinetochore localisation of the different checkpoint components. By using protein immunodepletion and mRNA translation in Xenopus egg extracts we have studied the hierarchic sequence and the interdependent-network that governs protein recruitment at the kinetochore in the spindle checkpoint pathway. Our results show that the first regulatory step of this cascade is represented by Aurora B. This kinase controls the activation of a second regulatory level by inducing the formation at the kinetochore of a protein complex that includes at least Mps1, Bub1 and CENP-E. This complex, in turn, promotes the recruitment at this chromosomal structure of Mad1/Mad2, Cdc20 and the APC. Unlike Aurora B, Mps1, Bub1 and CENP-E, the downstream checkpoint protein Mad1 does not regulate the kinetochore localisation of either Cdc20 or APC indicating the presence of two different branches in the third regulatory level of the spindle checkpoint pathway. Finally we demonstrate that the Cdc20 and the APC kinetochore recruitments are independently regulated by the spindle checkpoint pathway. We would further speculate that the capacity of Aurora-B to control the kinetochore localisation of all the analysed checkpoint proteins might play an important role in the APC inhibition during the spindle checkpoint.

n 7

Mechanism of APC-dependent degradation of X-kid and Aurora-A protein kinase

Castro A, Vigneron S, Bernis C, Labbé JC, Lorca T

CRBM-CNRS, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier.

We have investigated the degradation of two different proteins required to regulate cell cycle : Aurora A and Xkid. Aurora-A is a mitotic spindle pole associated protein that has been implicated in duplication and separation of centrosomes, as well as in spindle assembly. Overexpression of this protein kinase induces polyploidy and centrosome amplification The proper timing and amplitude of Aurora-A expression seems to be important to control cell cycle. Using Xenopus oocyte extracts, we demonstrate that degradation of Aurora-A is mediated by the APC and is regulated by Fizzy-Related. Moreover this proteolysis depends on a D-Box at its C-terminal domain and on a new degradation sequence, the “Dbox-Activating Domain” (DAD) at the N-terminus of this kinase, the latter probably mediating recognition of the Dbox sequence by the APC. Xkid, is a kinesin-related protein required at metaphase for chromosome congression and whose degradation is required at anaphase to induce chromosome segregation. We demonstrate that Xkid is degraded both, in vitro and in vivo, by APC/Cdc20 and APC/Cdh1. We identify a domain within the C-terminus of this chromokinesin, with sequence GxEN, whose mutation completely stabilises this protein by both APC/Cdc20 and APC/Cdh1. We show that this degradation sequence acts as a transposable motif and induces the proteolysis of a GST-GxEN fusion protein.
On the basis of these results, a detailed study will be required to establish the degradation signal that targets the proteolysis of every new APC substrate. It is likely that number of new degradation signals will be enlarged by futures studies and will reveal the presence of a complex association network of APC/Cdc20 and APC/Cdh1 with their different substrates.

n 8

Endemic versus epidemic viral spreads display distinct patterns of intraindividual HTLV-2b replication

Gabet AS1, Moulés V1, Sibon D1, 2, Nass CC3, Mortreux F1, Gessain A4, Murphy EL5, Wattel E1, 2

1 Oncovirologie et Biothérapies, UMR5537-CNRS-Université Claude Bernard, Centre Léon Bérard, Lyon, France ;
2 Service d’Hématologie, Pavillon E, Hôpital Edouard Herriot, Lyon, France ;
3 American Red Cross Blood Services, Chesapeake Region, Baltimore, Maryland, USA ;
4 Unité d’Epidémiologie et Physiopathologie des Virus Oncogènes, Institut Pasteur, Paris, France ;
5 University of California, San Francisco, Laboratory Medicine, San Francisco, California, USA.

By analyzing HTLV-2 replication in vivo we show that, in asymptomatic carriers, both the circulating proviral loads and the degree of infected cell proliferation are largely lower than those characterizing asymptomatic carriers infected with leukemogenic deltaretroviruses (HTLV-1, STLV-1, BLV). These differences contribute to explain the lack of known link between HTLV-2 infection and the development of malignancies. However, such link has not been investigated in endemically infected individuals such as Bakola Pygmies from Cameroon. In this population, characterized by a long viral residence (> 20,000 years), breast-feeding is the major route of infection. We compared the replication pattern of the same HTLV-2b subtype between these endemically infected individuals and epidemically infected American blood donors, who are characterized by a short viral residence (~ 30 years) whereas needle sharing, transfusion and sexual contacts are the major routes of dissemination. The pattern of HTLV-2b replication in vivo was strongly different between endemically and epidemically infected individuals. The former regularly displayed high proviral loads resulting from the extensive proliferation of infected cells whereas the latter had low or very low proviral loads associated with a weaker degree of clonal expansion. Early and/or prolonged infection, viral genetic drift, h ost immune response, genetic background, co-infections or a combination thereof might have contributed to these differences. As the clonality pattern observed in endemically infected individuals is very reminiscent of that of leukemogenic deltaretroviruses at the preleukemic stage, our results highlight the possible oncogenic effect of HTLV-2b infection in such population.

Supported by the Ligue Nationale Contre le Cancer (Equipe labellisée 2003).

n 9

Preleukemic inactivation of hTERT transcription by the viral oncoprotein Tax

Gabet AS1, Mortreux F1, Charneau P2, Riou P3, Duc-Dodon M3, Wu Y4, Jeang KT4, Wattel E1, 5

1 Oncovirologie et Biothérapies, CNRS UMR 5537, Centre Léon Bérard, 28 rue Laennec 69373 Lyon Cedex 08 France ;
2 Groupe de Virologie Moléculaire et Vectorologie, Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 1 ;
3
 Immuno-Virologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5537, Faculté de Médecine Lyon Laennec, 69372 Lyon Cedex 8 ;
4 Laboratory of Molecular Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA ;
5 Service d’Hématologie, Pavillon E, Hôpital Edouard Herriot, Place d’Arsonval, 69437 Lyon Cedex 03, France.

Telomerase expression is the hallmark of tumor cells in which this ribonucleoprotein complex preserves chromosome integrity by maintaining telomere length and thereby prevents cell death. However, recent data support a role of the combination of p53 and telomerase inactivation in initiating genetic instability that promotes malignant transformation. Through its pleiotropic effects on infected T cell metabolism, the human T cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) oncoprotein Tax plays a central role in leukemogenesis. Here we show that Tax inhibits human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription, which is the rate-limiting factor of telomerase activity. This inhibitory effect, that occurs in competition with c-Myc through a canonical c-Myc binding site within the hTERT promoter, results in a decreased telomerase activity of Tax-expressing cells. This is the first demonstration of hTERT inhibition by an oncogene. Tax, which is only expressed in preleukemic cells, triggers infected T cell cycle and keeps these cells cycling while inactivating p53. We propose that, in combination with these effects, hTERT repression by Tax at an early phase of carcinogenesis might contribute to the massive ploidy changes associated with the development of HTLV -1 associated malignancies.

Supported by the Ligue Nationale Contre le Cancer (Equipe labellisée 2003)

n 10

Fate of premalignant clones during the asymptomatic phase preceding lymphoid malignancy

Moules V1, Pomier C1, Sibon D1, 2, Gabet AS1*, Reichert M3, Kerkhofs P4, Willems L5, Mortreux F1, Wattel E1, 2

1 Oncovirologie et Biothérapies, UMR5537 CNRS-Université Claude Bernard, Centre Léon Bérard, Lyon, France ;
2
 Service d’Hématologie, Pavillon E, Hôpital Edouard Herriot, Place d’Arsonval, Lyon, France ;
3 Department of Pathology, National Veterinary Research Institute, Pulawy, Poland ;
4 Department of Virology, Veterinary and Agrochemical Research Centre, 1180 Uccle, Belgium ;
5 Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques, Gembloux, Belgium.

Almost all cancers are preceded by a prolonged period of clinical latency during which a combination of cellular events help move carcinogen-exposed cells towards the malignant phenotype. Hitherto, investigating the fate of premalignant cells in vivo remained strongly hampered by the fact that these cells are usually indistinguishable from their normal counterparts. Here for the first time, we have designed a strategy able to reconstitute the replicative history of the bona fide premalignant clone in an animal model, the sheep experimentally infected with the lymphotropic bovine leukemia virus. We have demonstrated that premalignant clones are early and clearly distinguished from other carcinogen-exposed cells on the basis of their degree of clonal expansion and genetic instability. Detectable as early as 0.5 months after the beginning of carcinogen exposure, premalignant cells displayed a two-step pattern of extensive clonal expansion together with a mutation load ~ 6 times higher than that of other carcinogen-exposed cells that remained untransformed during the lifespan of investigated animals. There was no fixation of somatic mutations over time, suggesting that they regularly lead to cellular death, partly contributing to maintain a normal lymphocyte count during the prolonged premalignant stage. This equilibrium was finally broken after a period of 18.5 to 60 months of clinical latency, when a dramatic decrease in the genetic instability of premalignant cells coincided with a rapid increase in lymphocyte count and lymphoma onset.

Supported by the Ligue Nationale Contre le Cancer (Equipe labellisée 2003)

n 11

La surexpression de l’ADN polymérase β stimule la recombinaison homologue dépendante de Rad 51

Canitrot Y1, Capp JP1, Puget N1, Bieth A1, Lopez B2, Hoffmann JS1, Cazaux C1

1 Equipe Instabilité génétique et cancer, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, UMR CNRS 5089, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse, France ;
2
 Département Radiobiologie et Radiopathologie, 60-68 av. Gal Leclerc, UMR CNRS-CEA 217, 92265 Fontenay-aux-Roses, France.

L’ADN polymérase β (Polβ) est une enzyme qui participe au fonctionnement de la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Cependant, elle se trouve surexprimée dans certaines tumeurs, notamment du sein, du côlon et de la prostate. Notre équipe a montré que la surexpression de Polβ génère de l’instabilité génétique en perturbant soit la synthèse de l’ADN génomique, soit les voies protectrices du génome. De plus, elle induit une forte instabilité chromosomique et une tumorigenèse accrue, ainsi qu’une amplification de l’instabilité génétique après exposition aux radiations ionisantes qui pourrait être expliquée par une altération de la recombinaison homologue (RH).
La RH est une des voies de réparation de l’ADN dont la perturbation peut provoquer un phénotype cellulaire tumoral. Pour évaluer l’effet de Polβ sur la RH, nous avons utilisé des cellules contenant un substrat de recombinaison intrachromosomique unique dans lesquelles nous avons surexprimé cette enzyme. Nous avons montré que la surexpression de Polβ engendre une augmentation de RH de 5 à 10 fois. Cette augmentation est corrélée à un nombre plus élevé de cassures double brin sur l’ADN, démontré par le test des comètes et la détection de la forme phosphorylée de l’histone H2AX. Ces cassures pourraient être des substrats de recombinaison, comme le montre la présence d’un nombre plus important de foyers de la protéine de RH Rad51. L’élévation de RH est liée à une augmentation de la fréquence des événements de conversion génique (dépendants de Rad51) d’environ 4 fois et est inhibée lorsqu’on supprime cette voie de réparation grâce à l’utilisation d’un mutant dominant négatif de Rad51. De plus, les événements de RH engendrés sont dépendants de l’activité catalytique de Polβ, ce qui suggère l’intervention de cette enzyme dans la réplication de l’ADN génomique in vivo dans un contexte de surexpression. Cette hypothèse est confirmée par l’utilisation d’un système inductible de Polβ qui permet d’observer une augmentation de RH après seulement 3 jours d’induction.
Ces résultats permettent de mieux comprendre le rôle que pourraient jouer les ADN polymérases et leur dérégulation dans l’instabilité génétique des cellules cancéreuses et donc dans le processus tumoral.

n 12

Vectorisation de protéines thérapeutiques par les dodécaèdres de l’adénovirus

Fender P1, Garcel A1, Gout E1, Timmins J2, Weissenhorn W2, Chroboczek J1

1 Institut de Biologie Structurale, 41 rue Horowitz, 38027 Grenoble ;
2 Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire, rue des Martyrs, 38000 Grenoble.

Objectif. Transfert direct de protéines thérapeutiques dans les cellules humaines à l’aide de vecteurs pseudo-viraux.
Méthode. Aux douze sommets de l’icosaèdre adénoviral se trouve un complexe non covalent appelé le penton. Ce penton est composé de deux protéines : la fibre et la base du penton. La fibre reconnaît un récepteur primaire avec une forte affinité et permet à la base du penton d’interagir avec les intégrines cellulaires et ainsi induire l’endocytose virale. La co-expression de la base du penton et de la fibre de l’adénovirus de sérotype 3 (Ad3) dans le système de baculovirus donne naissance à des complexes protéiques symétriques dodécaédriques : les dodécaèdres (Dd). Nous étudions les propriétés d’endocytose de ces Dd et nous les modifions afin d’apporter des molécules thérapeutiques dans les cellules.
Résultats. De façon remarquable, ces complexes dodécaèdriques constitués d’uniquement une ou deux protéines de l’adénovirus et dépourvus de toute information génétique entrent dans les cellules humaines avec une efficacité supérieure à celle de l’adénovirus sauvage. Cette particularité vient du fait que les Dd interagissent d’une part avec les récepteurs adénoviraux (CD46, intégrines) mais également avec un récepteur supplémentaire, les héparanes sulphate, qui sont exprimés de façon ubiquitaire à la surface des cellules. De façon intéressante, nous pouvons jouer sur le tropisme des Dd en modifiant leurs fibres pour cibler d’autres récepteurs.
Récemment, nous avons apporté la preuve de principe que les Dd pouvaient apporter des molécules de grandes tailles comme les immunoglobulines dans des cellules épithéliales en culture et nous développons actuellement des stratégies visant à attacher des molécules d’intérêt thérapeutique à ces particules pseudo-virales. Ce vecteur se révèle être d’une efficacité incomparable avec une capacité de transfert moyen de 107 protéines d’intérêt par cellule. Actuellement nous caractérisons le sort des protéines thérapeutiques après transfert intracellulaire. Nous nous rapprochons également du cadre thérapeutique en développant le transfert direct de la protéine p53 par les dodécaèdres dans des cellules p53 déficientes afin d’étudier si notre stratégie permet de restaurer un phénotype anti-tumoral.

Conclusion. Les caractéristiques des dodécaèdres (absence d’information génétique, tropisme interchangeable, forte efficacité d’internalisation) en font des vecteurs de transfert intéressants. Des protéines de grande taille comme des immunoglobulines peuvent être transloquées dans les cellules à l’aide des dodécaèdres, montrant ainsi l’intérêt biotechnologique et thérapeutique de nos vecteurs. Cette méthode originale de vectorisation de protéines est évaluée actuellement dans des stratégies anti-tumorales avec la protéine p53 et nous espérons à terme juger de son efficacité dans des modèles in vivo.

n 13

The papillomavirus replicative helicase E1 is a target of the ubiquitin ligase APC

Hsu CY, Mechali F, Castro A, Lorca T, Bonne-Andrea C

CRBM-CNRS, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier.

Papillomaviruses are small DNA tumor viruses that cause benign and malignant lesions of the skin, most notably cervical cancer. Maintenance of the viral genome as a circular episome in the nucleus of infected basal epithelial cells is essential for the viral life cycle and the ensuing pathology.

A constant event, correlated with malignant transformation, is the integration of viral genome DNA into the host genome. Autonomous replication of papillomavirus genomes depends on the viral replication factor E1 which was shown to be one of the factors required to specifically prevent integration. We investigated the regulation of the bovine papillomavirus E1 protein and found that E1 is a substrate of the ubiquitin-dependent proteolytic pathway. We show that E1 is targeted for degradation by the Anaphase-Promoting Complex (APC). Inhibition of APC activity by the specific inhibitor Emi1 or point mutations in the destruction motifs (D-box and KEN-box) of E1 stabilize the protein and increase viral DNA replication in both a cell-free system and in living cells. Furthermore, we found that E1 binds to two adaptators of the APC, Cdc20 and Cdh1, and inhibits APC-mediated cyclin B degradation in vitro. Thus E1 elimination caused by any unbalance of APC regulators would abrogate autonomous replication and cause integration. Conversely, because APC regulators are low-abundance, rate-limiting components, a drop of E1 levels might have deleterious effects by compromising the regulation of the endogenous cellular targets of the APC.

These findings involve APC as the ubiquitin ligase that controls E1 levels to maintain a constant low copy number of the viral genome during latent infection ; Further studies are now required to investigate whether E1 affects the host cell cycle and contributes to the oncogenic potential of papillomaviruses.

n 14

Flexibilité et stabilité, deux facteurs déterminants de l’activité du récepteur aux œstrogènes

Bouter A, Le Tilly V, Sire O

L2PIC, CER Y. Coppens, Campus de Tohannic, BP573, 56017 Vannes Cedex.

Les œstrogènes sont impliqués dans le développement de tumeurs chez l’homme au niveau du sein, de l’utérus, du côlon et de la prostate. Dans la majorité des cas, leur action est médiée par l’intermédiaire du récepteur aux œstrogènes (ER). Deux isoformes α et β du récepteur co-existent : ils présentent une localisation tissulaire et une affinité pour les œstrogènes distinctes. L’ER contrôle l’expression d’un ensemble de gènes impliqués dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. La formation de tumeurs liées au ER serait due soit à une sur-activité, soit à une sur-expression telle qu’il s’en produit dans un cancer du sein sur deux. La régulation des gènes cibles résulte de la fixation du récepteur à une séquence cible sur l’ADN, appelée élément de réponse aux œstrogènes (ERE). De nombreuses études menées in vitro comme in vivo ont permis de définir une séquence ERE consensus (EREcs) pour laquelle l’ER présente la plus forte affinité : 5’AGGTCAnnnTGACCT3’. Or la caractérisation récente de nombreux gènes œstrogènes-dépendants a démontré l’omniprésence de motifs de reconnaissance dégénérés par rapport à cette séquence consensus. Quid des conséquences en termes de régulation de la transcription ?
Par des approches conjointes, relevant de la biophysique moléculaire et cellulaire menées in vitro et in vivo, nous avons abordé l’étude d’un modèle biologique homologue composé du récepteur aux œstrogènes et du gène vitellogénine de la truite arc-en-ciel. Un ERE imparfait (rtERE) a ainsi été identifié comme seul cis-élément de régulation par le récepteur aux œstrogènes. Cet rtERE (5’GGGGCAnnnTAACCT3’) présente une séquence fortement dégénérée par rapport à la séquence consensus. Par reconstitution du mécanisme transcriptionnel chez la levure, nous avons montré que la présence de cet rtERE dans le promoteur conduit à une plus faible (40 %) activation de la transcription mais à une meilleure stimulation par l’œstradiol (3 X) comparées à l’EREcs.
La capacité de fixation de l’isoforme α du récepteur aux œstrogènes humain (hERα) sur un ADN contenant soit l’EREcs, soit le rtERE a été mesurée par anisotropie de fluorescence. Aux faibles concentrations salines (I = 80 mM), les constantes de dissociation à l’équilibre sont similaires (KD ≈ 2 nM), quelle que soit la séquence ERE. En revanche, pour de plus fortes concentrations salines (I ≥ 140 mM), l’affinité du complexe hERα-ERErt diminue fortement alors que celle du complexe hERα-EREcs est peu affectée. La nature des interactions stabilisant ces complexes est donc majoritairement coulombienne dans le cas de hERα-rtERE, comparé à hERα-EREcs. Des mesures cinétiques (à I = 140 mM) montrent que le complexe spécifique hERα-rtERE présente un temps de vie plus court (≈ 19 s) -et donc une stabilité plus faible- que le complexe hERα-EREcs (33 s). Des études de dynamique moléculaire (extinction de fluorescence) montrent de plus que la flexibilité globale de hERα est corrélée à l’affinité (fixation de l’ERE et/ou concentration saline croissante). Ainsi, une plus faible stabilité du complexe hERα-rtERE, associée à une moindre flexibilité de l’hER, est sans doute à l’origine de la sensibilité accrue à l’hormone, telle qu’observée in vivo. Se pose alors la question de l’impact de cette instabilité sur le recrutement des cofacteurs indispensables à l’activation de la transcription. La stabilité et la flexibilité des complexes moléculaires ne peuvent être dissociées si l’on veut progresser dans la compréhension des mécanismes des régulations biologiques. Cette vision, associant étroitement affinité, flexibilité et durée de vie, constitue sans doute une clé pour le design de nouveaux modulateurs sélectifs de l’activité des récepteurs aux œstrogènes (SERMs) dans la thérapie contre les cancers.

n 15

L’activité séparase est requise en méiose I femelle chez la souris

Terret ME1, Wassmann K2, Waizenegger I3, Maro B2, Peters JM3, Verlhac MH1

1 Divisions Méiotiques, UMR 7622, Université Paris VI ;
2 Biologie Moléculaire et Cellulaire du Développement, UMR 7622, Université Paris VI ;
3 Research Institute of Molecular Pathology (IMP) Dr.Bohr-Gasse 7, 1030 Vienne, Austria.

Nous étudions au laboratoire la maturation méiotique de l’ovocyte de souris, processus essentiel à la formation des gamètes femelles haploïdes, les ovules. Si le déroulement du cycle cellulaire ainsi que ses mécanismes de régulation sont connus et étudiés depuis longtemps, les processus contrôlant la maturation méiotique le sont moins. La mitose conduit à l’obtention de deux cellules filles ayant le même contenu en ADN et permet la multiplication clonale des cellules. Des dérèglements de ce processus peuvent conduire à la multiplication anarchique des cellules et à un processus de cancérisation. La méiose est une succession de deux divisions sans synthèse d’ADN « intercalaire », la première division étant réductionnelle et la seconde équationnelle, afin d’obtenir des gamètes ayant la moitié du contenu en ADN par rapport à la cellule mère. Des défauts dans ce processus peuvent conduire à des problèmes de stérilité féminine, ainsi qu’à la formation d’embryons aneuploïdes ou trisomiques, mettant en danger la survie de l’espèce. Il est donc très important de comprendre les mécanismes de régulation de la maturation méiotique. Au cours de la mitose, le contenu en ADN de la cellule va s’organiser en chromosomes condensés qui vont s’aligner sur la plaque métaphasique du fuseau de division afin d’être séparés en deux masses égales à l’issue de la division cellulaire. Il existe un mécanisme de contrôle qui permet à la cellule de rester bloquée en métaphase tant que tous les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque métaphasique, évitant ainsi une séparation trop précoce et anarchique des chromatides sœurs et assurant que le contenu en ADN est bien séparé en deux fractions égales. En méiose, des résultats contradictoires ont été publiés quant à l’existence d’un point de contrôle de ce type contrôlant la séparation des chromosomes homologues lors de la première division de méiose. Chez des espèces comme le nématode et la levure, il a été montré qu’un tel point de contrôle existe et est fonctionnel en première division de méiose, alors que chez le xénope ce point de contrôle ne semble pas être fonctionnel. Chez la souris, organisme le plus proche de l’homme, des arguments indirects allant en faveur et en défaveur de l’existence de ce point de contrôle existaient. Nous avons montré que la dégradation induite par le protéasome, qui dégrade les cibles du point de contrôle, est requise pour effectuer la transition métaphase I/anaphase I, les ovocytes incubés dans une drogue inhibant le protéasome s’arrêtant en métaphase I. L’activité séparase, une activité indirectement régulée par ce point de contrôle, est également requise pour effectuer la transition métaphase I/anaphase I au cours de la première division de méiose. Les ovocytes microinjectés avec un inhibiteur de séparase font la transition métaphase I/anaphase I mais ségrègent mal leurs chromosomes homologues dans 100 % des cas. Ces défauts sont visibles en métaphase II où l’ovocyte comporte un mélange de chromosomes bivalents de méiose I et de chromosomes monovalents de méiose II. Enfin la microinjection de la sécurine, l’inhibiteur de la séparase in vivo, induit un blocage des ovocytes en métaphase I à 70 %. 30 % des ovocytes font la transition métaphase I/anaphase I et ont un phénotype identique à ceux injectés avec l’inhibiteur de séparase, un mélange de chromosomes bivalents et monovalents en métaphase II. Ces résultats montrent que l’activité séparase est requise pour effectuer la transition métaphase I/anaphase I au cours de la méiose I, suggérant que ce point de contrôle est fonctionnel chez la souris, même s’il ne paraît pas aussi fort qu’en mitose.

n 16

L’acide ursolique induit l’apoptose via la voie mitochondriale, sur les cellules M4Beu issues d’un mélanome humain

Harmand PO, Duval R, Simon A, Delage C

Biomolécules, UPRES EA 1085, Service de Chimie Physique, Faculté de Pharmacie, 2 rue du Docteur Marcland, 87025 Limoges Cedex, France.

Sur les cellules M4Beu issues d’un mélanome humain, nous avons étudié les effets antiprolifératif et pro-apoptotique de l’acide ursolique (AU), triterpène contenu dans certains fruits et plantes, de façon à envisager l’utilisation de cette biomolécule dans le traitement et/ou la prévention de ce type de cancer.
A l’aide de la technique du bleu Trypan, nous avons mis en évidence le potentiel antiprolifératif dose et temps-dépendants de l’AU sur les cellules M4Beu : après 24 et 48 heures de traitement, les IC50 sont respectivement de 18 µM et 13 µM. Ces données nous ont amenés à présenter dans la suite de cette étude uniquement les résultats obtenus pour une gamme de concentrations de 10 à 20 µM d’AU et pour une période d’exposition de 24 heures.
Nous avons montré que cet effet antiprolifératif était la conséquence d’une mort cellulaire par apoptose. En effet, l’activité enzymatique de la caspase-3, caspase exécutrice majeure, est très significativement augmentée : d’un facteur de 2,12 pour 15 µM d’AU. Pour caractériser la voie de transduction qui conduit à l’activation de cette caspase, nous avons étudié les activités des caspases initiatrices, -8 et -9, impliquées respectivement dans la voie des récepteurs de mort et la voie mitochondriale. Nos résultats montrent que seule l’activité de la caspase-9 est augmentée (d’un facteur de 1,2 pour 15 µM d’AU), ce qui suggère que l’AU stimule la voie mitochondriale. Pour confirmer l’implication de cette voie, nous avons évalué la chute du potentiel mitochondrial, perturbation cellulaire qui marque un point de non-retour dans la mort par apoptose. Cette étude, réalisée en cytométrie de flux par double marquage à l’aide des fluorochromes JC-1/TOTO-3, a révélé que l’AU induisait de manière dose-dépendante une chute de potentiel : 65 % des cellules présentent un bas potentiel lorsqu’elles sont traitées avec 15 µM d’AU. La chute du potentiel mitochondrial s’accompagne habituellement d’une libération dans le cytoplasme de molécules apoptogènes, en particulier du cytochrome c. Par marquage immunocytochimique in situ nous avons montré que l’AU induisait la libération de cette molécule. Cette libération est régulée à partir de la mitochondrie par des protéines de la famille Bcl-2 (Bax : pro-apoptotique et Bcl-2 : anti-apoptotique). A l’aide de la technique du Western Blot, nous avons montré que l’AU induisait une augmentation dose-dépendante de l’expression de la protéine Bax et de manière concomitante une diminution dose-dépendante de celle de la protéine Bcl-2 : le rapport Bax/Bcl-2 des cellules traitées avec 15 µM d’AU, est augmenté d’un facteur de 1,94 par rapport à celui des cellules témoins, ce qui confirme de manière indiscutable, l’effet pro-apoptotique de l’AU via la voie mitochondriale.
Du fait de sa large distribution dans le règne végétal et dans certains aliments, l’AU pourrait être un composé intéressant dans le traitement et/ou la prévention du mélanome.

n 17

La kinase Eg3 phosphoryle CDC25B sur la sérine 169 et contribue à la régulation du point de contrôle G2/M

Mirey G1, Dozier C1, Quaranta M1, Froment C2, Monsarrat B2, Tassan JP3, D ucommun B1

1 LBCMCP-CNRS UMR5088-IFR109, Institut d’Exploration Fonctionnelle des Génomes, Université Paul Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse ;
2 IPBS-CNRS UMR5089 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse ;
3 CNRS UMR6061-IFR97 Génomique Fonctionnelle et Santé, Université de Rennes I, 2 avenue du Pr Léon Bernard, 35043 Rennes.

Les dommages sur l’ADN entraînent l’activation de points de contrôle, conduisant à l’arrêt réversible du cycle cellulaire. L’absence de ces points de contrôle est un facteur de prédisposition à l’instabilité génomique et à l’apparition de cancers. L’inactivation des phosphatases CDC25, acteurs centraux de la régulation des kinases CDK/cyclines, est un événement essentiel de mise en place du point de contrôle à la transition G2/M du cycle cellulaire. Nous avons étudié le rôle et la régulation de la protéine CDC25B lors de ce point de contrôle en mettant en œuvre des approches biochimiques, moléculaires et cellulaires.
Nous montrons dans différents types cellulaires qu’après lésions de l’ADN par le radiomimétique bléomycine, la phosphatase CDC25 est phosphorylée sur la sérine 169. Singulièrement, cette phosphorylation de CDC25B ne dépend pas des kinases de checkpoint classiquement impliquées (Chk1 et Chk2), mais dépend de la kinase Eg3 (membre de la famille des kinases KIN1/PAR-1/MARK). En effet, nous montrons que la phosphorylation de CDC25 Ser169 n’est pas inhibée par les siRNA dirigés contre les kinases Chk1 ou Chk2, mais est affectée dans les cellules HeLa transfectées par un siRNA dirigé contre Eg3. Par ailleurs, in vitro, la kinase Eg3 phosphoryle CDC25B et l’analyse en spectrométrie de masse confirme que cette phosphorylation se produit sur la Ser169. Les modalités moléculaires de mise en en jeu de cette nouvelle voie de régulation après lésions de l’ADN, ainsi que la nature des conséquences fonctionnelles de son activation restent à caractériser. Ces questions font l’objet de nos travaux actuels.

n 18

Régulation du récepteur de l’acide rétinoïque par une protéine du cycle cellulaire : implications dans la régulation de la croissance de cellules du cancer du sein

Martin PJ1, Lefebvre P1

1 Inserm U459, Faculté de Médecine, Pôle Recherche, 1 place de Verdun, 59045 Lille.

L’acide rétinoïque tout trans (atRA), dérivé naturel de la vitamine A, joue un rôle fondamental dans le développement embryonnaire, la différenciation et la croissance cellulaires. Ce ligand est capable de se fixer sur deux familles de récepteurs nucléaires, les retinoic acid receptors (RAR) et les retinoic X receptors (RXR), cette fixation permettant l’activation de gènes cibles entraînant diverses réponses biologiques. Parmi ces réponses, l’atRA est capable d’inhiber la croissance de cellules de cancer du sein sensibles aux estrogènes, mais le mécanisme impliqué dans ce phénomène est mal connu. Au cours d’une recherche de nouveaux partenaires protéiques du RAR, nous avons pu établir qu’il est capable d’interagir avec une protéine impliquée de façon directe dans la régulation du cycle cellulaire. Grâce à des travaux préliminaires, nous avons pu confirmer cette interaction in vitro et in vivo, en identifier les domaines et démontrer que cette protéine du cycle a un effet notable sur l’activité transcriptionnelle du RAR. La suite de nos travaux consistera à valider ces résultats dans un modèle de cellules de cancer du sein, les MCF-7, par des techniques de synchronisation du cycle et de siRNA afin de comprendre l’implication de cette interaction dans l’arrêt du cycle cellulaire induit par l’atRA dans ces cellules cancéreuses. Notamment, nous avons choisi d’étudier l’expression du gène RARβ2, qui est induite par l’atRA, qui possède toutes les caractéristiques d’un gène suppresseur de tumeur.

n 19

Mitotic catastrophe : a special case of apoptosis preventing aneuploidy

Castedo M1, Perfettini JL1, Roumier T1, Valent A2, Raslova H3, Tintignac LA1, Yakushijin K4, Horne D4, Feunteun J1, Medema R5, Lenoir G1, Vainchenker W3, Kroemer G1

1 CNRS-UMR8125 ;
2 Laboratoire de Génomique Cellulaire des Cancers ;
3 Inserm U362 Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille-Desmoulins, F-94805 Villejuif, France ;
4 Department of Chemistry, Oregon State University, Covallis, OR 97331, USA ;
5
 Department of Molecular Biology H8, Netherlands Cancer Institute, Plesmanlaan 121, 1066 CX Amsterdam, The Netherlands.

Mitotic catastrophe is a poorly defined type of cell death linked to the abnormal activation of cyclin B/Cdk1. Here we show that a conflict in cell cycle progression or DNA damage can lead to mitotic catastrophe, provided that the checkpoint kinase Chk2 is inhibited. In these conditions, cells die during the metaphase of the cell cycle, as a result of caspase activation and subsequent mitochondrial damage. Molecular ordering of these phenomena reveals that mitotic catastrophe occurs in a p53-independent fashion and involves a primary activation of caspase-2, upstream of cytochrome c release, followed by caspase-3 activation and chromatin condensation. Suppression of caspase-2 by RNA interference or pseudosubstrate inhibitors as well as blockade of the mitochondrial membrane permeabilization (MMP) prevent the mitotic catastrophe and allow cells to further proceed the cell cycle beyond the metaphase, leading to asymmetric cell division. Heterokarya generated by fusion of non-synchronized cells can be driven to divide into three or more daughter cells when Chk2 and caspases are simultaneously inhibited. Such multipolar divisions, resulting from suppressed mitotic catastrophe, lead to the asymmetric distribution of cytoplasm (anisocytosis), DNA (anisokaryosis) and chromosomes (aneuploidy). Our findings delineate a molecular pathway through which DNA damage, failure to arrest the cell cycle and inhibition of apoptosis can favor the occurrence of cytogenetic abnormalities which are likely to participate in oncogenesis.

n 20

Analyse in silico des sites de fixation du facteur de transcription c-Myc

Bichet A, Polverari D, Malpertuy A

Atragene Bioinformatics, 4, rue Pierre Fontaine, 91000 Evry (France).

Les dysfonctionnements des facteurs de transcription (FT) sont impliqués dans de nombreuses pathologies humaines dont des cancers. L’identification des sites de fixation des FT est une étape essentielle pour appréhender les mécanismes de régulation des gènes. A ce jour, le nombre de FT dans le génome humain est estimé à près de 3 000 et seuls quelques centaines de sites de fixation de FT ont été caractérisés. L’identification expérimentale de ces sites est longue et fastidieuse. Pour répondre à cette problématique, de nombreuses approches in silico d’identification de séquences régulatrices potentielles ont été développées.
Compte tenu de leur diversité, il est difficile d’utiliser une seule méthode pour détecter tous les types de séquences régulatrices. Parmi les différents algorithmes qui ont été développés, nous avons implémenté une méthode énumérative détectant les oligonucléotides de taille donnée et statistiquement sur-représentés dans un jeu de séquences promotrices, par comparaison avec un modèle de fond. Les motifs trouvés sont utilisés pour construire des matrices poids-position prenant en compte leurs variabilités. Ces matrices permettent d’annoter l’ensemble des promoteurs d’un génome. Cette approche a été validée sur des données d’organismes modèles comme la levure Saccharomyces cerevisiae et la plante Arabidopsis thaliana.
Nous nous sommes intéressés au facteur de transcription c-Myc humain. Dans un premier temps nous avons étudié un groupe de gènes dont les niveaux d’expression étaient modifiés dans des cellules où c-Myc était surexprimé. Plusieurs motifs ont été identifiés dans les 1 000 pb précédant ces gènes, dont CACGCG, une des cibles de c-Myc. Les autres sites c-Myc connus n’ont pour leur part pas été identifiés, probablement en raison de leur présence en grand nombre dans le modèle de fond. Nous nous sommes ensuite intéressés à la distribution des six séquences cibles de c-Myc dans le génome. Les 1 000 pb précédant les 18 406 gènes humains, dont le début de la transcription est caractérisé, ont été annotées. 26 000 sites de fixation de c-Myc ont été identifiés dans plus de 13 000 promoteurs. Nous avons alors sélectionné dans le génome les gènes dont les promoteurs sont enrichis en motifs c-Myc et avons tenté d’établir une relation entre leur fonction et leur régulation.
L’approche énumérative nous a permis d’identifier rapidement des motifs putatifs de régulation. Pour les mammifères, il est essentiel d’étendre l’analyse à l’échelle génomique. Nous envisageons par ailleurs de faire évoluer les fonctionnalités de cet algorithme pour prendre en compte les motifs de type dyades.

n 21

Caractérisation de la voie de signalisation Hedgehog dans les lignées cellulaires de cancer du côlon

Chatel G, Ganeff C et Winkler R

Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, CHU Sart-Tilman, Tour de Pathologie, Bat. B23 niv.0, 4000 Liège, Belgique.

La voie de signalisation Hedgehog est impliquée dans le développement du côlon, la différenciation des colonocytes chez l’adulte, ainsi que dans le développement de nombreux cancers du tractus intestinal. Nous avons donc décidé d’étudier cette voie de signalisation dans les cancers du côlon.
L’expression de la molécule signal Hedgehog (HH) a été étudiée dans 7 lignées cellulaires de cancers du côlon (Colo205, Colo320, HCT116, HT29, WiDr, SW480 et Caco-2). Par western-blot, l’expression de HH est la plus forte dans les lignées HT29, WiDr et Caco-2. L’existence de plusieurs formes de HH nous a conduit à réaliser des RT-PCR Ihh (Indian Hedgehog) et Shh (Sonic Hedgehog). Shh est exprimé dans toutes les lignées cellulaires tandis qu’Ihh est exprimé uniquement dans les lignées cellulaires où l’expression de la protéine HH est la plus forte (HT29, WiDr et SW480). L’expression des autres membres de la voie de signalisation Hedgehog a également été étudiée par RT-PCR. Les profils d’expression indiquent que la voie de signalisation ne semble pas activée, malgré la présence de HH, dans les lignées Colo205, HT29, WiDr (absence du récepteur Smoothened indispensable à la transduction du signal), SW480, Caco-2 (absence du facteur de transcription GLI1 qui active les gènes cibles de la voie). L’utilisation de vecteurs rapporteurs répondant à HH a également montré que la voie de signalisation Hedgehog n’était pas activée dans les lignées Colo320, HCT116, SW480 et Caco-2. Ce travail a donc permis de montrer une absence d’expression de IHH dans 4 lignées cellulaires de cancers du côlon. IHH est normalement impliqué dans la différenciation des cellules situées à la base des cryptes du côlon en colonocytes situés sur les crêtes. De plus la voie de signalisation Hedgehog ne semble pas activée dans les lignées cellulaires de cancers du côlon, du moins de façon GLI1-dépendante. Ces observations faites dans les lignées cellulaires devront être validées dans les tumeurs primaires. Alors que la plupart des cancers du tractus intestinal présente une suractivation de la voie de signalisation Hedgehog, il semblerait qu’une perte d’activation soit une des caractéristiques des cancers du côlon.

n 22

Rôle du facteur de transcription NF-κB au cours de l’induction de la différenciation des cellules de leucémie aiguë promyélocytaire par l’acide tout-trans rétinoïque

Mathieu J1, Giraudier S2, Besançon F1

1 Unité 496 Inserm, Centre Hayem, Hôpital St Louis, 1 avenue Claude Vellefaux, 75475 Paris Cedex 10 ;
2
 Unité 362 Inserm, Institut Gustave Roussy, Villejuif Cedex.

Le facteur de transcription NF-κB est impliqué dans le contrôle de divers processus tels que la prolifération, la survie et la différenciation cellulaires. Le but de nos travaux a été de déterminer le rôle de ce facteur au cours de l’induction par l’acide tout-trans rétinoïque (ATRA) de la différenciation granulocytaire des cellules NB4 qui constituent le modèle d’étude in vitro de la leucémie aiguë promyélocytaire (LAP). La construction de cellules NB4 exprimant un répresseur de l’activation de NF-κB nous a permis de montrer que l’activité de ce facteur, contrairement à ce qui a été observé dans d’autres systèmes de différenciation, n’est pas indispensable à la différenciation de ces cellules en granulocytes. Cependant l’inhibition de NF-κB résulte en une sensibilisation importante des cellules NB4 à l’apoptose induite par l’ATRA. Ainsi, nous observons une inhibition de la viabilité des cellules exprimant l’inhibiteur de NF-κB par rapport aux cellules parentales (30 % après 5 jours de traitement, 50 % après 8 jours). Nos travaux montrent aussi que le mécanisme d’activation de NF-κB par l’ATRA ne passe pas par la voie d’activation utilisée par la majorité des inducteurs de ce facteur de transcription. Cette voie classique fait intervenir la dégradation par le protéasome de l’inhibiteur de NF-κB, la protéine IκBα, à la suite de sa phosphorylation sur les sérines 32 et 36. L’activation de NF-κB par l’ATRA s’accompagne aussi d’une dégradation de IκBα (80 % à 72 h), mais cette dégradation ne dépend pas de la phosphorylation de IκBα sur les sérines 32 et 36.
En conclusion, nos résultats démontrent que l’activation de NF-κB est une voie de survie activée par l’ATRA. L’ATRA syndrome (RAS) observé chez 15 à 25 % des patients atteints de LAP traités par l’ATRA peut être fatal. Notre étude suggère que l’association d’inhibiteurs de NF-κB au cours du traitement de la LAP pourrait, en diminuant le temps de survie des cellules différenciées, permettre de réduire les risques d’apparition du RAS. Dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, nos travaux se poursuivent par une recherche des mécanismes précis de l’activation de NF-κB par l’ATRA.

n 23

La protéine suppressive de tumeur p14ARF active des voies de réponse aux dommages de l’ADN pour médier son activité anti-proliférative

Eymin B, Brambilla E, Gazzeri S

Groupe de Recherche sur le Cancer du Poumon, Inserm U578. Institut Albert Bonniot, 38706 La Tronche.

Le cancer du poumon représente un problème majeur de santé publique tant par son incidence que par l’échec des thérapeutiques conventionnelles. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires conduisant à l’invalidation des voies de signalisation des gènes suppresseurs de tumeurs p53 et Rb au cours de la carcinogenèse pulmonaire afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce cadre, nous nous intéressons à la protéine p14ARF qui se situe à l’interface des voies p53/Rb et participe au contrôle de l’activité de ces protéines. Nous avions précédemment démontré la capacité de p14ARF à induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M en l’absence de p53. L’objectif de cette étude était d’étudier les voies de signalisation mises en jeu. Nos résultats indiquent que l’inhibition pharmacologique des voies des MAP kinases, ERK1 et ERK2, et des checkpoint kinases, CHK1 et CHK2, prévient l’activité anti-proliférative de p14ARF. En accord avec ces données, nous montrons que p14ARF est capable d’induire l’activation de ERK1/2, CHK1 et CHK2 et que la neutralisation par ARN interférence des checkpoint kinases prévient l’activité anti-proliférative de p14ARF mais également l’activation des MAP kinases, situant ces dernières en aval des CHK kinases. A la recherche des mécanismes responsables de l’activation de CHK1 et CHK2, nous décrivons la capacité de p14ARF à activer les kinases ATM (ataxia telangiectasia mutated) et ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) et à induire la phosphorylation et l’accumulation au niveau de foyers nucléaires de certains de leurs substrats, tels que les protéines Rad17 et histone H2A.X. Enfin nous montrons que la neutralisation d’ATM/ATR par ARN interférence prévient l’activation de CHK1 et CHK2 et l’effet anti-prolifératif de p14ARF.
En conclusion, ces résultats démontrent pour la première fois la capacité de p14ARF à activer, selon un mécanisme qui reste à identifier, des voies de signalisation jusqu’alors seulement impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN. Ils situent ainsi p14ARF à l’interface des voies oncogéniques et de stress génotoxique renforcant son rôle de gène suppresseur de tumeur. Ces résultats suggèrent enfin que la perte de p14ARF observée dans les tumeurs pulmonaires neuroendocrines de haut grade de malignité pourrait contribuer à la carcinogenèse de ces tumeurs en permettant aux cellules tumorales d’échapper aux points de contrôle activés par les carcinogènes du tabac.

n 24

L’histone acétyl-transférase Tip60 est une nouvelle cible de la protéine suppressive de tumeur p14ARF

Claverie P1, Leduc C1, Eymin B1, Kochbin S2, Brambilla E1, Gazzeri S1

1 Groupe de Recherche sur le Cancer du Poumon, Inserm U578,
2 Laboratoire de Biologie moléculaire et cellulaire de la différentiation Inserm U309, Institut Albert Bonniot, 38706 La Tronche Cedex.

Le cancer du poumon est un problème de santé publique majeur. Face à l’échec des traitements actuels, l’objectif de notre équipe est de rechercher certaines des cibles moléculaires de la sélection clonale de ces cancers afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce cadre nous nous intéressons à la protéine p14ARF qui se situe à l’interface des voies de signalisation des gènes suppresseurs de tumeurs p53 et RB invalidées dans tous les cancers broncho-pulmonaires. Nos résultats récents ont mis en évidence une nouvelle voie de signalisation de p14ARF conduisant à l’inhibition de la croissance cellulaire (arrêt en G2 et apoptose) dans un contexte indépendant de p53 [Eymin B et al., Oncogene 2003]. La présente étude a pour but d’identifier certaines des cibles moléculaires impliquées dans la capacité antiproliférative de p14ARF. Nos résultats mettent en évidence une accumulation de l’histone acétyl-transférase (HAT) Tip60 sous l’effet de p14ARF qui corrèle avec une augmentation de sa demi-vie et une inhibition de son ubiquitylation médiée par l’oncoprotéine Mdm2. Par ailleurs, nous montrons que p14ARF interagit avec Tip60 in vitro et in vivo et inhibe son activité HAT envers les protéines histones. De façon très intéressante, la neutralisation de Tip60 par ARN interférence prévient l’arrêt en G2 induit par p14ARF mais stimule également l’apoptose en réponse à p14ARF démontrant l’implication de Tip60 dans la capacité antiproliférative de p14ARF. En conclusion ces résultats identifient la protéine Tip60 comme une nouvelle cible de p14ARF et nous conduisent à considérer la signalisation par acétylation comme un nouveau mécanisme de transformation cellulaire.

n 25

p14ARF induit un arrêt en G2 et l’apoptose indépendamment de p53 conduisant à la régression de tumeurs établies chez la souris nude

Eymin B, Leduc C, Coll JL, Brambilla E, Gazzeri S

Groupe de Recherche sur le Cancer du Poumon, Inserm U578, Institut Albert Bonniot, 38706, La Tronche Cedex.

Le cancer du poumon résulte de l’accumulation séquentielle d’anomalies génétiques et épigénétiques au niveau de gènes clés de contrôle des voies de prolifération cellulaire et de survie, dont les gènes suppresseurs de tumeurs p53 et RB font partie. Le gène INK4a/ARF présente la particularité de coder pour deux protéines différentes contrôlant l’une la voie p53 (p14ARF) et l’autre la voie RB (p16INK4a), mettant en évidence l’existence d’interconnexions étroites entre ces deux voies. Nous avons précédemment observé une inactivation conjointe des protéines p53 et p14ARF dans les tumeurs bronchiques neuroendocrines de haut grade suggérant que ces anomalies n’étaient pas redondantes sur une même voie de signalisation et que p14ARF pouvait présenter des fonctions biologiques indépendantes de p53 [Gazzeri S et al., Cancer Res. 1998]. Afin de répondre à cette question, nous avons établi une lignée d’adénocarcinome bronchioloalvéolaire H358 (p53 nulle) exprimant de façon stable et inductible par la doxycycline la protéine p14ARF. Nous avons ainsi démontré que dans un contexte indépendant de p53, p14ARF est capable d’induire un blocage en G2/M du cycle cellulaire précédant la survenue d’une apoptose. Nous avons corrélé cet arrêt en G2/M à une inhibition de l’activité du complexe cycline B1/CDC2 (p34cdc2). Nous avons également observé une inhibition de l’expression de la phosphatase Cdc25C ainsi qu’une induction de sa phosphorylation inhibitrice sur son résidu sérine 216 suggérant l’incapacité de Cdc25C à activer (déphosphoryler) CDC2 dans les cellules exprimant p14ARF. Enfin, nous avons montré une induction de l’inhibiteur des complexes cycline/cdk p21WAF1. Ces résultats ont été confirmés in vivo où nous avons démontré que p14ARF est capable d’une part, d’inhiber la progression et d’autre part, d’induire la régression de tumeurs issues de cellules inductibles H358 implantées en sous-cutané chez la souris nude (p = 0,0043). Les mêmes anomalies moléculaires concernant le blocage en G2/M et l’apoptose ont été retrouvées dans ces tumeurs.
L’ensemble de ces résultats démontre pour la première fois la capacité de p14ARF à inhiber la prolifération cellulaire et à induire l’apoptose en l’absence de p53 in vitro et in vivo. Les résultats obtenus in vivo suggèrent en outre que la réintroduction de p14ARF dans des tumeurs l’ayant perdu telles que les tumeurs pulmonaires neuroendocrines, pourrait constituer, dans une optique de thérapie génique, un challenge thérapeutique.

n 26

Augmentation de la phosphorylation des protéines BRCA1 et BRCA2 dans les cellules mammaires en lignée continue traitées par le lycopène

Chalabi N1, Le Corre L1, Delort L1, Bignon YJ1, Bernard-Gallon DJ1

1 Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, Centre Jean Perrin, Inserm UMR 484-UdA, 58 rue Montalembert, 63011 Clermont-Ferrand.

En France, le cancer du sein est la première cause de mortalité chez les femmes. Différents types de facteurs sont impliqués : hormonaux, environnementaux et génétiques. Ainsi, deux gènes majeurs de prédisposition héréditaire ont été mis en évidence : ce sont les gènes BRCA1 et BRCA2 impliqués dans 5 à 10 % des cas familiaux. Dans les cas sporadiques, c’est une diminution de l’expression d’un de ces deux gènes qui est retrouvée. Notre étude porte sur l’interaction entre la nutrition et le cancer du sein et plus précisément sur l’effet du lycopène, caroténoïde majeur de la tomate, sur les deux oncosuppresseurs BRCA1 et BRCA2. La fonction des gènes BRCA1 et BRCA2 est régulée par une modification post-traductionnelle : la phosphorylation. Les protéines BRCA1 et BRCA2 sont hyperphosphorylées au niveau des résidus sérine et thréonine en fin de phase G1 et en début de phase S, par une activité kinase endogène, puis subissent une déphosphorylation en début de phase M. Ainsi, nous nous sommes intéressés à l’état de phosphorylation de ces deux protéines avant et après traitement par le lycopène. Pour cela, les lignées MCF-7 et T47D provenant d’un adénocarcinome mammaire ont été cultivées avec 10 µM de lycopène pendant 48 h. Un témoin non traité a également été réalisé. Les cellules ont été marquées métaboliquement avec de la Met-[35-S] pendant 24 h. La quantification des protéines BRCA1 et BRCA2 a été réalisée par chromatographie d’affinité de perfusion avec le système BioCAD/SprintTM (Perseptive Biosystems). Dans un premier temps, une colonne d’héparine nous a permis d’isoler les protéines se liant à l’ADN dont BRCA1 et BRCA2. Après une immunoprécipitation spécifique avec les anticorps polyclonaux anti-BRCA1 ou anti-BRCA2, les fractions sont déposées sur une colonne de protéine A permettant la fixation des immuns complexes par leur fragment Fc. Enfin la quantification des protéines BRCA1 et BRCA2 phosphorylées est réalisée par passage du complexe immun précédemment élué sur une colonne Poros 20 AL Media sur laquelle nous avons préalablement fixé des anticorps monoclonaux de souris, anti-phosphothréonine et anti-phosphosérine, par leurs fonctions NH2 sur les groupements aldéhydes suivi d’une réduction des bases de Schiff par NaCNBH3. Nos premiers résultats semblent montrer une augmentation de l’expression des protéines BRCA1-P et BRCA2-P après traitement des cellules mammaires par le lycopène mettant en évidence une possible augmentation de la régulation post-traductionnelle par le lycopène.

n 27

Analyse de l’expression du gène BRCA1 par RT-PCR quantitative en temps réel dans des lignées cellulaires tumorales sensibles et résistantes aux drogues

Oudin C, Picard SF, Boidot R, Vegran F, Cadouot M, Hahnel L, Lizard-Nacol S

Laboratoire de Génétique Moléculaire, Centre anticancéreux G.F. Leclerc, Inserm U517, 1, rue du Professeur Marion 21034 Dijon Cedex

BRCA1, gène de susceptibilité au cancer du sein héréditaire, intervient dans la réparation par recombinaison homologue des cassures double brin. Différentes études l’impliquent également dans les phénomènes de résistance aux drogues de chimiothérapie, mais les résultats obtenus essentiellement dans des lignées mammaires et ovariennes sont controversés.
Dans le but d’évaluer l’impact de l’expression de BRCA1 dans l’apparition de résistance aux drogues de chimiothérapie (doxorubicine, cisplatine, vinblastine ou taxol), 8 couples de lignées sont analysés. Celles-ci sont d’origines diverses, mammaire (MCF7), ovarienne (IGROV1), cervicale (KB), pulmonaire (A549) ou encore leucémique (K562, HL60, RPMI 8226 et CEM). L’expression de BRCA1 est déterminée par RT-PCR quantitative utilisant la chimie Taqman (Abi Prism 7700, Applied Biosystems), permettant ainsi de quantifier en temps réel l’expression de ce gène par rapport au 18S comme gène de référence.
Nos résultats montrent que les lignées MCF7 traitées à des doses de doxorubicine de 0,3 et 0,4 µM présentent une augmentation importante de BRCA1 de respectivement 18,2 et 4,9 fois par rapport à la lignée parentale. Cependant, les cellules MCF7 résistantes à 1,7 µM de doxorubicine présentent une expression similaire à celle de la lignée parentale. Ceci suggère le passage par une surexpression transitoire de BRCA1 dans l’acquisition de cette résistance. Les différentes lignées traitées à la doxorubicine montrent une expression variable de BRCA1. Une augmentation d’expression dans les lignées leucémiques RPMI et HL60, mais une diminution dans la lignée K562 ont été observées. Le traitement au cisplatine entraîne une diminution d’expression dans la lignée ovarienne IGROV1. Finalement, les trois lignées traitées par des poisons du fuseau mitotique (taxol ou vinblastine) présentent une augmentation d’expression de respectivement 41,2 fois pour la lignée A549 traitée au taxol et de 2,6 fois pour les lignées KB et CEM traitées à la vinblastine.
Ces résultats montrent que l’expression de BRCA1 lors de traitement à la doxorubicine est à la fois drogue et tissu-spécifique. En revanche, les poisons du fuseau mitotique augmentent l’expression de BRCA1 et ceci quel que soit le type de lignée.
Ces données seront complétées ultérieurement par l’analyse de l’expression protéique de BRCA1 dans ces mêmes lignées.

n 28

Rôles des transcrits alternatifs de la survivine dans la résistance à la chimiothérapie

Vegran F, Boidot R, Oudin C, Riedinger JM, Cadouot M, Hahnel L, Lizard-Nacol S

Laboratoire de Génétique Moléculaire, Centre Georges François Leclerc, Inserm U517, 1, rue du Professeur Marion, 21076 Dijon.

La survivine, membre de la famille des IAP (inhibitor of apoptosis protein), est exprimée dans les tissus embryonnaires et dans de nombreux cancers dont le cancer du sein. Deux transcrits issus d’un épissage alternatif sont mis en évidence. La survivine-DEx3 (Dex3) conserve les mêmes propriétés que le transcrit principal survivine (S) alors que la survivine-2B (2B) semble être antagoniste. Des travaux indiquent que l’augmentation d’expression de survivine est corrélée à une résistance à des drogues telles que la doxorubicine, la vinblastine, le cisplatine et les taxanes. Cependant, le rôle des transcrits alternatifs dans la résistance à ces drogues n’est pas connu.
Pour cela, une étude par RT-PCR quantitative en temps réel par la chimie TaqMan est effectuée sur 8 couples de lignées d’origines diverses (leucémique, mammaire, pulmonaire et ovarienne) sensibles et résistantes aux drogues (vinblastine, doxorubicine, cisplatine et taxol).
Nos résultats montrent une augmentation de l’expression de la survivine dans la lignée IGROV résistante au cisplatine (30X par rapport à la lignée parentale). Une augmentation est également observée dans les lignées MCF-7 (3X), HL60 (6X), et RPMI (1,5X) et non dans la lignée K562 résistantes à la doxorubicine. Dans les lignées résistantes aux anti-fusoriaux (A549, CEM et KB), seule la KB montre une augmentation (6X). En revanche, l’expression de la survivine-DEx3 augmente avec la résistance (p < 5 %, test de Wilcoxon) dans 7/8 lignées quels que soient la drogue et le type cellulaire utilisés. Dans le cas du transcrit 2B, seules les lignées MCF-7 et K562 résistantes à la doxorubicine présentent une diminution d’expression (respectivement 2X et 10X). Dans les autres lignées cellulaires une augmentation de survivine-2B, variant de 1,2X (IGROV résistante au cisplatine) à 15X (HL60 résistante à la doxorubicine) est observée.
Ces résultats montrent que la relation entre l’expression des différents transcrits et la résistance serait drogue et type cellulaire-dépendante. Cependant, une augmentation de la survivine et de la survivine-DEx3 dans la lignée MCF-7 est observée parallèlement à une diminution de la survivine-2B avec l’acquisition de la résistance à la doxorubicine. De plus, les ratios 2B/S et 2B/S + DEx3 suivent la même tendance. L’étude d’une population de 100 tumeurs du sein localement avancées et traitées par chimiothérapie première à base d’anthracyclines est en cours afin de vérifier la relation entre le niveau d’expression des différents transcrits et la réponse au traitement.

n 29

Étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la survie et l’apoptose des mélanocytes et des mélanomes

Larribere L, Khaled M, Hilmi C, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C

Inserm U597, Biologie et Pathologie des cellules mélanocytaires : de la pigmentation cutanée aux mélanomes, 28 av. de Valombrose, 06107 Nice Cedex 2.

La transformation tumorale en général, et du mélanocyte en mélanome en particulier, implique l’altération de plusieurs processus physiologiques qui confère à la tumeur un avantage sélectif. L’altération des réponses apoptotiques et l’acquisition d’une résistance à l’apoptose sont des étapes importantes dans le développement des mélanomes. Notre programme de recherche a pour but de disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’apoptose des mélanocytes et des mélanomes et de caractériser les altérations moléculaires qui sont impliquées dans la résistance des mélanomes à l’apoptose.

Nous avons montré que le TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) induit une apoptose rapide et massive des mélanocytes humains normaux. Les mélanocytes sont plus sensibles à l’apoptose induite par TRAIL que leur contrepartie transformée les mélanomes. De plus, nous avons observé que TRAIL n’induit pas ou peu la mort des kératinocytes et des fibroblastes humains normaux. Ces résultats suggèrent que dans le contexte d’un épiderme intact, TRAIL pourrait spécifiquement agir sur les cellules mélanocytaires. De plus, nous avons montré que le stem cell factor (SCF), un facteur de survie et de différenciation pour les mélanocytes, protège les mélanocytes de l’effet apoptotique de TRAIL. Nous avons observé que le SCF stimule les voies MAPK/ERK (mitogen activated protein kinase/extracellular regulated kinase) et PI3K/AKT (phosphatidyl inositol-3-kinase/AKT). Cependant, nos résultats indiquent que des inhibiteurs pharmacologiques de la voie PI3K/AKT (LY294002 et AKT inhibitor respectivement) bloquent complètement l’effet anti-apoptotique du SCF alors qu’un inhibiteur de la voie ERK (PD98059) inhibe seulement de 30 % l’effet anti-apoptotique du SCF. De plus, l’activation de la voie PI3K/AKT par l’infection des mélanocytes avec un adénovirus codant pour la sous-unité catalytique de la PI3K constitutivement active (P110 CAAX) bloque l’effet pro-apoptotique de TRAIL. Par contre, l’activation de la voie ERK par l’infection des mélanocytes avec un adénovirus codant pour une forme constitutivement active de BRAF (BRAF CAAX) ne suffit pas à bloquer l’apoptose induite par TRAIL. L’ensemble de ces résultats démontre le rôle essentiel de la voie PI3K/AKT dans la résistance à l’apoptose des mélanocytes normaux. Sachant que 66 % des mélanomes présentent une mutation activatrice de BRAF et que 20 à 40 % des lignées de mélanome selon les études indiquent que PTEN qui régule négativement la voie PI3K/AKT est non fonctionnel, les résultats obtenus dans cette étude contribuent à une meilleure compréhension du rôle respectif des voies PI3K/AKT et ERK dans la résistance à l’apoptose des cellules mélanocytaires.

n 30

Effets génotoxiques du rayonnement laser émis à 193 nm

Chapel C1, Marliot F1, 2, Bardot M3, Cordier E1, Hoffshir F3, Rigaud O4, Elmselmi A2, Courant D1

1 CEA/DSV/DRR/SRBF, CEN Fontenay aux Roses ;
2 École de Biologie Industrielle, Cergy Pontoise ;
3
CEA/DSV/DRR/SRBF/LRP CEN Fontenay aux Roses ;
4
CEA/DSV/DRR/SRCA/LCE CEN Fontenay aux Roses.

Symbole de la montée des nouvelles technologies, l’outil laser a envahi notre univers. Notre projet a pour but d’étudier les effets cellulaires et moléculaires du laser ArF, utilisé en chirurgie réfractive de la cornée et émettant dans l’ultraviolet C à 193 nm. Toutefois, l’évolution à long terme reste peu documentée et les données actuelles, concernant les effets cellulaires et moléculaires restent partielles, voire insuffisantes. Il est important de considérer que les cellules adjacentes à la zone d’ablation peuvent être exposées à des photons non utilisés pour la photoablation (doses sub-ablatives) et les quelques travaux réalisés sur les effets mutagènes du rayonnement laser émis à 193 nm sont contradictoires. Ainsi, nous avons étudié in vitro le potentiel génotoxique du rayonnement après analyse cytogénétique, test de micronoyaux et capacité à former des noyaux.
L’analyse cytogénétique (cellules en métaphase) indique différents types de cassures chromosomiques simple et double brin à partir de cellules humaines irradiées avec différentes expositions énergétiques par le laser. Juste après irradiation 38 cassures sont observées à partir de 50 métaphases analysées de cellules irradiées (150 J.m–2). Une cellule pouvant présenter un à plusieurs types de cassures. Cette analyse est corrélée à la formation de micronoyaux observée après 24 heures d’irradiation dans des cellules bloquées en fin de mitose par la cytochalasine B. Les cellules issues de culture de cornée présentent un taux de micronoyaux spontanés de 6,4 % ± 0,6 après exposition fantôme (contrôles). En revanche, les cellules traitées par le laser ont un taux de micronoyaux de 10,0 % ± 0,4 (500 noyaux binucléés analysés par point). Ces résultats ont été également complétés par des analyses de clonogénicité indiquant 7 % d’habilité de former des clones à 150 J.m–2 vs 35 % d’efficacité de clonage pour les cellules contrôles.
Malgré le faible pouvoir de pénétration du rayonnement à 193 nm, des modifications de la survie cellulaire ont été observées. Dans les cellules survivantes la présence de fragments chromosomiques pourrait conduire à la perte de matériel génétique et à une modification phénotypique. Si l’activation de processus mutagènes dans la cornée semble peu probable, ces données pourraient témoigner de l’induction d’un processus de photovieillissement, également suggéré par l’augmentation de l’activité gélatinolytique (due aux métalloprotéases) après irradiation laser à 193 nm. L’étude des mécanismes d’atteinte de l’ADN est actuellement en cours. Si l’extrapolation des données in vitro est à faire avec prudence, ces travaux sont plus que nécessaires afin d’augmenter la sécurité et la fiabilité de ces traitements.

n 31

HGF activation of the B-Raf/MEK/MAP kinase signaling pathway in melanoma cells mediates fibronectin expression by inducing Egr1

Gaggioli C1, Deckert M2, Robert G1, Abbe P1, Batoz M2, Ehrengruber MU3, Ortonne JP1, Ballotti R1, Tartare-Deckert S1

1 Inserm Unité 597, IFR 50, Nice, France, 
2
Inserm Unité 576, Nice, France and 
3
University of Zurich, Switzerland.

The matrix fibronectin protein is a multifunctional cell adhesive molecule that plays important roles in many biological processes including tumorigenesis. The Hepatocyte growth factor (HGF) elicits a number of biological responses through activation of its receptor c-Met and has been implicated as a critical factor for melanoma tumor progression and metastasis. Here we report that HGF induces fibronectin expression in melanoma cell lines via activation of the mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway, and that this up-regulation is mediated in part by the rapid induction and transcriptional activation of Egr-1 (early growth-response factor-1). Inhibition of the B-RAF/MEK/MAP Kinase pathway by dominant negative mutants and by the MEK inhibitor U0126 abrogates HGF-induced Egr-1 and deletion analysis of the Egr-1 promoter identifies a region containing five juxtaposed SREs (Serum responsive elements) responsible for HGF responsiveness. Chromatin immunoprecipitation shows that Egr-1 is bound to a previously described region of the fibronectin promoter in response to HGF. Exogenously expressed Egr-1 promotes fibronectin expression while blockage of Egr-1 activation by forced expression of the Egr-1 specific corepressor NAB2 interferes with HGF-induced fibronectin expression. Analysis of the expression pattern of fibronectin in several melanoma cell lines demonstrates that expression of fibronectin is strongly correlated with constitutive MAPK signaling. Taken together, these results indicate that induction of Egr-1 by HGF in melanoma cells participates in HGF/c-Met-induced upregulation of fibronectin, and describe a novel mechanism that might have important implications in the regulation of melanoma development by HGF or by constitutive activation of MAPK signaling.

n 32

Apoptose sans blocage en mitose dans le neuroblastome : implication de l’inhibition de la dynamique microtubulaire par les vinca-alcaloïdes

Pourroy B, Honoré S, Carré M, Pasquier E, Briand C et Braguer D

UMR FRE CNRS 2737, Université de La Méditerranée, UFR Pharmacie, Marseille France.

Nous avons récemment montré que les vinca-alcaloïdes pouvaient induire l’apoptose de cellules de neuroblastome SK-N-SH sans blocage en mitose préalable. Des concentrations inhibant la croissance cellulaire de 50 % (IC50) bloquaient les cellules non pas en mitose mais en phase G1. Ce blocage survenait après la sortie de mitose et était associé à une translocation nucléaire et une induction de p53 et p21, dans des cellules qui pourtant séquestrent p53. Dans cette étude, nous avons voulu comprendre comment la vinflunine pouvait être à l’origine de ce phénomène particulier et si celui-ci était spécifique de la lignée SK-N-SH ou des neuroblastomes en général. Dans notre modèle, la vinflunine inhibe la dynamique microtubulaire (– 35 %) et ralentit la transition métaphase/anaphase. Par ailleurs, p53 n’est pas induit précocement, mais après 24 h de traitement, lorsqu’il est transloqué au noyau. Ceci va dans le sens d’un lien entre transition mitotique et blocage en G1 et est cohérent avec divers travaux montrant un ralentissement mitotique sous l’effet des vinca-alcaloïdes [Jordan et al., 2002] et la translocation nucléaire de p53 par une perturbation de la dynamique microtubulaire [Giannakakou et al., 2002]. Ainsi, dans les cellules SK-N-SH, la vinflunine est capable, via l’inhibition de la dynamique microtubulaire, de faire transloquer p53 au noyau. Celui-ci, détectant des anomalies liées à la transition mitotique ralentie, induit un blocage du cycle en G1. Les voies apoptotiques p53 dépendantes sont alors activées. Enfin, pour appréhender la spécificité de ce phénomène, nous avons évalué l’effet des IC50 de la vinflunine sur les lignées de neuroblastome SHEP, SH-SY5Y et IMR32 ainsi que sur les lignées non neuronales LoVo et HBL-100. De façon intéressante, le blocage en mitose n’est présent que dans les lignées d’origine non neuronales. Pour les trois lignées de neuroblastome, la vinflunine induit l’apoptose sans bloquer en mitose. Ainsi, nous avons montré que : 1) l’apoptose sans blocage en mitose sous l’effet des vinca-alcaloïdes est spécifique du neuroblastome ; 2) l’inhibition de la dynamique microtubulaire est une étape clé dans ce phénomène ; 3) ce phénomène permettrait de lever l’inactivation par séquestration de p53 dans ces tumeurs. Des travaux futurs pourraient nous permettre d’évaluer l’impact de ces drogues en association avec des alkylants pour lesquels il a été décrit des phénomènes de résistance liés à la séquestration de p53.

n 33

An anti-apoptotic viral protein that recruits Bax to mitochondria

Poncet D1, Larochette N1, Pauleau AL1, Boya P1, Jalil AA3, Cartron JF2, Vallette F2, Schnebelen C4, Bartle LM5, Skaletskaya A5, Boutolleau D6, Martinou JC4, Goldmacher VS5, Kroemer G1, Zamzami N1

1 Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 8125, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille-Desmoulins, F-94805 Villejuif, France ;
2 IFR26, Inserm U 419, 9 quai Moncousu, 44035 Nantes, France ;
3
U487 Inserm, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille-Desmoulins, F-94805 Villejuif, France ;
4
Département de Biologie Cellulaire ; Sciences III, Quai Ernest-Ansermet 30, CH-1211 Genève 4, Switzerland ;
5
ImmunoGen, Inc, 128 Sidney St., Cambridge, MA 02139, USA ;
6 Bactériologie-Virologie-Parasitologie-Hygiène, Hôpital de Bicêtre, 78,rue du Général Leclerc, 94277 Le Kremlin-Bicêtre, France.

The viral mitochondria-localized inhibitor of apoptosis (vMIA), encoded by the UL37 gene of human cytomegalovirus, inhibits apoptosis-associated mitochondrial membrane permeabilization (MMP) by mechanism different from that of Bcl-2. Here we show that vMIA induces several changes in Bax that phenomenologically resemble those found in apoptotic cells, yet take place in unstimulated, non-apoptotic vMIA-expressing cells. These changes include the constitutive localization of Bax at mitochondria where it associate tightly with the mitochondrial membrane, in the form of high molecular weight aggregates containing vMIA and Bax. vMIA recruits Bax to mitochondria, but delays relocation of caspase-8-activated truncated Bid-GFP (t-Bid-GFP) to mitochondria. In contrast, in vMIA negative cells both t-Bid-GFP and Bax relocate to mitochondria upon caspase-8-mediated truncation of Bid-GFP. The ability of vMIA and its deletion mutants to associate with Bax and to induce relocation of Bax to mitochondria correlate with their anti-apoptotic activity and with their ability to suppress MMP. Taken together, our data indicate that vMIA blocks apoptosis via its interaction with Bax. vMIA neutralizes Bax by recruiting it to mitochondria and “freezing” its pro-apoptotic activity. These data unravel a novel strategy of subverting an intrinsic pathway of apoptotic signaling.

n 34

Exploration de la fonction télomérique des cellules B de leucémie lymphoïde chronique

Roborel de Climens A1, Bauwens S1, Delic J2, Sabatier L2, Salles G3 et Gilson E1

1 LBMC, ENS-Lyon/UMR 5161, 69364 Lyon Cedex 07 ;
2 Service d’hématologie, JE 2267, Hospices civils de Lyon-Université Claude Bernard, 69495 Pierre-Bénite Cedex ;
3 Laboratoire de Radiobiologie et Oncologie, CEA, Fontenay aux Roses, France.

Les télomères représentent les extrémités des chromosomes, ils protègent les gènes d’éventuelles dégradations ou recombinaisons. Ces extrémités télomériques sont composées de répétitions d’ADN qui sont ajoutées par une ribonucléoprotéine, la télomérase. Cette enzyme est présente dans les cellules germinales, mais absente dans la plupart des cellules somatiques. Ainsi, au fur et à mesure des divisions cellulaires, les télomères se raccourcissent jusqu’à un point critique qui induit la sénescence ou bien la mort de la cellule. Contrairement aux cellules somatiques normales, la télomérase est réactivée dans 80 % des cancers, ce qui permet aux cellules tumorales de proliférer indéfiniment.
Les télomères sont aussi composés d’une chromatine particulière formée de complexes nucléoprotéiques incluant les protéines TRF1/PINX1/hPOT1/TIN2 et TRF2/hRAP1. Ces facteurs sont impliqués dans le contrôle de la taille des télomères mais aussi dans leur protection.
Notre travail consiste en l’étude des fonctions télomériques dans la leucémie lymphoïde chronique des cellules B (B-LLC). Cette leucémie est caractérisée par une accumulation dans le sang périphérique de lymphocytes B monoclonaux anormaux. Ces cellules particulières sont en phase quiescente, elles expriment très peu d’immunoglobulines à leur surface et sont réfractaires à la mort cellulaire par apoptose. De ce fait, ces cellules s’accumulant dans le sang bloquent la réponse immunitaire normale et provoquent des immunodéficiences et des autoimmunités.
Afin d’étudier les modifications télomériques qui ont lieu dans la B-LLC, nous avons exploré par PCR quantitative le profil d’expression des gènes codant pour la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) ainsi que pour TRF1, PINX1, hPOT1, TIN2, TRF2 et hRAP1. En parallèle, nous avons analysé la présence de la télomérase par immunofluorescence et son activité enzymatique par TRAP.
Nous avons constaté qu’au contraire des lymphocytes B normaux du sang périphérique, les cellules B-LLC sont dépourvues de télomérase (aux niveaux ARN, protéique et activité enzymatique). De plus, nous avons observé un profil d’expression des gènes télomériques qui semble spécifique des cellules B-LLC. Ces résultats suggèrent qu’une modification télomérique particulière est associée à la leucémie lymphoïde chronique B.

n 35

Peptides antagonistes des activités angiogène et transformante du facteur de croissance heparin affin regulatory peptide (HARP)

Hamma-Kourbali Y1, Bermek O1, 2, Delbé J1, Caruelle D1, Burlina F2, Chassaing G2, Courty J1

1 Laboratoire de recherche sur la Croissance Cellulaire, la Régénération et la Réparation Tissulaire (CRRET) CNRS FRE 2412, Université Paris XII, Avenue du général de Gaulle, 94010 Créteil Cedex France ;
2 Laboratoire de Structure et Fonction des Molécules Bioactives, CNRS UMR 7613, Université Paris VI, Place Jussieu, 75005 Paris France.

L’HARP est une protéine de 136 acides aminés qui forme avec la midkine (MK) une famille appartenant aux heparin binding growth factors (HBGF). Leur implication dans le développement tumoral est lié à la fois à leurs activités mitogène, angiogène et transformante. Le récepteur cellulaire de haute affinité responsable de leurs activités a été identifié comme étant le récepteur à activité tyrosine kinase ALK (anaplastic lymphoma kinase).
Récemment, nous avons mis en évidence l’importance de l’extrémité C-terminale 111-136 de l’HARP dans ses activités biologiques. Ainsi une protéine mutante HARP délétée de ses 25 derniers acides aminés (HARP Δ111-136) et le peptide synthétique P111-136 correspondant à cette délétion exercent des fonctions de dominant négatif vis-à-vis des activités biologiques de la protéine HARP native. In vivo, le peptide synthétique P111-136 à 5 mg/kg tous les 2 jours inhibe la croissance de cellules de carcinome de prostate PC3 implantées en sous-cutané chez la souris athymique. L’inhibition de la croissance tumorale est de 90 % après 3 semaines de traitement. Cette inhibition est comparable à celle obtenue avec un traitement de 10 mg/kg/semaine de taxol. La recherche d’une séquence minimale inhibitrice dans le peptide P111-136 nous a permis de montrer que le peptide P122 à 131 possédait des propriétés analogues au P111-P136. Le peptide P122-131 inhibe la prolifération des fibroblastes NIH-3T3, induite par HARP, (IC50) de 10 µM et inhibe la croissance en agar mou, des cellules de carcinome mammaire humain MDA-MB-231 et des cellules de mélanome murin B16BL6 de respectivement 32 % et 40 % à une concentration de 10 µM. De plus, l’étude du mécanisme d’action montre que le P122-131 exerce également un effet dominant négatif sur les activités biologiques de MK. L’ensemble de ces résultats suggère que le peptide p122-131 intervient dans l’interaction de ces facteurs de croissance avec le récepteur ALK. Nous envisageons d’évaluer prochainement l’effet de ce peptide P122-131 sur la croissance des tumeurs PC3 et B16BL6 in vivo. L’utilisation d’outils moléculaires comme ce peptide peut être une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement des cancers exprimant fortement les protéines HARP et/ou MK.

n 36

Rôle anti-tumoral de la sémaphorine SEMA3F

Kusy S1, Nasarre P1, Chan D2, Potiron V1, 2, Drabkin H2, Roche J1

1 IPBC CNRS UMR 6187, 40 avenue du Recteur Pineau, 86022 Poitiers, France ;
2 Division of Medical Oncology, UCHSC, 4200 East Ninth Avenue, Denver, CO 80262, USA.

Notre groupe a découvert le gène de la sémaphorine, SEMA3F, dans la région chromosomique 3p21.3, où la présence d’un gène suppresseur de tumeurs est fortement suggérée. Les sémaphorines SEMA3F sont des protéines sécrétées qui ont été initialement découvertes pour leur rôle dans le guidage des axones. Mais elles sont aussi exprimées dans d’autres tissus, où elles exercent de multiples fonctions : immunologiques, développementales et anti-angiogéniques. Les sémaphorines utilisent les neuropilines, associées aux plexines, en tant que récepteurs fonctionnels. Les neuropilines ont également été identifiées comme co-récepteur au facteur d’angiogenèse VEGF.
Notre laboratoire cherche à démontrer l’implication et le rôle de SEMA3F dans le développement des tumeurs. Dans un précédent travail, nous avons montré une perte de SEMA3F dès les stades précoces des tumeurs pulmonaires, ce degré de perte étant corrélé avec le stade de la tumeur. Nous avons suggéré l’implication de SEMA3F dans l’inhibition de l’angiogenèse via une compétition avec le VEGF. Nous avons également mis en évidence que SEMA3F pouvait inhiber l’attachement et la dissémination des cellules tumorales mammaires humaines, indiquant que la perte d’expression de ce gène pourrait augmenter les propriétés métastasiques.
Pour démontrer le rôle anti-tumoral de SEMA3F in vivo, nous travaillons actuellement sur un modèle de rat immunodéficient. Après infection rétrovirale, nous avons établi des clones stables exprimant SEMA3F à partir des lignées tumorales pulmonaires H157 et H1264. Les cellules contrôle induisent la formation de tumeurs après injection dans les bronches des rats qui meurent après 30 jours. Au contraire, les cellules H157, exprimant SEMA3F, n’induisent pas la formation de tumeur, même plusieurs mois après l’injection. Ceci démontre bien le rôle suppresseur de tumeur de SEMA3F, qui a aussi été décrit dans la littérature dans un modèle de souris nude. Cependant, les cellules H1264, exprimant SEMA3F, ne réduisent pas la fréquence des tumeurs. Nous cherchons actuellement une explication à ces différences en déterminant l’expression des différents composants de la voie de signalisation de SEMA3F. Notre étude montre que l’effet anti-tumoral de SEMA3F ne se limite pas à un effet anti-angiogénique, et que la perte de SEMA3F est critique dans le développement tumoral. Le rôle des sémaphorines dans la tumorigenèse est une voie de recherche intéressante impliquant des applications thérapeutiques potentielles.

n 37

Immortalisation conditionnelle des cellules progénitrices hépatiques simiennes après transfert du gène codant l’antigène T du virus SV40 et leur caractérisation à long terme

Delgado JP1, Parouchev A1, Pennarun G2, Allain JE1, Dagher I1, Dutrillaux B2, Leboulch P3, Boussin F2, Weber A1

1 Inserm EMI 00-20 et Université Paris XI, Hôpital A. Béclère, 92141 Clamart ;
2 Laboratoire de Radiopathologie, DSV/DRR, CEA, BP6, 92265 Fontenay-aux-Roses ; 
3
 Inserm EPI 01-11, Hôpital Saint Louis, 75010 Paris.

Les hépatoblastes sont les cellules progénitrices du foie fœtal donnant naissance aux hépatocytes et aux cellules biliaires (cholangiocytes). Ces cellules ont été isolées et caractérisées chez les rongeurs mais non chez l’homme.

Nous avons immortalisé des cellules progénitrices hépatiques fœtales de primate par transfert rétroviral de l’antigène T de SV40 flanqué de sites LoxP, et caractérisé à long terme le clone isolé. Ces cellules IPFLS proliféraient in vitro de façon illimitée et étaient bipotentes : elles exprimaient, outre des marqueurs des cellules épithéliales (cytokératines 8/18), des marqueurs spécifiques des hépatocytes (albumine et alpha-fœtoprotéine) et des cellules biliaires (CK7 et 19). Trois semaines après transplantation via la veine porte dans les souris nude, les cellules ont été retrouvées intégrées dans le parenchyme hépatique. Elles exprimaient les marqueurs hépatocytaires uniquement et n’étaient pas tumorigènes. L’immortalisation était associée à la ré-expression de l’activité télomérase. Toutefois, après un an de culture (120 doublements de population), cette activité a chuté, et cette diminution a coïncidé avec un raccourcissement des télomères et une instabilité chromosomique. Cependant, le chromosome porteur du gène p53 n’a pas été remanié et les cellules progénitrices immortalisées ont conservé l’inhibition de contact après culture à long terme. Elles ont aussi gardé leurs caractéristiques de cellules progénitrices bipotentes normales. Nous avons construit un vecteur rétroviral porteur du gène codant la recombinase CRE, fusionné au domaine de liaison muté du récepteur aux estrogènes. Les cellules IPFLS ont été transduites par ces virus recombinants. L’activation de la recombinase CRE par le 4-hydroxy-tamoxifène a induit l’excision de l’antigène T, ce qui a conduit à la mort des cellules exprimant la recombinase CRE, ce qui montre que le phénotype immortalisé est resté dépendant de l’antigène T.

Ainsi, l’immortalisation de cellules hépatiques de primate implique, outre le passage de la phase M1, sénescence réplicative, et de la phase M2, réactivation de la télomérase, des mécanismes impliquant la stabilisation des télomères.

Ces cellules représentent un nouveau modèle pour l’étude de la différenciation hépatique et de la carcinogenèse in vitro. In vivo, elles pourront être transplantées dans des modèles murins de cancérogenèse hépatique afin d’analyser leur domiciliation au sein du parenchyme hépatique.

n 38

Plusieurs protéines de signalisation contrôlent la prolifération et la transformation des mélanocytes choroïdiens tumoraux humains

Calipel A1, Lefevre G1, Mouriaux F1, 2, Courtois Y1, Mascarelli F1

1 Institut Biomédical des Cordeliers, Inserm U598, Paris, France ;
2 Service d’ophtalmologie, CHU côte de Nacre, Caen, France.

Le mélanome de la choroïde est la tumeur maligne oculaire la plus fréquente chez l’homme adulte, et 400 nouveaux cas sont détectés chaque année en France.
Aucune mutation n’a été détectée dans les gènes de susceptibilité du mélanome cutané que sont RAS, BRAF, p53, PTEN, INK4a, CDK4 et ARF. Les dérégulations intervenant dans le mélanome choroïdien sont spécifiques à celui-ci. Par une étude protéomique comparant les niveaux d’expression de groupes de protéines ayant des fonctions cellulaires distinctes entre des mélanocytes sains de la choroïde humaine et des lignées de mélanome choroïdien, nous montrons que, sur plus de 80 protéines étudiées, 20 sont sur-exprimées jusqu’à des niveaux 10 fois plus élevés dans le mélanome et 14 sont sous-exprimées jusqu’à des niveaux 60 fois plus faibles par rapport aux mélanocytes sains. Le traitement de ces cellules avec un large panel d’inhibiteurs pharmacologiques spécifiques de certaines de ces protéines inhibe la prolifération et/ou la transformation cellulaire. Parmi celles-ci, les protéines du module de signalisation MEK/ERK, celles du cycle cellulaire comme p27, la CDK1 et les cyclines A et D1, et l’inhibiteur du facteur de transcription NF-κB, IκB, semblent impliquées dans la tumorigenèse du mélanome choroïdien. De plus la prolifération des mélanocytes tumoraux choroïdiens est fortement diminuée par une stratégie ODN AS dirigée contre le FGF2. Sachant que le FGF2 médie son effet via l’activation de ERK1/2, nous suggérons également l’implication de la boucle autocrine FGF2/FGFR dans la tumorigenèse du mélanome choroïdien. Une compréhension précise entre ces différentes voies et certains facteurs de croissance comme le FGF2 permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales dans le mélanome choroïdien.

n 39

Vitamin D3 regulation of terminal differentiation cytokeratins

Maksoud S, Shabana EH, Prado E, Berdal A

Laboratoire de Biologie Orofaciale et Pathologie, EMI 110, Paris.

Forced expression of terminal differentiation in malignant cells represents an objective in the anti cancer research. Several pervious investigations indicated that 1, 25 (OH)2 vitamin-D3 (Vit-D3) is a power inducer of keratinocyte differentiation as manifested by cornified envelop formation and the expression of certain makers of terminal differentiation. However, very little is known on the effects of this hormone on non keratinized oral epithelium. It was reported that the forced expression of cytokeratins 1 and 10 is associated with inhibition of proliferation. In the present study we used a cell line, HaCaT, which produces cytokeratins specific for both keratinized and nonkeratinized stratified squamous epithelia in order to characterize the phenotypic modifications associated with Vit-D3 differentiation induction. Cells were grown to confluency in MEM supplemented with SVF and antibiotics thin treated for different times and concentrations with Vit-D3. The results showed that Vit-D3 stimulated the expression of CK1, 10, 4, 13 by the differntiating cells in a dose and time dependent manner. The stimulation of the pair CK4/13 expression preceded that of the pair CK1/10. CK15 was found in small clusters of undifferentiated control cells. After treatment, the expression of this cytokeratin was down-regulated both on the protein and mRNA levels. This inhibition was obtained at concentrations > 10–9 M. Furthermore, CK15 synthesis was completely blocked at 10–7 M. The results indicated that Vit-D regulates cytokeratin profiles by stimulating terminal differentiation markers of the squamous epithelial phenotype. The down-regulation of basal cell keratin, CK15, concords with an inhibitory effect of Vit-D3 on cell proliferation, and suggest that the progenitor epithelial cell population is a target for Vit-D3 action.

n 40

Interaction entre Ets1/CBP (CREB binding protein) et transactivation du promoteur P3 (TATA) proximal du gène de l’hormone apparentée à l’hormone parathyrodïenne (PTHrP) dans le cancer du sein

Hamzaoui H1, Rizk-Rabin M1, Cataisson C2, Foley J3, Bertherat J1, Bouizar Z1

1 Institut Cochin, Inserm U567, UMR 8104, 24 rue du Fg. Saint-Jacques-75014 Paris ;
2 NIH/NCI, USA ;
3 Medical Sciences-Indiana University School of Medicine, Bloomington, USA.

La PTHrP a un rôle multifonctionnel dans la pathologie cancéreuse. Elle provoque l’hypercalcémie humorale maligne, induit les métastases osseuses, régule la croissance et la survie des cellules tumorales [1, 3}. Le gène de la PTHrP est formé de trois promoteurs P1 et P3 de type TATA et P2 riche en boxe CG. L’épissage alternatif permet l’expression de 3 isoformes de 139, 141 et 173 acides aminés. Par RT-PCR, nous avons rapporté une expression différentielle des transcrits issus de l’épissage alternatif en 5’ et 3’ dans les cancers du sein [2] et dans des lignées épithéliales mammaires humaines avec une prévalence de l’isoforme 139 sous le contrôle de P3 [3, 4]. Nous avons montré que le facteur Ets1 est responsable de la transactivation du promoteur P3 dans les lignées tumorales invasives et ceci à l’aide de la mutagenèse dirigée du site de liaison aux facteurs de transcription Ets, transfection transitoire de constructions couplées au gène reporter luciférase et du vecteur d’expression de Ets1 [4]. Récemment, nos résultats de Western Blot et des expériences de co-transfections transitoires ont montré une interaction de la protéine co-activatrice CBP (protéine nucléaire à activité histone acétyl-transférase ou HAT) avec Ets1 dans l’activation du promoteur P3 (20 fois v/s contrôle) dans les lignées surexprimant la PTHrP. Cette interaction nécessite la fixation du facteur Ets1 sur son site. Le traitement des lignées par un agent pharmacologique acétylant, la trichostatine A (TSA), a montré, par RT-PCR, une activation de la transcription du gène de la PTHrP dans les cellules normales et pré-tumorales. L’hyperexpression de PTHrP caractéristique des lignées invasives tumorales primaires, facteur impliqué dans la genèse des métastases osseuses chez les patientes à risque semble être multifactorielle. Elle résulterait de l’action des HAT au niveau chromatinien et de la transactivation par le facteur de transcription Ets1.

1. Bouizar Z, et al. Cancer Res, 1993.

2. Bouizar Z., et al. J Bone Min Res 1999.

3. Cataisson C, et al. J Bone Min Res 2000.

4. Cataisson C, et al. Mol Cell Endocrinol 2003

n 41

Étude de la protéine kinase Aurora-A au cours de la maturation méiotique de l’ovocyte de xénope

Maton G1, Thibier C1, Castro A2, Lorca T2, Prigent C3, Jessus C1

1 CNRS-UMR 7622, 9 quai St Bernard, 75252 Paris Cedex 05 ;
2 UPR 1086, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier Cedex 5 ;
3 UMR 6061, 2 avenue du Pr Léon Bernard, 35043 Rennes Cedex.

La kinase Aurora-A est un proto-oncogène très conservé de la levure à l’homme. Elle est impliquée dans la formation des fuseaux microtubulaires de division mitotiques et contribue à la ségrégation des chromatides sœurs dans les cellules filles. La dérégulation de la kinase Aurora-A est associée à des phénomènes d’aneuploïdie liés à la tumorigenèse. Cependant, le contrôle de l’activation d’Aurora-A est encore mal connu.
Nous avons choisi d’étudier la régulation de la kinase Aurora-A dans un modèle cellulaire physiologique, la maturation méiotique de l’ovocyte de xénope, qui présente les caractéristiques d’une transition G2/M. Dans les ovaires, les ovocytes de xénope sont naturellement bloqués en prophase de première division méiotique et reprennent la méiose sous l’influence de la progestérone. On sait que cette hormone induit l’activation du MPF (M-phase promoting factor ou complexe Cdc2-cycline B), ce qui provoque GVBD (germinal vesicle breakdown), et déclenche la première division méiotique.
Les substrats physiologiques ainsi que les régulateurs d’Aurora-A sont encore méconnus. Nous avons montré qu’in vitro comme in vivo, Aurora-A est phosphorylée et activée en réponse à la progestérone, au moment de GVBD, sur au moins trois résidus. Ces deux événements sont sous la dépendance de l’activation de la kinase Cdc2. De plus, nous avons mis en évidence que la présence de microtubules est nécessaire pour la phosphorylation et l’activation d’Aurora-A in vitro. Nous tentons actuellement d’identifier les régulateurs d’Aurora-A, positifs ou négatifs, présents sur les microtubules. Ces données suggèrent donc l’existence de plusieurs niveaux de régulation de la kinase Aurora-A, tant au niveau biochimique (phosphorylations) qu’au niveau architectural (rôle des microtubules) de la cellule.

n 42

Rôle des petites protéines G dans l’activation de la kinase Cdc2 lors de la maturation méiotique de l’ovocyte de xénope

Gaffré M1, Dupré A1, Jessus C1, Haccard O1

1 Laboratoire de Biologie du Développement, UMR-CNRS 7622, Université Paris 6, 9 quai St Bernard, 75252 Paris Cedex 05, France.

L’ovocyte de xénope est bloqué en prophase de première division méiotique. En réponse à la progestérone, il reprend la méiose et se bloque à nouveau, en métaphase II, jusqu’à la fécondation. La transition entre la prophase I et la métaphase II est équivalente à une transition G2/M du cycle cellulaire et dépend donc de l’activation du MPF (M-phase promoting factor). Ce facteur est composé de deux sous-unités : la cycline B et la kinase Cdc2.
Nous avons abordé le rôle de l’oncogène H-Ras dans la maturation méiotique de l’ovocyte de xénope. La micro-injection de la petite protéine G H-Ras mime les effets de la progestérone ; H-Ras aurait donc un rôle positif sur la reprise de la méiose. Par contre l’inhibition de certaines petites protéines G dans l’ovocyte par la toxine létale induit également la reprise de la méiose, ce qui suggère que les petites protéines G de la famille Ras, cibles de la toxine, jouent un rôle négatif dans ce processus. Nous avons cloné H-Ras de xénope et utilisé un simple mutant constitutivement actif, H-RasV12 (une valine remplace une glycine en position 12), et trois doubles mutants constitutivement actifs, n’activant chacun qu’une seule des voies induites par H-RasV12 : H-RasV12G37 active la voie RalGDS, H-RasV12S35 la voie MAPK, et H-RasV12C40 la voie PI3K. Nous avons montré que seuls H-RasV12 et H-RasV12G37 induisent la maturation, suggérant l’implication de la voie RalGDS dans ce phénomène. La reprise de la méiose induite par H-Ras est donc indépendante de l’activation de la voie MAPK. Toutefois, bien que RalGDS semble recruté par H-Ras, la contribution d’une PI3K particulière monomérique telle que la p110, ne peut être totalement exclue comme le montrent nos expériences utilisant un inhibiteur de PI3K.
Nous nous sommes également intéressés à Rap1 qui apparaissait comme un bon candidat pouvant jouer un rôle antagoniste à H-Ras. Nos résultats montrent que cette petite protéine G ne semble pas intervenir dans la reprise de la méiose.
L’activation du moteur mitotique, Cdc2, repose donc sur la balance entre deux petites protéines G à rôles antagonistes de la famille Ras, et pourrait mettre en œuvre une voie PI3K originale, indépendamment de la MAPK.

n 43

Coopération entre YY1 et AP-2 pour la stimulation de l’expression de l’oncogène ERBB2 dans des lignées de cancer du sein

Begon D1, Delacroix L1, Vernimmen D1, Winkler R1

1 Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, CHU Sart-Tilman, Tour de Pathologie, Bât. B23 niv.0, 4000 Liège, Belgique.

Nous nous intéressons à l’étude des mécanismes de surexpression de l’oncogène ERBB2 ; cette surexpression est observable dans 30 % des cancers du sein et est corrélée à un pronostic défavorable pour la patiente.
Dans les lignées cellulaires d’adénocarcinome mammaire, des résultats antérieurs de notre laboratoire ont montré qu’une activité transcriptionnelle élevée contribue de manière significative à la surexpression de l’ARN messager ERBB2. Les facteurs de transcription AP-2 (activating protein 2) interviennent dans cette surexpression via deux séquences de reconnaissance localisées sur le promoteur ERBB2 en 215 bp et en 500 bp en amont du site d’initiation de la transcription.
Pour aller plus loin dans l’étude du mécanisme de surexpression de l’oncogène ERBB2, nous avons examiné l’effet coopératif du facteur de transcription YY1 (Yin Yang 1) sur l’activation du promoteur ERBB2 induite par AP-2. Nous avons observé une expression élevée de la protéine YY1 dans les lignées de cancer du sein. Une forte expression des facteurs AP-2 est aussi observée dans les lignées de cancer du sein surexprimant ERBB2. Nous avons pu mettre en évidence une interaction entre les protéines AP-2 et YY1 endogènes dans la lignée d’adénocarcinome mammaire BT-474. En outre, nous avons montré que le facteur YY1 augmente de 2 à 3 fois l’activation transcriptionnelle des facteurs AP-2α, β et γ via les deux sites AP-2 du promoteur ERBB2 dans les cellules HepG2 et HCTT116.
Nous avons également montré que l’inhibition de la protéine YY1 endogène par un vecteur antisens conduisait à une diminution de 60 % de l’activité luciférase d’un vecteur rapporteur répondant à AP-2 dans la lignée de cancer du sein BT-474.
Toutes ces données indiquent que la protéine YY1 coopère avec le facteur de transcription AP-2 pour stimuler l’activité du promoteur ERBB2 dans les lignées de cancer du sein. Dès lors, YY1 pourrait avoir un rôle important dans la surexpression de l’oncogène ERBB2 dans les adénocarcinomes mammaires.

n 44

Étude du rôle des protéines SOCS dans la régulation du récepteur KIT

Bayle J1, Dubreuil P1, De Sepulveda P1

1 Laboratoire d’Hématopoïèse moléculaire et fonctionnelle, Inserm UMR599, 27 bd Leï Roure, 13009 Marseille.

Nous étudions l’implication des protéines SOCS (suppressor of cytokine signaling) dans la régulation de la signalisation liée au récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) KIT.
Le récepteur KIT est indispensable au développement des mélanoblastes, des cellules germinales et des cellules hématopoïétiques. Une fois activé par son ligand, le SCF (stem cell factor), KIT initie une cascade de voies de signalisation, responsable de réponses cellulaires pléïotropes, comme la prolifération, la différenciation et la migration des cellules. KIT peut présenter des anomalies structurales, qui conduisent à une activité kinase augmentée ou constitutive. Le récepteur devient alors un oncoprotéine responsable de la transformation cellulaire, ce qui se traduit par le développement de cancers (hémopathies, tumeurs gastro-intestinales stromales). Ainsi, à l’état physiologique, KIT doit être hautement régulé dans le temps et dans l’espace. Parmi les molécules cytoplasmiques participant à la régulation négative de KIT, nous avons mis en évidence la protéines SOCS1 comme un partenaire de KIT. Cette protéine appartient à une famille regroupant 8 membres : CIS, SOCS1 à 7, décrits comme des régulateurs de la transduction de signaux intracellulaires induits par de nombreux récepteurs à cytokines. De récentes études ont révélé leur implication dans la carcinogenèse. L’expression du gène socs1 est réprimée par hyperméthylation, par exemple dans la majorité des carcinomes hépatocellulaires. Socs1 est décrit comme un nouveau gène suppresseur de tumeur. A ce jour, peu de données sont disponibles sur le rôle régulateur des SOCS au niveau des RTK.
Nos travaux ont permis de démontrer que la transcription des gènes socs1 et socs6 est induite précocement en réponse au SCF. Les protéines SOCS1 et SOCS6 interagissent avec le récepteur KIT suite à une activation par le SCF. Le développement de mutants des différentes tyrosines du récepteur ont permis d’identifier la tyrosine 567 au niveau du domaine juxtamembranaire comme site d’encrage de la protéine SOCS6. De plus, nous avons démontré que l’expression constitutive de ces molécules inhibe la prolifération cellulaire induite par le SCF, alors que la migration des cellules n’est pas affectée. L’expression ectopique de SOCS6 réduit l’activation des voies MAPKinases ERK et p38 induites par KIT, tandis que d’autres voies comme STAT5 ne sont pas affectées. SOCS1 n’influe pas directement l’activité du récepteur mais agit en inhibant certainement des voies de signalisation induites par celui-ci. La place et le rôle de SOCS1 dans les voies de signalisation restent à préciser.
Les récepteurs décrits pour être régulés par les SOCS le sont très souvent par plusieurs membres, c’est pourquoi nous caractérisons actuellement les interactions entre d’autres protéines SOCS, et le récepteur KIT. De plus, nous chercherons à analyser le rôle régulateur de ces molécules SOCS sur la prolifération cellulaire liée à KIT. Enfin nous testerons si la régulation exercée par les SOCS est maintenue au niveau des formes oncogéniques de KIT.
Ces travaux permettront une meilleure compréhension de la signalisation induite par la forme sauvage de KIT et de ce fait des mécanismes mis en jeu par ses formes oncogéniques. La caractérisation des mécanismes inhibiteurs de la signalisation pourrait à terme aider au développement de drogues mimant l’interaction inhibitrice entre ces deux molécules.

n 45

Impact des modifications nucléotidiques de signification inconnue sur l’épissage : étude des gènes BRCA 1 et 2

Caux-Moncoutier V, Michaux D, Pagès-Berhouet S, Dehainault C, Laugé A, Coupier I, Gauthier-Villars M, Stoppa-Lyonnet D, Houdayer C

Institut Curie, Paris, France.

Cinq à 10 % des cancers du sein et/ou de l’ovaire ont une origine génétique, liée principalement à des altérations des gènes BRCA, dont la grande majorité génère une protéine tronquée par décalage du cadre de lecture ou mutation non-sens. De façon étonnante les mutations d’épissage ne représenteraient que 5 % du spectre mutationnel de BRCA contre 50 % pour NF 1 ou ATM. Cependant, près de 40 % des modifications identifiées sur BRCA (introniques, petites délétions inframe, neutres et faux sens) ne fournissent pas d’interprétation lisible en génomique et ont été rapportées comme unknown variants (UV).
Nous avons donc débuté une étude systématique de l’impact de ces UV sur l’épissage et rapportons ici nos premiers résultats portant sur 11 UV BRCA 1 et 9 UV BRCA 2. Notre stratégie a regroupé modélisation informatique et étude sur ARN. Chaque UV a été modélisé à l’aide de 5 sites web dédiés à l’épissage (Splice Site Finder, Splice Site Prediction, MaxEntScan, ESE Finder et GeneSplicer). L’ARN a été extrait de lignées lymphoblastiques cultivées parallèlement avec et sans puromycine afin d’optimiser l’identification des transcrits anormaux instables. Après RT-PCR, les amplicons sont séparés sur gel d’agarose afin d’identifier des fragments anormaux, qui sont ensuite excisés du gel et séquencés. En l’absence de fragments anormaux, nous avons utilisé une approche d’hémizygotie transcriptionnelle en recherchant par séquençage la présence des UV exoniques. Pour les UV introniques, nous avons utilisé des polymorphismes codants identifiés lors du screening mutationnel. Afin d’évaluer les niveaux d’expression relatifs de chaque allèle, une approche PCR allèle-spécifique à l’aide d’amorces chimères LNA (locked nucleic acids) a été développée. Cette approche LNA présente aussi l’avantage d’amener à une détection – et donc à une caractérisation par séquençage – beaucoup plus aisée car il est aussi possible d’amplifier en grande quantité et de façon spécifique le transcrit anormal, même instable.
Sur les 20 UV étudiés, des anomalies de type saut d’exon et/ou création de site cryptique ont été observées dans 8 cas. Ces anomalies avaient été prédites par l’analyse logicielle. Une hémizygotie transcriptionelle a également été mise en évidence.
Ces résultats préliminaires plaident en faveur d’une exploration de l’impact des UV sur l’épissage. L’étude va donc être poursuivie sur un plus grand nombre de cas et, si ces premiers résultats se confirment, il s’agira, in fine, de définir une stratégie d’analyse moléculaire autorisant un basculement diagnostique.

n 46

DNAM-1/CD226 et PVR/CD155 régule la migration des monocytes au travers des jonctions endothéliales

Reymond N1, Imbert AM2, Devilard E3, Fabre S1, Chabannon C2, Xerri L3, Farnarier C4, Cantoni C5, 6, Bottino C5, Moretta A6, Dubreuil P1, Lopez M1

1 UMR599, Inserm, Hématologie moléculaire, Marseille ;
2
Institut Paoli-Calmettes, Centre de thérapie cellulaire et génique, Marseille ;
3 Institut Paoli-Calmettes, Laboratoire de bio-pathologie, Marseille ;
4 U600, Inserm, Adhésion cellulaire, Marseille, France ;
5 Instituto G. Gaslini, Genova, Italia ;
6 Università di Genova, Diparimento di Medicina Sperimentale, Genova, Italia.

Les processus de migration des leucocytes au travers de l’endothélium représentent une étape fondamentale au cours de la surveillance immunitaire et de la réaction inflammatoire. Des processus de migration analogues, entre cellules tumorales et endothélium, sont décrits au cours des phases de progression tumorale. L’action coordonnée de différentes molécules d’adhérence contrôle les différentes phases de la migration que sont le rolling, l’attachement et la diapédèse. Si les deux premières phases sont bien décrites, l’étape ultime de diapédèse est encore mal comprise. Des données récentes montrent que certaines molécules d’adhérence jonctionnelles endothéliales (CD31, CD99, JAM) participent aux phénomènes de traction/guidance des leucocytes au niveau de la jonction inter-endothéliale. Les nectines sont des molécules d’adhérence co-localisées avec la cadhérine-E au niveau des jonctions épithéliales. Elles interagissent avec elles-mêmes (homophilie), entre elles ou avec des membres d’autres familles (hétérophilie). Nous montrons que certaines nectines (nectine-2 et PVR) sont localisées au niveau des jonctions adhérentes endothéliales in vitro (HUVEC) et in vivo (placenta, peau) suggérant qu’elles puissent contrôler les phénomènes de diapédèse leucocytaire [1]. Nous avons récemment montré que la molécule DNAM-1 était un ligand de PVR et nectine-2 et contribuait à la lyse NK [2]. DNAM-1 est exprimée sur les lymphocytes T, les cellules NK et les monocytes. De manière intéressante, une forme recombinante soluble de DNAM-1 (DNAM-1Fc) se fixe spécifiquement au niveau des jonctions inter-endothéliales et cette interaction est totalement bloquée en présence d’anticorps (Ac) anti-PVR. Ces données suggèrent fortement que DNAM-1 interagit spécifiquement et uniquement sur PVR exprimé aux jonctions intercellulaires. Le rôle fonctionnel de cette interaction a pu être mis en évidence en montrant que des Ac Fab anti-PVR ou des Ac Fab anti-DNAM-1 affecte in vitro la diapédèse des monocytes au travers des jonctions inter-endothéliales [3]. L’implication des nectines dans la physiopathologie inflammatoire de l’endothélium et dans la surveillance immunitaire est à l’étude.

1. Lopez et al., Blood 1998, 92, 4602.

2. Bottino et al., J Exp Med, 2003, 198, 557.

3. Reymond et al., in press, J Exp Med, 2004.

n 47

Rôle d’Aurora A dans la régulation de la traduction de la cycline B

Lapasset L, Pradet-Balade B, Lozano JC, Peaucellier G. Picard A

Laboratoire Arago, UMR 7628, BP 44, 66651 Banyuls sur Mer.

Le complexe CDK 1 (cyclin-dependent kinase 1) – cycline B déclenche la division des cellules somatiques (mitose) et des ovocytes (méiose). Les mécanismes de la maturation méiotique et du développement précoce se déroulent sans transcription. Les néo-synthèses protéiques sont donc exclusivement régulées au niveau de la traduction. Ainsi, les traductions des ARN messagers (ARNm) de la cycline B et du proto-oncogène c-mos sont déclenchées à des étapes précises de la méiose. Nos objectifs sont d’analyser les mécanismes responsables de ces régulations. Les ovocytes d’étoile de mer, parfaitement synchronisés, nous offrent un modèle de qualité.

Les ARNm de la cycline B et de c-mos présentent dans leur région 3’ non traduite un élément de séquence conservé, impliqué dans le contrôle de la traduction appelé CPE (cytoplasmic polyadenylation element). Cet élément permet aux ARNm d’être reconnus par la machinerie de traduction et recrutés par les polysomes, à des temps précis. Le modèle de traduction CPE-dépendant repose sur l’interaction de facteurs protéiques tels que l’oncogène Aurora A et CPEB qui lie les CPE. Aurora A active (phosphorylée) phosphoryle CPEB, par conséquent les ARNm ayant des CPE sont poly-adénylés et traduits. De fait, CPEB phosphorylée est associée aux polysomes lourds aux temps de traduction de la cycline B, c’est-à-dire lorsque ses ARNm sont associés aux polysomes. Dans des ovocytes énucléés en cours de maturation, malgré l’activité de CDK1, Aurora A n’est pas active, CPEB n’est pas phosphorylée et la traduction de la cycline B est fortement réduite. L’inactivation d’Aurora semble être due à la présence d’un inhibiteur nucléaire de phosphatase. En effet, l’injection d’acide okadaïque, inhibiteur de la protéine phosphatase 1 (PP1) favorise l’activation de Aurora, la phosphorylation de CPEB et enfin la traduction de cycline B. L’injection d’Aurora constitutivement active dans des œufs énucléés entraîne un état de phosphorylation intermédiaire de CPEB suffisant pour déclencher la cascade des MAP kinases induite par c-mos. Les états de phosphorylations séquentielles de CPEB semblent avoir des implications différentes dans la régulation des traductions CPE-dépendantes. Nos travaux se focaliseront, entre autres, sur leur caractérisation et sur le rôle des phosphatases nucléaires impliquées dans cette dynamique traductionnelle.

La sur-expression d’Aurora, l’aneuploïdie et l’amplification des centrosomes sont caractéristiques de nombreux cancers. D’autre part, l’état tumoral est favorisé par la dérégulation de l’expression des cyclines mitotiques. L’effet oncogénique d’Aurora via la sur-expression de la cycline B reste à déterminer.

n 48

Étude fonctionnelle d’une protéine impliquée dans la maturation méiotique chez la souris

Dumont J1, Lefebvre C2, Terret ME1, Rassignier P1, Verlhac MH1

1 Equipe divisions méiotiques chez la souris, UMR7622, 9, quai St Bernard Bât.C 5e étage, 75252 Paris Cedex 05 ;
2 Centre de Génétique Moléculaire, Avenue de la Terasse, 91198 Gif-sur-Yvette

La maturation méiotique est l’étape finale de l’ovogenèse, elle conduit à la formation des gamètes femelles arrêtés en seconde phase M de division méiotique (métaphase II) en l’attente de la fécondation : les ovocytes. Les MAPK (mitogen activated protein kinase) sont des protéines impliquées dans de nombreuses voies de transduction de signaux extra-cellulaires. Dans l’ovocyte de souris, les MAP kinases ERK1 et ERK2 (extracellular regulated kinase 1 et 2) interviennent dans le contrôle du blocage des ovocytes en métaphase II. Nous avons, au laboratoire, recherché les partenaires des MAPK impliqués dans ce processus. Ce crible nous a permis de mettre en évidence la protéine MISS (MAPK interacting and spindle stabilizing). Elle ne présente aucune homologie avec des protéines décrites ou présentes dans les bases de données, elle est phosphorylée par les MAPK et impliquée dans le contrôle de la stabilité du fuseau de métaphase II. Elle présente quatre sites potentiels de phosphorylation par les MAPK, une séquence PEST (séquence impliquée dans la dégradation des protéines par le protéasome), une séquence NLS (nuclear localization signal) bipartite et une séquence d’ancrage aux MAPK. La protéine MISS endogène n’est pas détectable en immunofluorescence dans les ovocytes immatures et s’accumule après la reprise de la méiose, elle est présente en métaphase II où elle se localise le long du fuseau. En western-blot, la protéine de fusion myc-MISS ne s’accumule qu’en métaphase II et disparaît après activation parthénogénétique (activation mimant la fécondation). L’injection d’ARN anti-sens, d’ARN double-brin, ou de morpholinos dirigés contre l’ARN codant MISS dans des ovocytes immatures de souris, n’a aucun effet sur la reprise de la méiose, la migration du fuseau de métaphase I vers le cortex, l’expulsion du premier globule polaire et la formation du fuseau de métaphase II. Par contre, elle induit une déstabilisation de ce fuseau qui se désagrège ou devient monopolaire, ainsi que l’apparition de nombreux asters cytoplasmiques (sites de nucléation de microtubules). L’injection de ces molécules dans des zygotes (embryons au stade une cellule) ou des embryons au stade deux cellules n’a aucun effet sur le développement précoce des embryons. D’autre part, l’injection d’ARN codant une forme mutante de MISS où deux sites potentiels de phosphorylation sont modifiés provoque l’apparition de fuseaux de métaphase II présentant un aspect vrillé atypique dans 44 % des ovocytes traités. Ces résultats préliminaires montrent que la phosphorylation de MISS par les MAPK est impliquée dans sa fonction de maintien de l’intégrité de la structure du fuseau de métaphase II et donc probablement dans la fécondabilité des ovocytes de souris.

n 49

Altérations génétiques de la région 16q24 impliquées dans la diffusion métastatique du carcinome hépatocellulaire

Riou P1, Saffroy R1, Bralet MP2, Chiappini F1, Azoulay D1, Uzan G1, Piatier-Tonneau D3, Lemoine A1, Debuire B1

1 Inserm U602,
2 Laboratoire d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Hôpital Paul Brousse, 12, avenue Paul Vaillant Couturier, 94804 Villejuif ;
3
 CNRS-FRE 2571,7, rue Guy Moquet, 94801 Villejuif Cedex.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur primitive du foie de mauvais pronostic dont la récidive est fréquente et pour laquelle, seule la transplantation hépatique donne de bons résultats avec cependant 20 % de récidives, d’où la nécessité de disposer de marqueurs moléculaires fiables du potentiel métastatique.
Dans ce cadre nous avons montré que l’instabilité d’un microsatellite spécifique, D16S402, situé en 16q24, était associée à un risque accru de récidive métastatique chez les patients opérés pour CHC. De plus, ces altérations en 16q ont été préférentiellement observées dans les métastases pulmonaires de ces patients atteints de CHC. Après avoir analysé l’expression des 13 gènes connus à ce jour dans cette région chromosomique dans des CHC, nous nous focalisons sur l’étude de CDH13, un membre atypique de la famille des cadhérines. Nous avons montré sa surexpression significative (d’un facteur 5 en moyenne) dans les tumeurs primitives du foie par rapport au foie non tumoral adjacent ou des foies normaux ainsi que dans une lignée cellulaire d’hépatome, Mahlavu, qui présente un très fort potentiel invasif in vitro. Le potentiel invasif, in vitro, de Mahlavu transfectée avec un siRNA irrelevant a été comparé à celui de la même lignée transfectée avec un siRNA dirigé contre CDH13. Après 24 h de culture sur chambre d’invasion, les cellules transfectées avec le siRNA dirigé contre CDH13 ont présenté une diminution de leur potentiel invasif d’environ 40 % par rapport à la lignée contrôle, confirmant ainsi l’implication de CDH13 dans l’invasion tumorale. Nous avons également mis au point un modèle animal permettant l’étude des mécanismes de diffusion métastatique où les souris injectées en intrahépatique avec la lignée cellulaire Mahlavu développent des métastases pulmonaires.
Nous poursuivons nos travaux par l’étude du rôle de CDH13 dans la dissémination tumorale : 1) in vivo en inhibant l’expression de CDH13 dans Mahlavu à l’aide de shRNA dans le but d’analyser son incidence sur la formation de métastases pulmonaires ; 2) par la technologie des puces à ADN entre Mahlavu transfectée avec un siRNA irrelevant et Mahlavu transfectée avec un siRNA dirigé contre CDH13 dans le but d’identifier les réseaux de signalisation impliquant CDH13 dans la diffusion métastatique du CHC.

n 50

Étude des mécanismes d’inhibition de l’activité AP-1 par les rétinoïdes dans une lignée de cancer mammaire

Dedieu S1, Martin P1, Formstecher P1, Lefebvre P1

1 Inserm U459, équipe labellisée « La Ligue Contre Le Cancer », Faculté de Médecine de Lille, 59045 Lille Cedex.

Le potentiel bénéfique des rétinoïdes dans la chimio-prévention et le traitement de certains cancers est directement lié à leur faculté à inhiber la croissance cellulaire et à induire l’apoptose et la différenciation d’un grand nombre de lignées cellulaires tumorales. Les relais essentiels des effets biologiques des rétinoïdes sont les récepteurs nucléaires de type RAR et RXR qui sont capables de moduler l’expression de nombreux gènes cibles par deux voies distinctes. Outre leur capacité de transactivation par l’intermédiaire de leur liaison aux éléments de réponse, les rétinoïdes exercent une activité transrépressive et répriment ainsi l’expression d’un certain nombre de gènes le plus souvent associés à la prolifération cellulaire et/ou aux phénomènes inflammatoires. C’est leur capacité à interférer avec l’activité d’autres facteurs de transcription, comme celle du complexe AP-1 (jun/fos), qui semble être responsable en grande partie des effets antitumoraux des rétinoïdes. Les mécanismes par lesquels les rétinoïdes exercent leur activité transrépressive sont encore très méconnus et sont directement influencés par l’environnement cellulaire engendrant ainsi une spécificité tissulaire et génique qui rend la caractérisation des bases moléculaires de ces effets transrépresseurs extrêmement difficile.
De façon à élucider ces mécanismes, nous avons choisi d’étudier deux gènes modèles codant pour deux métalloprotéinases (collagénase-1 et stromélysine-1), connus pour être régulés positivement par AP-1 et dont les protéines sont largement impliquées dans les phénomènes cancéreux. Nous avons donc caractérisé la réponse de ces gènes aux activateurs d’AP-1 et défini la capacité de transrépression des rétinoïdes dans une lignée cellulaire de cancer mammaire (MCF-7). L’expression de chaque membre de la famille AP-1 a également été définie en conditions d’induction de l’activité AP-1 et de transrépression par les rétinoïdes. Des stratégies de surexpression de différents co-activateurs (SRC1, p300, DRIP205, GRIP1) et de certains membres des familles fos (fra-1, fra-2) et jun (junB, junD) ont également été réalisées dans le but de moduler la capacité de transrépression par l’acide rétinoïque. De plus, nous avons identifié dans notre modèle d’étude les différentes voies de signalisation impliquées lors de l’activation du complexe AP-1 et régulant transcriptionnellement l’expression de la collagénase-1 et de la stromélysine-1. Enfin, la capacité des rétinoïdes à interférer avec les voies de transduction du signal au niveau des modules MEK/ERK et MKK6/p38 a été mise en évidence.
Notre approche nous permet donc de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés aux rétinoïdes et ainsi de mieux appréhender le potentiel anti-cancéreux de ces composés.

n 51

Analyse moléculaire du contrôle de la prolifération des cellules épithéliales des cryptes intestinales par l’hormone T3 et son récepteur nucléaire TR alpha1

Plateroti M, Mori JI, Kress E et Samarut J

Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, ENS-Lyon. 46, Allée d’Italie 69364 Lyon 07.

Les hormones thyroïdiennes, T3 et T4, régulent la maturation intestinale chez les vertébrés. Leur action est modulée par des récepteurs nucléaires, les TR, qui agissent en tant que facteur de transcription dépendant de la T3. Les récepteurs TR sont codés par les gènes TRα et TRβ. L’utilisation de souris dépourvues de ces gènes (simples et double knock out TRα et TRβ) nous a permis de démontrer que TRα est nécessaire pour le développement correcte de l’intestin grêle au moment du sevrage. De plus les animaux TRα0/0, caractérisés par l’absence d’expression de tous produits du gène TRα, présentent une forte réduction du taux de prolifération de l’épithélium intestinal à partir de stades fœtales tardifs.
Pour analyser les mécanismes moléculaires responsables du contrôle par les hormones thyroïdiennes et le gène TRα de la prolifération épithéliale des cryptes intestinales, nous avons débuté une étude de l’expression de gènes clés, connus pour être impliqués dans ce processus. Nous nous focalisons actuellement sur des régulateurs du cycle cellulaire ainsi que sur des gènes de la voie signalétique Wnt/β-caténine. Des résultats préliminaires nous indiquent que les hormones thyroïdiennes et le récepteur TRα1 contrôlent positivement in vivo l’expression des Cyclines D1 et D2 dans l’intestin grêle. Nous avons pu également mettre en évidence une régulation positive du gène de la β-caténine. Pour comprendre s’il s’agit d’un contrôle cellule épithéliale-autonome nous avons mis au point un système de culture primaire de cellules épithéliales intestinales. De manière intéressante, l’addition de T3 dans le milieu de culture stimule la prolifération épithéliale, comparé au culture maintenue en absence de T3. Ce résultat a été obtenu sur des cultures issues d’intestin d’animaux sauvages et d’animaux TRβ-/-, les cultures issues d’animaux TRα0/0 ne répondant pas à la stimulation par la T3.
En conclusion, l’utilisation des souris knock out pour les gènes TR nous a permis de démontrer que les hormones thyroïdiennes et le récepteur TRα1 contrôlent la prolifération des progéniteurs épithéliaux des cryptes intestinales. De plus les expériences in vitro nous ont indiqué que ce contrôle est cellule épithéliale-autonome. Finalement, les données concernant la régulation de l’expression de gènes ont pu mettre en évidence le lien fonctionnel entre hormones thyroïdiennes-TRα1 et des gènes qui contrôlent le cycle cellulaire ainsi que de ceux appartenant à la voie de signalisation Wnt/β-caténine. Il est bien connu que des mutations de différents partenaires de ces deux voies sont responsables d’un grand nombre de tumeurs au niveau de l’intestin chez l’homme, toutes ces mutations induisant une activation constitutive et par conséquent une prolifération cellulaire incontrôlée.
En perspective plus à long terme ce travail se poursuit pour définir encore plus en détail les mécanismes impliqués dans ce contrôle. Par une approche d’analyse du transcriptome nous étudierons les gènes cibles de HT-TRα1 dans les cryptes intestinales. Cela permettra de décrire d’une manière détaillée les voie signalétiques dépendantes de TRα1 dans la prolifération épithéliale. Nous sommes également en train d’analyser des tumeurs issus de l’intestin grêle et du côlon pour évaluer si elles ont un taux anormal d’expression de TRα1 par rapport au tissu non tumoral.

n 52

Rôle de la protéine TACC1 dans la fonction des récepteurs à l’hormone thyroïdienne et étude de l’expression des gènes TACC dans des tumeurs primaires

Vincent S1*, Ravel-Chapuis P1*, Auclair J2, Puisieux A2, Wang Q2, Samarut J1

1 UMR 5161 LBMC, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 46 allée d’Italie, 69007 Lyon ;
2
 Inserm U590, UCBL1, Centre Léon Bérard, 28 rue Laennec, 69008 Lyon.

L’hormone thyroïdienne T3 se fixe à des récepteurs (TR) qui appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires d’hormones. Ces récepteurs sont des facteurs de transcription qui répriment ou activent la transcription de gènes cibles. Nous avons mis en évidence au laboratoire une interaction entre les TR et la protéine TACC1. TACC1 appartient à une famille de protéines composée chez l’homme de 3 membres TACC1, 2 et 3, qui partagent dans leur partie C-terminale un domaine coiled coil de 200 aa très conservés. Par leur fonction au niveau du centrosome et du fuseau mitotique, les protéines TACC pourraient être impliquées dans la progression tumorale. Par leur fonction de cofacteur de transcription, elles peuvent également entraîner la dérégulation d’expression génique et conduire la cellule dans un processus tumoral.
Le but de notre étude est de définir le rôle de TACC1 dans la transcription via les TR et de préciser le rôle des protéines TACC dans les processus tumoraux.
L’interaction TR/TACC1 a été confirmée, in vitro par GST pull down. In vivo, après surexpression en cellules, on observe qu’une partie de TR est relocalisée du noyau jusque dans des structures particulières formées par TACC1 dans le cytoplasme. La caractérisation de l’interaction TR/TACC1, par double hybride en levures, a permis : de montrer que TACC1 a certaines caractéristiques d’un corépresseur de transcription ; de déterminer les domaines d’interaction sur les deux protéines ; d’établir que l’interaction TR/TACC1 est très spécifique car TACC1 n’interagit pas avec d’autres récepteurs nucléaires et TACC2 et 3 n’interagissent pas avec TR.
Dans des tumeurs primaires mammaires, nous avons mis en évidence par RT-PCR quantitative une dérégulation de l’expression des gènes TACC, une sous-expression des ARNm de TACC1 et 2 dans plus de 80 % des cas et de TACC3 dans 100 % des cas. Une sous-expression de TACC1 a également été révélée par hybridation sur membrane cancer profiling arrays dans des tumeurs du côlon par rapport au tissu sain. Les protéines TACC seraient donc suppresseurs de tumeurs. Si l’expression des protéines reflète l’expression de leurs ARNm, les protéines TACC seraient des suppresseurs de tumeurs.

Ces auteurs ont contribué également au travail.

n 53

La surexpression de NACA, un co-activateur de transcription, influence la différenciation érythroïde humaine in vitro

Lopez S1, Fichelson S2, Dubart-Kupperschmitt A2, St Arnaud R3, Dubreuil P1, Gomez S1

1 U119 Inserm, 27 Bld Leï Roure, 13009 Marseille, France ;
2 Institut Cochin, Inserm U567, CNRS UMR 8104, Département d’Hématologie, Maternité de Port-Royal, 123 Bld de Port-Royal, 75014 Paris, France ;
3
 Genetics Unit, Shriners Hospital, 1529 Cedar Avenue Montreal, (Quebec) H3G 1A6, Canada.

Au cours d’une étude sur la recherche de gènes régulés par les cytokines dans les cellules hématopoiétiques, nous avons identifié le gène NACA (chaîne alpha du complexe associé aux polypeptides naissants) dont aucun rôle ne lui avait été décrit en hématopoïèse.
Afin de comprendre le rôle de NACA dans l’hématopoïèse humaine, nous avons analysé sa distribution protéique au cours de la différenciation in vitro de progéniteurs humains CD34+ dans les lignages érythroïde, mégacaryocytaire et granulocytaire. Cette étude a montré que NACA est exprimée dans les progéniteurs hématopoiétiques humains CD34+ issus de sang de cordon et cette expression est maintenue uniquement au cours de la différenciation érythroïde.
Nous avons alors évalué l’effet de la surexpression de NACA dans les cellules CD34+ humaines en utilisant un vecteur lentiviral. Les cellules transduites ont été cultivées en méthylcellulose pour la formation de colonies CFU-GM et BFU-E ou en milieu liquide in vitro en condition de différenciation érythroïde, mégacaryocytaire et granulocytaire. Le développement des lignées mégacaryocytaire et granulocytaire n’est pas affecté par cette surexpression. Par contre, l’analyse des colonies montre que les BFU-E, issues des CD34+ transduites avec NACA, sont deux à trois fois plus grosses que celles provenant de cellules non transduites ou transduites avec un vecteur contrôle. De plus, la production d’hémoglobine est observable à partir de 7 jours de culture versus 10 jours pour les cellules contrôles. Ce résultat suggère que NACA intervient dans la différenciation érythroïde. Cette hypothèse est renforcée par l’analyse de l’apparition du marqueur glycophorine A dans les cultures liquides, dont l’expression est détectable sur 50 % des cellules transduites avec NACA alors que seules 20 % des cellules transduites avec un vecteur contrôle expriment ce marqueur au 5e jour de culture. D’autre part, la surexpression de NACA dans les cellules TF1 entraîne la synthèse d’hémoglobine en l’absence d’érythropoïétine.
Ces résultats démontrent pour la première fois que NACA est impliqué dans la régulation de l’érythropoïèse humaine. Il exerce ainsi un nouveau contrôle transcriptionnel dans la prolifération et dans la différenciation de cellules érythroïdes, probablement en collaboration avec d’autres facteurs de transcription. Le mécanisme moléculaire par lequel NACA joue son rôle dans l’érythropoïèse reste à déterminer.

n 54

Dysfonctionnement de la protéine TRF2 et transformation tumorale

Brunori M1, Mathieu N2, Koering C1, Ricoul M2, Puisieux I3, Puisieux A3, Sabatier L2,Gilson E1

1 Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire, UMR5665, Centre National de la Recherche Scientifique, Ecole Normale Supérieure de Lyon, 46 Allée d’Italie, 69364 Lyon Cedex 07 ;
2 CEA (Commissariat a l’Energie Atomique), Laboratoire de Radiobiologie et Oncologie, BP6, Fontenay-aux-Roses ;
3
 Unité d’Oncologie Moléculaire, Centre Léon Berard, 28 rue Laennec, 69373 Lyon Cedex 08.

Le but de ce travail était d’étudier le rôle de TRF2 (telomeric binding factor 2), une protéine jouant un rôle clef dans la protection des télomères contre leur fusion, dans le processus de transformation des cellules humaines.
Les télomères sont des structures nucléoprotéiques qui coiffent les chromosomes eucaryotes. Ils contrôlent la prolifération des cellules et ils sont essentiels pour les fonctions et la stabilité du génome. Les complexes télomériques humains sont organisés à partir de protéines spécialisées pour interagir spécifiquement avec l’ADN télomérique. Il est bien établi que la télomérase, l’enzyme qui ajoute les répétitions d’ADN télomérique aux extrémités des chromosomes, est un acteur clef de l’oncogenèse. De surcroît, il apparaît de plus en plus clairement qu’en plus de l’activité télomérase, les autres constituants de la chromatine télomérique peuvent contrôler la structure et la fonction des télomères. Le contrôle de la télomérase et des fonctions télomériques par les protéines de la chromatine télomérique suggèrent que leur altération puisse jouer un rôle dans l’oncogenèse chez l’homme.
La protéine TRF2 joue un rôle clef dans la protection des télomères contre leur fusion et il a été montré que son inactivation entraîne de l’instabilité chromosomique, événement clé de la transformation des cellules humaines. Afin de déterminer le rôle d’un dysfonctionnement de TRF2 au cours de ce processus, nous avons produit des rétrovirus exprimant différents allèles de TERF2 (TTAGGG repeat factor 2) que nous avons utilisés pour transfecter des fibroblastes immortalisés par l’expression combinée de hTERT (la sous-unité catalytique de la télomérase) et des antigènes petit et grand T du SV40 [Hahn et al., Nature 1999 ; 400 : 464-8]. Par comparaison des phénotypes des cellules exprimant les différents allèles, nous avons observé une corrélation significative entre le niveau d’instabilité chromosomique et les défauts de croissance. Ceci concorde avec des données précédemment obtenues par le laboratoire de T. de Lange [De Lange, Oncogene 2002 ; 21 : 532-40]. Il est intéressant de noter que les anomalies chromosomiques sont détectables dans des cultures à long terme qui ont perdu l’expression de l’allèle TERF2. Ceci suggère que du pic d’instabilité chromosomique induit par le dysfonctionnement de TRF2 aux stades précoces de la culture, résulte un ensemble de réarrangements chromosomiques stables dans les stades tardifs. Soulignons que ces cultures tardives sont capables de former des colonies en milieu semi-solide à une fréquence plus élevée que des cultures équivalentes transfectées avec un rétrovirus qui n’exprime pas TERF2 ou qui exprime des allèles sans effet apparent sur l’instabilité chromosomique. Implantées à des souris immunosupprimées, ces cellules se sont révélées incapables d’y former des tumeurs. Par conséquent, il semble que le dysfonctionnement de TRF2 confère aux cellules la capacité de pousser en milieu semi-solide, phénotype caractéristique de la transformation cellulaire. Ces données suggèrent un modèle dans lequel un dysfonctionnement de TRF2 peut engendrer des mutations impliquées dans la transformation oncogénique des cellules humaines.

n 55

Mise au point de systèmes modèles permettant de générer des cellules tétraploïdes et aneuploïdes

Coquelle A1, Kroemer G1

1 Unité de Génétique Oncologique, UMR8125, 39 rue Camille Desmoulins, Institut Gustave Roussy, 94805 Villejuif.

L’aneuploïdie est une instabilité génomique entraînant la modification du nombre et/ou de la structure des chromosomes d’une cellule. C’est une propriété fréquente des cellules tumorales de mammifères, où la perte de facteur de contrôle du cycle cellulaire comme par exemple la protéine p53 favorise et augmente l’instabilité chromosomique. La détection d’aneuploïdie dans une tumeur est fréquemment corrélée avec un stade avancé du cancer, à la formation de métastases, à un mauvais pronostic et à une résistance accrue aux traitements chimiothérapeutiques. Il est maintenant admis que, au moins dans certains cas, l’aneuploïdie résulte de la tétraploïdie, c’est-à-dire de cellules ayant doublé leur nombre de chromosomes. L’identification de gènes et facteurs impliqués dans son déroulement revêt donc une importance toute particulière. Nous avons mis au point deux systèmes modèles permettant d’étudier ces mécanismes :

1) Un système permettant de générer des cellules tétraploïdes par fusion au polyéthylène glycol de deux lignées de cellules diploïdes, issues de la même lignée parentale. Nous avons introduit dans chacune de ces lignées un plasmide différent, apportant un gène de résistance à un antibiotique et une protéine fluorescente, spécifique de chaque sous-lignée. Ce système nous permet de sélectionner les cellules issues de la fusion des deux lignées de départ exclusivement et d’étudier leur devenir.

2) Un système permettant d’isoler rapidement des sous-clones tétraploïdes à partir d’une lignée parentale diploïde.

Nous comparons le comportement des cellules tétraploïdes obtenues par les deux systèmes à celui des lignées diploïdes de départ, afin de déterminer l’influence de la ploïdie sur la stabilité de ces cellules au niveau de leur caryotype (fréquence de formation des cellules aneuploïdes), leur viabilité et prolifération, leur capacité à former des tumeurs chez l’animal et l’agressivité de ces tumeurs, ainsi que leur sensibilité à différents agents chimiothérapeutiques.

Toutes ces expériences devraient nous permettre d’identifier des gènes clés impliqués dans ces phénomènes et des agents chimiothérapeutiques plus efficaces sur certains types de tumeur (diploïde/tétraploïde) afin de pouvoir, à terme, envisager des protocoles thérapeutiques adaptés à ces différents types de tumeurs

n56

Régulation de la formation des granules de stress cytoplasmiques par l’apoptosis-inducing factor ou AIF

Candé C1, Vahsen N1, Métivier D1, Kroemer G1

1 CNRS-UMR8125, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, F94805 Villejuif.

Suivant l’intensité d’un stress physique ou chimique, les cellules peuvent activer des mécanismes de défenses pour réparer les fonctions cellulaires endommagées ou bien s’orienter vers des processus apoptotiques. Une des façons de répondre à un stress oxydatif tel que l’arsenate consiste à former des granules de stress cytoplasmiques constituées de petites sous-unités ribosomales, d’ARN messager et de protéines TIA-1. Ainsi les cellules choisissent de suspendre la traduction pour éviter la synthèse de protéines de conformation inadaptée. Nous montrons ici que, suite à l’invalidation de l’expression d’AIF par la technique de l’interférence par ARN, les cellules HeLa développent un très grand nombre de granules de stress induites par l’arsenate (1 mM 3 h). Dans ces conditions plus de 80 % de ces cellules possèdent un marquage positif en immunofluorescence (détection de la protéine TIA-1 au niveau des granules) contrairement aux cellules contrôles qui n’en possèdent pas. La protéine AIF possède une activité NADH oxydoréductase et est impliquée dans l’apoptose indépendante des caspases lorsqu’elle est libérée de la mitochondrie pour induire la fragmentation nucléaire de haut poids moléculaire. L’utilisation de l’arsenate à 1 mM pendant 3 heures ne permet pas d’induire l’apoptose (faible chute du potentiel mitochondrial, pas de libération du cytochrome c, pas de marquage annexin-V positif), mais reste suffisante pour induire la formation de granules de stress dans les cellules HeLa déficientes en AIF. La transfection d’AIF murin d’expression mitochondriale dans les cellules HeLa préalablement invalidées permet de restaurer le phénotype contrôle, à savoir l’absence de formation de granules (après un stress oxydatif) contrairement à la transfection d’AIF cytosolique. Ces informations soulignent très clairement que la fonction mitochondriale, probablement la fonction NADH oxydoréductase d’AIF serait donc mise en jeu dans ce processus. L’utilisation d’une batterie de mutants a permis de confirmer ce résultat car les mutants invalidés dans la zone de fixation du NADH restaurent partiellement le phénotype contrôle, tel qu’il a été énoncé ci-dessous. De plus la formation des granules de stress dans les cellules HeLa déficientes en AIF est réversée par le glutathion ou le N-acétyl-L-cystéine, deux produits antioxydants. L’ensemble de ces résultats a également été confirmé par l’utilisation de la protéine G3BP, dont la surexpression induit la formation de granules de stress sans déclencher l’apoptose. Finalement, AIF protègerait les cellules du stress, sans doute grâce à sa fonction NADH oxydoréductase.

n57

NF-κB and p53 are the dominant apoptosis-inducing transcription factors elicited by the formation of heterokarya

Perfettini JL1, Roumier T1, Castedo M1, Larochette N1, Boya P1, Raynal B1, Lazar V2, Ciccosanti F3, Nardacci R3, Penninger F4, Piacentin M3, Kroemer G1

1 Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 8125, Institut Gustave Roussy, F-94805 Villejuif, France ;
2 Unité de Génomique Fonctionnelle, Institut Gustave Roussy, F-94805 Villejuif, France ;
3 National Institute for Infectious Diseases IRCCS “L. Spallanzani,” Rome, Italy ;
4 Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences, 1030 Vienna, Austria.

We have recently described a model of cell fusion induced cell death in which the transient activation of Cdk1/cyclin B is required for later apoptosis to occur [Ferri et al., 2000 ; Castedo et al., 2002]. In this system, the fusogenic interaction between the HIV-1 envelope and CD4 results into the formation of syncytia, which transiently activate Cdk1/cyclin B and enter the early prophase of mitosis (as defined by dismantling of the nuclear envelope) during which cyclin B is rapidly downregulated, thereby preventing further progression into mitosis [Castedo et al., 2002]. At this stage, cells activate p53, disorganize centrosomes, and undergo apoptosis. Here, we show that NF-κB, p53, and AP1 are activated in syncytia-elicited apoptosis. The nuclear factor κ B (NF-κB) super repressor had an antimitotic and antiapoptotic effect and prevented the cell fusion-elicited phosphorylation of p53 on serine 15 and 46, as well as the activation of AP1.Transfection with dominant-negative p53 abolished apoptosis and AP1 activation. Microarrays revealed that most (85 %) of the transcriptional effects of cell fusion were blocked by the p53 inhibitor pifithrin-α. Macroarrays led to the identification of several syncytia-elicited, p53-dependent proapoptotic transcripts, in particular Puma, a proapoptotic “BH3-only” protein from the Bcl-2 family known to activate Bax/Bak. Down modulation of Puma by antisense oligonucleotides, as well as RNA interference of Bax and Bak, prevented syncytia-induced apoptosis. Altogether, these data indicate that NF-κB and p53 cooperate as the dominant proapoptotic transcription factors participating in heterokarya-induced cell death. Dysregulation of this apoptotic program can favor the generation of aneuploid cells and could participate in oncogenesis.

n 58

Effet suppresseur du facteur de transcription ICBP90 sur l’activité et l’expression de la protéine régulatrice pRB : implication dans le contrôle de la transition G1/S du cycle cellulaire

Jeanblanc M, Mousli M, Bathami K, Mathieu E, Abbady AQ, Bronner C

Inserm UMRS 392, Faculté de Pharmacie, 74 route du Rhin, BP24, 67401, Illkirch Cedex, France.

L’ICBP90 (inverted ccaat box binding protein of 90 kDa) a été identifiée par notre équipe à partir du système simple hybride comme étant un facteur de transcription régulant l’expression de la topoisomérase IIα. Il y a de plus en plus d’évidences pour dire que l’ICBP90 fait partie d’une sous-famille de E3-ligases dont le rôle serait corrélé à la dégradation de certaines protéines nucléaires et à la régulation de l’expression génique. Cette sous-famille d’enzymes jouerait un rôle important dans l’entrée en phase S du cycle cellulaire par des mécanismes non encore élucidés.
Notre objectif est par conséquent d’identifier les protéines capables d’interagir avec l’ICBP90 pour tenter de comprendre ces mécanismes. L’étude de la séquence primaire de l’ICBP90 fait apparaître l’existence de motifs consensus LXCXE, caractéristiques des protéines capables d’interagir avec la famille de protéines du rétinoblastome (pRB). La pRB au même titre que p53 présente des vertus de suppresseur de tumeur, comme en témoigne l’observation que dans plus de 60 % des tumeurs humaines elle est inactivée de façon directe ou indirecte. La pRB gouverne l’entrée en phase S au cours du cycle cellulaire après avoir participé au contrôle de l’intégrité du génome.
Dans des fibroblastes pulmonaires, nous avons constaté à l’aide d’expériences d’immunoprécipitation, que l’ICBP90 et la pRB étaient présentes au niveau d’un même complexe protéique et que ces deux protéines étaient co-localisées au niveau nucléaire. Par ailleurs, nous avons observé que la surexpression de l’ICBP90 induisait une diminution dose-dépendante de l’expression de la pRB, aussi bien au niveau protéique qu’au niveau transcriptionnel. En cytométrie en flux, la sur-expression de l’ICBP0 au sein de cellules préalablement synchronisées en phase G1 conduit à une accélération de l’entrée en phase S (près de 20 % des cellules sur l’ensemble des phases S et G2/M). Ces résultats suggèrent une participation active de l’ICBP90 dans la régulation du cycle cellulaire en réprimant l’expression de la pRB au cours de la transition G1/S. L’ICBP90 apparaît donc comme un élément majeur permettant de réguler la prolifération cellulaire, mécanisme pouvant expliquer le niveau d’expression particulièrement élevé de l’ICBP90 rencontré au sein des cellules cancéreuses.

n 59

La sémaphorine SEMA3F exerce un effet répulsif sur des lignées de cancer mammaire

Nasarre P1, Kusy S1, Constantin B1, Castellani V2, Drabkin H3, Bagnard D4, Roche J1

1 IPBC CNRS UMR 6187, 40 avenue du Recteur Pineau, 86022 Poitiers, France ;
2 CGMC, Université Lyon I, 11 Boulevard du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne, France ;
3
 Division of Medical Oncology, UCHSC, 4200 East Ninth Avenue, Denver, CO 80262, USA ;
4 Inserm U575, Centre de Neurochimie, 5 rue Blaise Pascal, 67084 Strasbourg, France.

Les sémaphorines de classe 3 sont des protéines sécrétées qui ont été initialement identifiées pour leur rôle répulsif sur les cônes de croissance au cours du développement du système nerveux. Cependant, leur expression étendue à d’autres tissus suggère une fonction plus large de ces molécules. Les sémaphorines possèdent deux types de récepteurs, les neuropilines (NRP) 1 et 2, qui peuvent former un complexe avec les plexines activant ainsi la cascade de signalisation intracellulaire des sémaphorines.
Le gène de la sémaphorine SEMA3F a été localisé dans la région 3p21.3 qui subit de fréquentes pertes d’hétérozygotie dans les cancers du poumon et du sein. SEMA3F pourrait donc avoir un rôle anti-tumoral dans ces deux types de cancers. Nous avons montré qu’il existe une corrélation inverse entre l’expression du facteur de croissance des cellules endothéliales, le VEGF, et de SEMA3F dans les tumeurs pulmonaires et que SEMA3F est localisée au niveau de la membrane des cellules motiles. Ces résultats suggèrent une compétition entre VEGF et SEMA3F pour réguler la motilité, l’invasion et l’adhérence des cellules.
Nous nous intéressons actuellement au rôle de SEMA3F dans deux lignées de cancer du sein, MCF7 et C100, qui ont un profil d’expression différent de SEMA3F et des neuropilines. Les MCF7 expriment fortement SEMA3F et NRP1 ; en revanche, les C100 expriment NRP1 et 2 mais pas SEMA3F. Dernièrement, nous nous sommes intéressés au rôle de SEMA3F dans la migration cellulaire. Par l’utilisation des techniques de co-cultures et de stripes, nous avons observé que SEMA3F exerce un effet répulsif sur les C100. De plus, par l’utilisation d’anticorps bloquants dirigés contre les neuropilines et la plexine A1, nous avons montré que cet effet nécessite NRP2 et la plexine A1. D’autre part, cette répulsion est spécifique de SEMA3F puisque ni Sema3A, ni Sema3C n’ont d’effet sur le motilité des C100. Bien que SEMA3F n’induise pas de migration des cellules MCF7, les techniques de microcinématographie nous ont permis d’observer qu’une stimulation de 24 heures par SEMA3F entraîne une désagrégation des îlots cellulaires ainsi qu’une réduction de la prolifération. Ainsi, par l’activation de complexes récepteurs différents, SEMA3F pourrait avoir un rôle anti-migratoire.

n 60

Effets synergiques de la thrombospondine 1 et de l’inhibition du récepteur aux androgènes sur la croissance du carcinome prostatique humain in vivo

Merle C1, Bozec A3, Colombel LM2, Courtin A1, Brouillet C1, Chene L4, Clezardin P2, Benhamed M3, Cabon F1

1 CNRS UPR 9079, Institut André Lwoff, 7 rue Guy Moquet, 94801 Villejuif ;
2 Inserm U403 Lyon ;
3
 Inserm U406 Lyon ;
4
 Urogène, Evry.

Le cancer de la prostate représente la deuxième cause de mortalité par cancer chez l’homme, et les traitements hormonaux actuels, après une période de régression tumorale de quelques mois, échouent du fait du développement de tumeurs indépendantes des androgènes.
La croissance du carcinome prostatique est initialement strictement dépendante des androgènes. Ceux-ci se fixent spécifiquement au récepteur des androgènes (AR), qui régule la transcription de gènes contrôlant notamment le cycle cellulaire, le prostate-specific antigen (PSA) et l’angiogenèse. AR régule en particulier l’expression d’un facteur pro-angiogénique, le vascular endothelial growth factor (VEGF), et nous venons de montrer qu’il réprime l’expression d’un inhibiteur de l’angiogenèse, la thrombospondine 1 (TSP1). Ainsi il existe une régulation coordonnée de la croissance des cellules épithéliales prostatiques et de la vascularisation. La croissance du carcinome prostatique est dépendante de l’angiogenèse, et nous avons montré que l’expression de TSP1 dans le stroma de tumeurs prostatiques expérimentales chez la souris retarde le développement tumoral. Cependant les tumeurs ainsi traitées échappent finalement à l’effet anti-angiogénique de la TSP1, en surexprimant le VEGF. Nous avons montré que des ARN interférents (siRNA) dirigés contre l’AR inhibent efficacement la synthèse d’AR in vitro, dans un modèle cellulaire de carcinome prostatique humain androgéno-dépendant (LNCaP). Ces siRNA injectés chez des souris porteuses de tumeurs LNCaP inhibent la croissance tumorale. Cependant une partie des cellules, androgéno-indépendantes et initialement présentes dans la population de LNCaP, échappent à ce traitement et provoquent une reprise tumorale. Nous avons ensuite associé l’expression stromale de TSP1 ayant un effet antiangiogénique, au traitement par interférence ARN anti-AR, et montré qu’ils agissent en synergie sur la croissance de ces tumeurs induites chez la souris. Cette étude montre que l’on peut obtenir des effets antitumoraux synergiques en ciblant deux voies différentes nécessaires à la croissance des tumeurs prostatiques.

n 61

RhoA induces MMP-9 expression at CD44 lamellipodial focal complexes and promotes HMEC-1 cell invasion

Abécassis I1, Olofsson B2, Schmid M3, Zalcman G4, Karniguian A1

1 Inserm U496, Hôpital Saint-Louis, 1 av. C. Vellefaux, 75010 Paris, France ;
2 CNRS UPR 9063, LEBS, av. de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette, France ;
3 Laboratoire d’Imagerie Cellulaire, Hôpital Saint-Louis, 1 av. C. Vellefaux, 75010 Paris, France ;
4 Service de Pneumologie (UFR de Médecine), CHU Côte de Nacre, 14 000 Caen, France.

Much progress has been made in recent years in the understanding of angiogenesis, yet signalling pathways involved remain poorly defined. Here we report that small RhoA GTPase is implicated in the invasion of human microvascular endothelial cells (HMEC-1). Ectopic expression of active-RhoA GTPase induced the expression of MMP-9 metalloproteinase, a key proteinase of the basement membrane, and promoted migration of endothelial cells through a 3D-matrix protein gel (approximately 5-fold increase in the number of invasive cells compared to control cells). MMP-9 was either directed as vesicular-like patches to the apical side of cells, or addressed to specific membrane sites at the cell surface. Confocal microscopy analyses indeed revealed clustering of MMP-9 in advancing lamellipodia at the forefront of endothelial cells, where this proteinase colocalized with RhoA and CD44, a transmembrane receptor known to be proteolysed in tumor cell progression. In addition, TIMP-1, a natural MMP inhibitor, significantly reduced (56 %) the invasion of RhoAV14 expressing cells, suggesting that MMP-9 was a critical metalloproteinase responsible, at least partly, for the RhoAV14-induced endothelial cell invasion. We propose that RhoA triggers signalling pathways that, upregulating expression of a proteinase at specific membrane localizations, may confer an highly invasive phenotype to endothelial cells.
In conclusion, this study provides evidence for a key role of RhoA in endothelial cell differenciation, making this GTPase a potential actor of this fundamental process required for tumor progression that is angiogenesis.

n 62

La surexpression d’IRS-2 est un événement précoce au cours de la carcinogenèse hépatique murine et humaine

Boissan M1, Beurel E1, Wendum D2, Rey C1, Lacombe ML1, Desbois-Mouthon C1

1 Unité Inserm 402 ;
2 Laboratoire d’Anatomie Pathologique, Faculté de Médecine Saint-Antoine, Paris.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer primitif du foie fréquent et agressif survenant dans la majorité des cas sur foie cirrhotique. Actuellement, il n’existe pas de traitement préventif du CHC et les traitements curatifs s’avèrent le plus souvent peu efficaces, les taux de récidive restant très élevés. Les mécanismes moléculaires mis en jeu sont mal compris. Différents travaux ont montré que l’activation de l’axe insuline/IGF pouvait contribuer à la transformation hépatique. Ainsi, des études ont rapporté au cours de l’hépatocarcinogenèse une réexpression d’ARNm fétaux de l’IGF-2, une surexpression d’IRS-1 et une inhibition constitutive de la GSK-3β.
Nous avons étudié l’implication d’IRS-2, substrat majeur de la signalisation insuline, au cours de la transformation hépatique dans deux modèles murins de cancérogenèse hépatique et dans une série de CHC humains. Le premier modèle est un modèle de carcinogenèse chimique induite par injection intra-péritonéale unique de diéthylnitrosamine (DEN) à des souriceaux de 15 jours. Le second modèle est un modèle de cancérogenèse spontanée résultant de l’expression hépato-spécifique de l’antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur de l’antithrombine III. Nous montrons que : 1) IRS-2 est surexprimée dans la plupart des tumeurs hépatiques des deux modèles murins de carcinogenèse ; 2) cette surexpression apparaît dès le stade prénéoplasique et est associée à la réexpression d’IGF-2, à la surexpression d’IRS-1 et à l’inhibition de GSK-3β ; 3) IRS-2 est surexprimée dans des lignées d’hépatomes humains, en particulier la lignée Hep3B, ainsi que dans des CHC humains ; 4) la surexpression d’IRS-2 est fonctionnelle car IRS-2 est phosphorylée sur tyrosine et associée à la PI3K en réponse à l’IGF-2 ; 5) la répression d’IRS-2 par transfection d’un ADNc IRS-2 antisens dans la lignée Hep3B diminue la viabilité des cellules.
En conclusion, nous mettons pour la première fois en évidence une surexpression d’IRS-2 au cours de la carcinogenèse hépatique suggérant un rôle d’IRS-2 dans le développement tumoral. IRS-2 pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante car il intervient en amont de la voie de signalisation et apparaît précocement au cours du développement tumoral.

n 63

L’invalidation de nm23 -M1/NDPK A augmente le potentiel métastatique du carcinome hépatocellulaire dans un modèle de souris transgéniques

Boissan M1, Wendum D2, Arnaud-Dabernat S3, Munier A1, Rey C1, Daniel JY3, Lacombe ML1

1 Unité Inserm 402 et
2 Laboratoire d’Anatomie Pathologique, Faculté de Médecine Saint-Antoine, Paris,
3 Laboratoire de Biologie de la Différenciation et du Dévelopement, EA DRD 483, Université Bordeaux 2, Bordeaux, France.

Les nucléosides diphosphate kinases (NDPK), produits des gènes nm23 et enzymes responsables de la synthèse des nucléosides triphosphates, sont impliquées dans des processus comme la prolifération, la différenciation et la progression tumorale, par des mécanismes mal connus. Nm23-H1 a été identifié comme un gène suppresseur de métastases sur la base de son expression différentielle dans des lignées à fort et faible potentiel métastatique, et à son effet inhibiteur de la dissémination métastatique après transfection dans des lignées tumorales très agressives. Notre objectif est d’étudier le rôle de nm23 dans les étapes précoces et tardives de la cancérogenèse en utilisant des souris transgéniques invalidées pour le gène nm23-M1 codant la NDPK A (KO). Deux modèles de cancérogenèse hépatique ont été analysés. Le premier est un modèle de carcinogenèse chimio-induite par injection intra-péritonéale unique de diéthylnitrosamine (DEN) à des souris de 15 jours. Le second est un modèle de cancérogenèse spontanée résultant de l’expression hépato-spécifique de l’antigène T du virus SV40 sous le contrôle du promoteur de l’antithrombine III (don du Dr P. Briand). Les souris double-transgéniques (souris ASV/KO) ont été obtenues par deux croisements successifs.
Dans les deux modèles, aucune incidence de l’invalidation du gène nm23-M1 n’a été observée sur la formation des tumeurs primaires, ni dans le nombre et la surface des nodules et CHC, ni dans la cinétique d’apparition des tumeurs. Dans le modèle chimio-induit, certaines souris ont présenté quelques nodules pulmonaires dont le nombre et la surface ne différaient pas entre les souris contrôles et KO. L’analyse histologique et immunohistochimique à l’aide de l’anticorps Hep Par 1 spécifique des hépatocytes montre que ces nodules ne sont pas d’origine hépatique et sont très probablement des tumeurs primaires. Dans le modèle spontané, les nodules pulmonaires sont des métastases positives pour Hep Par 1. Leur nombre est très significativement augmenté chez les souris ASV/KO par rapport aux souris ASV contrôles (69 % versus 37 % ; p < 0,01) ; une valeur intermédiaire (58 %) a été observée chez les ASV hétérozygotes. Cependant, parmi les souris présentant des métastases, le nombre et la taille des métastases sont comparables entre les deux groupes de souris. Parmi une série de marqueurs de prolifération et de progression tumorale, une diminution significative du taux de cycline A a été observée dans les tumeurs des souris ASV/KO. Ainsi, nos travaux montrent que nm23 n’a pas d’incidence sur la formation de la tumeur primaire et démontrent pour la première fois le rôle de nm23 comme suppresseur de métastases dans un modèle animal de cancérogenèse spontanée.

n 64

Contrôle de la voie de signalisation JNK par l’histone acétyltransférase chameau/HBO1

Miotto B, Graba Y, Pradel J

Laboratoire de Génétique et Physiologie du Développement, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Campus de Luminy, Case 907, 13288 Marseille Cedex 9.

Les histone-acétyltransférases (HAT) à domaine MYST de drosophile, chameau, et humaine, HBO1, sont des orthologues fonctionnels, interchangeables dans la régulation de processus morphogénétiques chez la drosophile et dans celle de l’activité du récepteur nucléaire de l’androgène dans des cellules cancéreuses de prostate chez l’humain. Nous détaillons ici le rôle de Chameau dans l’activité de la voie de signalisation Jun N-terminal Kinase (JNK) et contrôle l’activité de l’oncogène nucléaire AP1 au cours d’un événement particulier de morphogenèse, la fermeture du thorax (migration et jointure des hémithorax). Au plan génétique, nous montrons que la fonction du gène chameau est : 1) essentielle à la fermeture du thorax en interaction génétique positive avec les gènes codant des intermédiaires de la voie JNK ; 2) requise en aval de la JNK kinase dans le contrôle de mécanismes apoptotiques et au même niveau de hiérarchie que les effecteurs nucléaires Jun et Fos ; 3) nécessaire à la transcription de gènes cibles de AP1. Au plan moléculaire, nous montrons que : 1) Chameau est directement recrutée par Jun et Fos in vitro et dans l’animal entier ; 2) dans les cellules engagées dans la suture des hémithorax, Fos seulement, et non pas le dimère Fos/Jun, est l’effecteur nucléaire de la voie JNK ; 3) l’activité catalytique (HAT) de Chameau est nécessaire pour augmenter la capacité de la forme phosphorylée de Fos à activer la transcription. Cet ensemble de données indique que le facteur de remodelage de la chromatine Chameau est recruté par AP1 comme coactivateur transcriptionnel lorsque la voie JNK est induite. Enfin, des données encore préliminaires ont montré que l’histone déacétylase (HDAC) Rpd3 est également recrutée par Fos in vitro et que in vivo elle contrecarre l’activation de la voie par Chameau. Ceci ouvre l’hypothèse que l’HAT Chameau et la HDAC Rpd3 agissent respectivement comme cofacteurs positif et négatif dans un mécanisme épigénétique qui contrôle la transcription des gènes cibles de la voie JNK.

n 65

Régulation de la stabilité de la protéine kinase oncosuppressive LKB1 : implications thérapeutiques

Gaude H, Nony P, Rossel M, Fournier L, Rouault JP, Billaud M

Laboratoire Génétique et Cancer ; 8, avenue Rockefeller, 69373 Lyon Cedex 08, France. 
E-mail : hgaude@rockefeller.univ-lyon1.fr.

Le syndrome de Peutz-Jeghers (PJS) est une maladie héréditaire caractérisée par la présence chez les patients de multiples polypes gastro-intestinaux et par une prédisposition élevée à développer différents types de cancers. Des mutations germinales du gène suppresseur de tumeur LKB1, qui code une sérine/thréonine kinase, sont responsables de la majorité des cas de PJS. Nous avons montré que les chaperons moléculaires Hsp90 et Cdc37/p50 interagissent avec le domaine kinase de LKB1. Le traitement des cellules avec la geldanamycine ou la novobiocine, deux inhibiteurs pharmacologiques de Hsp90, induit la déstabilisation de LKB1. De plus, le traitement par la geldanamycine entraîne l’ubiquitinylation et la dégradation rapide de LKB1 par la voie dépendante du protéasome. Nous avons également montré qu’une mutation ponctuelle de LKB1, identifiée dans un cancer testiculaire sporadique, diminue l’interaction de LKB1 avec Hsp90 et avec Cdc37/p50 et augmente sa sensibilité à l’effet déstabilisant de la geldanamycine. D’autre part, nous avons récemment montré que LKB1 interagit physiquement avec la protéine CHIP, protéine E3 ligase connue pour interagir avec HSP90 et HSP70. L’activité de CHIP serait requise pour permettre la dégradation de LKB1 par le protéasome. Nous sommes actuellement en train de poursuivre cette étude afin de mieux caractériser les mécanismes moléculaires mis en jeu. En conclusion, nos résultats montrent que le complexe Hsp90/Cdc37 est un régulateur majeur de la stabilité du suppresseur de tumeur LKB1. De plus, la dégradation de LKB1 par la voie ubiquitine-protéasome ferait intervenir la protéine E3 ligase CHIP. Enfin, ces données attirent l’attention sur les conséquences potentiellement néfastes des drogues anti-tumorales ciblant Hsp90, comme les antibiotiques analogues à la geldanamycine testés aujourd’hui en chimiothérapie (phase I d’essai clinique). En effet, ces drogues pourraient perturber la fonction antiproliférative de LKB1 et promouvoir le développement de polypes et de lésions carcinomateuses.

n 66

The LKB1 tumor suppressor : functional analysis and implication in regulation of epithelial cell polarity

Forcet C1, Gaude H1, Rouault JP2, Etienne-Manneville S3, Billaud M1

1 FRE2692 CNRS, Domaine de Rockefeller, 69373 Lyon Cedex 08 ;
2 U418 Inserm, INRA UA853, Hôpital Debrousse, 69322 Lyon Cedex 05 ;
3 UMR144 CNRS, Institut Curie, 75248 Paris Cedex 05.

Peutz-Jeghers syndrome (PJS) is a dominantly-inherited syndrome characterized by the presence of multiple gastrointestinal polyps and an increased risk of cancer. Inactivating germline mutations of the LKB1 gene, which encodes a serine/threonine kinase, are responsible for the majority of PJS cases. The Caenorahbditis elegans homologue of LKB1, named PAR-4, is required for establishing cell polarity during C. elegans embryogenesis. Similarly, the Drosophila homologue of human LKB1 is involved in the determination of anterior-posterior embryonic axis and polarization of epithelial follicular cells. These finding suggest that human LKB1 might exert its tumor suppressor function through the control of cell polarity.
Several missense mutations identified in PJS patients and in sporadic tumors are located outside the kinase domain and affect the C-terminus part of LKB1. We studied the functional consequences of four of these mutations and we now report that these mutations neither impair LKB1 catalytic activity nor affect its ability to induce cell cycle arrest. We reasoned that these mutations could disrupt the fixation of LKB1 interacting proteins potentially involved in the regulation of polarity, such as the STE-20 pseudokinase STRADα, the activator of G-protein signalling 3 (AGS-3) and the protein kinase GSK3β. Evidence will be presented at the meeting that these mutations interfere with the binding of these LKB1 signalling partners, thus impeding LKB1 ability to control polarity of epithelial cells. Our results indicate that LKB1 coordinates the activities of several proteins involved in the control of mammalian cell polarity and that loss of this scaffolding function contributes to the formation of polyps and epithelial tumors.

n 67

Identification et caractérisation des protéines MEX-3 humaines : une nouvelle famille de protéines régulant la prolifération cellulaire et potentiellement impliquées dans le contrôle de la polarité

Buchet-Poyau K1, Courchet J1, Duret L2, Billaud M1

1 Laboratoire Génétique et Cancer (FRE 2692 CNRS), Faculté de Médecine, 8 avenue Rockefeller, 69373 Lyon Cedex 08 ;
2 UMR 5558 CNRS, Université Lyon I, 16 rue Dubois, 69622 Villeurbanne Cedex.

Lors des phases précoces de la formation des carcinomes, on observe généralement une perte de polarité des cellules épithéliales et cette étape est considérée comme déterminante lors de l’acquisition du phénotype tumoral. Afin de préciser le rôle de cette perte de polarité, notre équipe étudie le gène suppresseur de tumeur LKB1, dont les mutations sont responsables du syndrome de Peutz-Jeghers, prédisposant les patients au développement de cancers. La protéine LKB1 exerce un rôle dans l’établissement et le maintien de la polarité cellulaire. Chez le nématode C. elegans, le gène MEX-3 intervient dans une voie de signalisation reliant par4, l’homologue de LKB1, et la régulation de la polarité. Nous avons identifié chez l’homme une nouvelle famille de 4 gènes homologues au gène MEX-3 de C. elegans et nous avons cloné les ADNc correspondants. Ils codent pour des protéines présentant 2 domaines KH de liaison à l’ARN et un domaine RING permettant des interactions protéine-protéine et possédant une activité ubiquitine-ligase. Les protéines MEX-3 sont exprimées dans le cytoplasme des cellules sous une forme au moins partiellement phosphorylée. Leur niveau d’expression est relativement faible et leur profil d’expression est variable d’une forme à l’autre. Nous avons observé que ces protéines ont un effet antiprolifératif lorsqu’elles sont exprimées dans diverses lignées cellulaires, activité qui dépend d’un domaine KH fonctionnel. De plus, nous avons observé par surexpression et par interférence à l’ARN (RNAi) qu’au moins une de ces protéines régulerait l’expression de cdx2, facteur homéotique intervenant dans la morphogenèse intestinale et la prolifération cellulaire. Les protéines MEX-3 humaines pourraient ainsi présenter une activité oncosuppressive. Ce résultat est conforté par la localisation chromosomique des 4 gènes, dans des régions fréquemment associées à une perte d’hétérozygotie dans les tumeurs. Nous nous proposons de préciser par surexpression et RNAi les effets de ces protéines sur la prolifération cellulaire, l’apoptose et la régulation du cycle cellulaire ainsi que sur la polarité cellulaire grâce à des modèles de cellules polarisées qui sont actuellement mis au point au laboratoire. De plus, l’interaction potentielle de ces protéines avec LKB1 est en cours d’étude. Enfin, nous chercherons si les 4 gènes présentent des mutations dans un certain nombre de tumeurs.

n 68

Les variations d’expression des cadhérines/caténines sont liées à la prolifération et à la transformation des rhabdomyosarcomes

Charrasse S1, Comunale F1, Gilbert E2, Delattre O2, Gauthier-Rouvière C1

1 Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire, CNRS FRE2593, 34293 Montpellier Cedex France. Equipe labellisée de la Ligue Nationale contre le Cancer, Coordinateur P. Fort ;
2 Laboratoire de Pathologie Moléculaire des Cancers, Inserm U 509, Institut Curie, 75248 Paris.

Les cadhérines appartiennent à une famille de glycoprotéines transmembranaires qui médient l’adhérence inter-cellulaire de façon dépendante du calcium et jouent un rôle crucial dans la différenciation cellulaire. L’adhérence cellule-cellule médiée par la E-cadhérine est perdue pendant le développement de la plupart des cancers épithéliaux. Cette étude examine l’adhérence inter-cellulaire dépendante des cadhérines dans des lignées cellulaires dérivées de rhabdomyosarcomes (RMS), une tumeur fortement maligne originaire de la lignée myogénique, mais qui ne subit pas de différenciation terminale. Nous avons analysé l’expression des cadhérines et leurs caténines associées au niveau ARNm et protéine, ainsi que leur localisation dans neuf lignées dérivées de rhabdomyosarcomes. Nous avons montré une diminution de l’expression des cadhérines et caténines dans ces neuf lignées par rapport à des myoblastes normaux. Cette diminution d’expression de la N- et M- cadhérine a été confirmée avec des biopsies de RMS. Au contraire, la R-cadhérine est exprimée dans les RMS, tandis qu’elle est normalement absente des myoblastes normaux. Nous avons montré qu’une diminution d’expression de la R-cadhérine par RNA interference (RNAi) inhibe la prolifération cellulaire. En plus de leur diminution d’expression, les cadhérines/caténines ne sont pas localisées aux zones de contact cellule-cellule dans les RMS embryonnaires (RMSe), tandis qu’une localisation membranaire spécifique persiste dans les RMS alvéolaires (RMSa). Donc les RMS présentent des défauts d’expression des molécules de la famille des cadhérines. Les défauts de localisation aux sites de contact cellule-cellule sont spécifiquement observés dans les sous-types RMSe. De plus, nos données suggèrent que la R-cadhérine pourrait être un marqueur spécifique utilisable pour le diagnostic des RMS mais aussi un facteur important pour la prolifération cellulaire des RMS.
D’autre part nous avons montré que les récepteurs adhésifs de la famille des cadhérines sont des régulateurs des GTPases de la famille Rho, molécules de signalisation intercellulaire impliquées aussi dans la prolifération et la différenciation des cellules musculaires. Des perturbations de l’activité de ces molécules ont aussi été observées dans les RMS et les relations cadhérines/GTPases Rho sont actuellement en cours d’étude.

Études et observations cliniques

n 69

Le patient et la recherche clinique : impact d’un livret informatif

Cougnenc O1, Coin B1, Elmerich D1, Clisant S1

1 Unité de Recherche Clinique, Centre Oscar Lambret, 3 rue Frédéric Combemale 59020 Lille.

Le Centre Oscar Lambret à Lille, Centre de Lutte Contre le Cancer de la région Nord de la France, a développé depuis 1995, avec la création d’une unité entièrement dévolue à cela, une importante activité de recherche clinique. En 2003, 60 études cliniques sont ouvertes et 209 nouveaux patients inclus, s’ajoutant aux 816 patients suivis dans le cadre d’essais antérieurs. La rigueur des protocoles ne doit pas faire oublier la qualité de prise en charge et notamment d’information des patients concernés. Les tenants et les aboutissants de la recherche clinique sont exposés par la communication des médecins et de toute l’équipe soignante, ainsi que par le biais d’un livret informatif réalisé en 1996, à la disposition des patients. Ce type de manuel est très peu répandu dans les autres centres anticancéreux, nous avons donc cherché à connaître l’impact de celui-ci auprès de nos patients.
Notre étude consiste à évaluer la connaissance des patients en matière de recherche clinique. Pour ce faire, un auto-questionnaire composé de 23 items leur a été distribué. Notre population se compose de 50 patients bénéficiant d’un traitement à l’hôpital de jour, le sex ratio étant de 72 % de femmes (n = 36) et 28 % d’hommes (n = 14). L’âge moyen est de 52 ans. Parmi eux, 11 ont déjà participé ou participent actuellement à une étude. La majorité de notre effectif (64 %) déclare ne pas être informée sur la recherche clinique avant sa venue au Centre. Le livret explicatif se révèle de conception logique (98 %), plutôt attractif (86 %), contenant des informations intéressantes (94 %). De même, les principes, les objectifs et les intérêts des essais cliniques ainsi que la partie relative au consentement semblent bien assimilés (> 90 %). L’information vis-à-vis de l’aspect législatif, des effets secondaires potentiels et de la randomisation satisfait respectivement 70 %, 72 % et 78 % de notre échantillon. Une explication plus détaillée des différentes phases d’une étude clinique a été plébiscitée à 54 % et la proposition d’insérer quelques adresses de sites Internet concernant leur maladie a été accueillie favorablement dans 68 % des cas. Des modifications en ce sens sont donc en cours.
Ce livret n’a pas vocation à convaincre les patients d’intégrer un programme de recherche clinique (60 % ne sont pas influencés), le dialogue avec le médecin reste décisif, mais sa bonne construction globale tant sur la forme que sur le fond permet aux malades de mieux appréhender le processus de la recherche clinique et ainsi de diminuer leurs craintes. Il apparaît donc important que sa diffusion soit systématique, pour tous les patients à qui l’on propose une étude au Centre Oscar Lambret, et peut-être dans les autres Centres de Lutte contre le Cancer...

n 70

L’hépatocarcinome en France : épidémiologie, étiologie, traitement et survie

Borie F, Trétarre B, Daurès JP, le réseau français des registres des tumeurs (Francim)

Bât Recherche, rue des Apothicaires, BP 4111, 34091 Montpellier Cedex 5.

L’incidence de l’hépatocarcinome est en augmentation en France. Pour rendre compte de la pratique et de l’efficacité du système de santé, une évaluation de la prise en charge et de la survie de l’hépatocarcinome (HC) a été réalisée.

Patients et méthodes. Durant les années 1997 et 1998, 1 100 cas de cancers primitifs du foie ont été recensés dans 9 départements français ; 1 107 était des HC (sex ratio 5,2, âge moyen 67,5 ans). Le recueil des caractéristiques clinico-pathologiques et des modalités et structures de soins a permis une analyse des pratiques et de la survie à 5 ans.

Résultat. Les taux d’incidence étaient de 13,5/100 000 pour les hommes et de 2,5/100 000 pour les femmes. Sept cent quatre vingt quinze patients (79 %) avaient une cirrhose d’origine alcoolique (61 %), alcoolo-virale (4 %), virale (21 %, B 5 %, C 15 %), hémochromatosique (3 %) et autres (1 %). Les origines alcoolique et virale de la cirrhose variaient respectivement de 43 % et 12 % à 74 % et 44 % d’un département à l’autre. Le diagnostic a été fait par l’examen histologique dans 55 % des cas, FP > 200 ng/ml dans 20,5 % des cas et l’imagerie médicale dans 24,5 % des cas. Cent soixante quatorze patients (17 %) ont eu un traitement à visée curative : 107 résections, 24 transplantations et 43 alcoolisations. En analyse multivariée, le traitement à visée curative était dépendant de l’âge, du stade d’Okuda (et de Child-Pugh pour les HC sur cirrhose) et de la structure de prise. Parmi les 833 patients ayant eu un traitement palliatif, 22 avaient une chimiothérapie, 103 une chimio-embolisation, 14 une injection de lipiodol radioactif, 209 une hormonothérapie, 331 (52 %) un traitement symptomatique. Les taux de survie à 5 ans des patients ayant eu un traitement à visée curative et à visée palliative étaient respectivement de 33 % et 2 %. Le mode de découverte, le taux d’αFP, la taille et le nombre de tumeurs, l’existence de métastases au moment du diagnostic, le stade d’Okuda et la structure de prise en charge étaient des facteurs pronostiques indépendants.

Conclusion. Outre le mauvais pronostic, cette étude a révélé l’existence d’une hétérogénéité certaine dans la répartition, dans le traitement et dans la survie de l’HC en France. Une politique de prévention et un meilleur suivi des patients ayant une hépatopathie et une standardisation des soins pourraient améliorer le pronostic des patients ayant un HC.

n 71

Les cancers de l’intervalle dans le programme de dépistage organisé du cancer du sein dans le Bas-Rhin

Guldenfels C1, Gairard B1, Haehnel P1

1 Ademas-Alsace, 69 route du Rhin, BP 90314, 67411 Illkirch Cedex.

L’évaluation des cancer de l’intervalle est l’un des meilleurs indicateurs précoces d’efficacité du dépistage du cancer du sein.
Le programme de dépistage Ademas a démarré en 1989 dans le Bas-Rhin. Les cancers de l’intervalle se définissent comme des cancers survenant dans l’intervalle de deux ans après un dépistage négatif, c’est-à-dire avant le dépistage suivant. Ils se décomposent en cancers déjà présents au moment de l’examen de dépistage mais manqués pour diverses raisons (faux négatif), aussi bien qu’en cancers nouvellement apparus (vrais cancers de l’intervalle).
Après un recensement exhaustif des cas grâce à la collaboration avec le registre des cancers bas-rhinois, les radiographies de l’examen précédant le diagnostic de cancer d’intervalle ont été revues pour classer les cas en vrai cancer de l’intervalle, signes non spécifiques ou faux négatif. La méthode de relecture a consisté à intercaler les radiographies des cas de cancer de l’intervalle au sein d’une série de clichés positifs ou négatifs de la même période. Ainsi, les radiologues ont été mis dans les conditions usuelles d’interprétation en deuxième lecture.
Les différents types d’images radiologiques ont été étudiés dans chaque catégorie, surtout en comparant les faux négatifs et les signes non spécifiques. Ainsi, 391 cas, sur les 500 cancers de l’intervalle recensés de mai 1989 à décembre 2000, ont pu être revus. Les images radiologiques les plus souvent manquées sont les opacités ou les images stellaires plutôt que les rétractions, les microcalcifications ou certains signes subtils uniquement observés par comparaison avec les clichés antérieurs.
L’identification des images le plus souvent en relation avec un cancer de l’intervalle est primordiale pour la formation des radiologues et l’amélioration du programme de dépistage. Du fait de la généralisation du dépistage du cancer du sein à l’ensemble du territoire français, il devient important de définir les critères de relecture des clichés mammographiques, dans le cadre de rapport d’expertise en particulier. C’est la seule façon d’évaluer ces images pour chaque cas de cancer d’intervalle ; ainsi le résultat de cette expertise pourra être d’une grande aide dans les cas de problèmes médico-légaux.

n 72

Chimiothérapie néoadjuvante de type FEC100 du cancer du sein opérable : 8 ans d’expérience au centre Jean Perrin

Abrial C1, 2, Mouret-Reynier MA1, Amat S1, Curé H1, Kwiatkowski F1, Chollet P1

1 Centre Jean Perrin, 58, rue Montalembert, 63011 Clermont-Ferrand ;
2 Inserm U484, 58, rue Montalembert, 63011 Clermont-Ferrand.

But. Cette étude rétrospective évalue l’efficacité et la toxicité d’une chimiothérapie néoadjuvante de type FEC100 (fluoro-uracile 500 mg/m2, épirubicine 100 mg/m2, cyclophosphamide 500 mg/m2), chez 50 patientes présentant une tumeur du sein opérable non métastatique de stade I à III, traitées au centre Jean Perrin entre janvier 1995 et janvier 2003.
Patientes et méthodes. L’âge médian de ces patientes était de 50 ans [38-67]. La taille médiane de la tumeur initiale était de 40 mm [15-70]. 24 (48 %) patientes présentaient un envahissement ganglionnaire clinique. Le diagnostic histologique montrait 42 carcinomes canalaires invasifs (84 %), 7 carcinomes lobulaires invasifs (14 %) et 1 carcinome invasif mixte (2 %). La chimiothérapie néoadjuvante consistait en 6 cures (nombre médian 6 [3-6]) de FEC100 administrées tous les 21 jours, suivies d’un traitement locorégional (chirurgie et radiothérapie) puis éventuellement d’une chimiothérapie (32 %) et/ou hormonothérapie par tamoxifène (75 %) adjuvantes en fonction du résidu et des récepteurs hormonaux. Une évaluation clinique, mammographique et échographique de la tumeur a été réalisée avant le début de la chimiothérapie, toutes les 2 ou 3 cures et en fin de traitement. Parmi les 13 patientes n’ayant pas reçu 6 cures de FEC100, 6 ont reçu une autre chimiothérapie néoadjuvante (taxotère, FAC50 et une chimiothérapie intensive/autogreffe).
Résultats. La réponse objective clinique était de 60 % [IC 95 % : 46-74] dont 26 % de réponse complète (RC), la réponse mammographique de 44 % [IC 95 % : 30-58] dont 24 % de RC et la réponse échographique de 50 % (IC à 95 % : 36-64) dont 14 % de RC. Parmi les 44 patientes opérées et évaluables pour la réponse histologique au FEC100, le traitement conservateur a été possible chez 28 (63 %) patientes (27 avec curage axillaire et 1 sans curage). 22 (51 %) patientes présentaient un envahissement ganglionnaire à la chirurgie (nombre médian 1 [1-16]). La réponse histologique complète était de 18 % [IC 95 % : 7-30] selon la classification de Chevallier et de 25 % [IC 95 % : 12-38] selon la classification de Sataloff.
Conclusion. La chimiothérapie néoadjuvante de type FEC100 a permis d’obtenir des taux de réponse clinique et histologique relativement élevés avec un profil de tolérance acceptable, la principale toxicité étant une neutropénie de grades 3-4 chez 22 (44 %) patientes. Après un recul médian de 41 mois [16-119], on dénombre 8 (16 %) récidives à distance et 3 (6 %) décès.

n 73

La concentration sérique en protéine HER2 circulante (sHER2) est corrélée au statut HER2 déterminé par immunohistochimie (IHC) ou par hybridation de fluorescence in situ (FISH) et à la réponse au traitement combinant Herceptin® et Taxol® (étude HER.ME.S).

Tse C1, Brault D1, Gligorov J1, Antoine M1, Jollivet G1, Arien S1, Brindel I2, Capeau J1, Lotz JP1 et tous les co-investigateurs du programme HER.ME.S3

1 Cancer Est, Hôpital Tenon, Paris ;
2 DRRC, AP-HP, Paris ;
3 Centre R. Gauducheau, Nantes, Centre E. Marquis, Rennes, Centre P. Papin, Angers, Hôpital St-Antoine, Hôpital St-Louis.

Le récepteur transmembranaire HER2 est une cible thérapeutique importante utilisée dans le traitement du cancer du sein métastatique. Son domaine extracellulaire peut être clivé sous l’action de métalloprotéases et libéré dans le flux sanguin. Notre étude a pour objectif d’évaluer l’intérêt clinique du dosage sérique du fragment HER2 circulant (sHER2) dans le cadre d’une étude multicentrique de phase IV (étude HER.ME.S) combinant Herceptin® et Taxol®
Matériel et méthodes. La population étudiée est constituée de 44 patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique pour lesquelles le statut HER2 a été évalué par IHC (Herceptest, Dako) et par FISH (Inform HER test, Ventana). La protéine HER2 circulante est dosée avant traitement (temps J0 : prise en charge du statut métastatique et décision de traitement par l’Herceptin®) et après un mois de traitement (temps J30). Le dosage de sHER2 est réalisé par une technique immunoenzymatique standardisée de type Elisa (Oncogene Science-Bayer Diagnostics). La réponse au traitement (RP si partielle, RC si complète, S si stable et P si progression) est appréciée selon les critères Recist (Response Evaluation Criteria in Solid Tumor Group).
Résultats
. 1) Ayant établi une valeur de 15 ng/ml comme limite supérieure normale, la concentration sérique en sHER2 avant traitement est élevée dans 70 % (31/44) des cas étudiés. La corrélation entre valeur de base de sHER2 et statut HER2 par IHC ou FISH est donnée dans le tableau ci-dessous.

Statut HER2 [sHER2 (J0)] > 15 ng/ml Test exact de Fisher
IHC score 2+, 3+ 88 % (29/33) p < 0,0001
FISH positive 91 % (20/22) p < 0,0001

2) Le taux de décroissance de sHER2 après 4 semaines de traitement (Td = 100 (1- [sHER2(J0)]/[sHER2(J30)] a été calculé pour les 33 patientes traitées par Herceptin®. Le tracé d’une courbe ROC, Td versus réponse thérapeutique dichotomisée en RC + RP + S et P établit un Td seuil optimal de 41 %. Lorsque < 41 %, ce seuil permet de détecter une progression de la maladie avec une sensibilité de 73 % (IC 95 % : 49,8-89,2 %) et une spécificité de 100 %.
Conclusion. Ces résultats préliminaires soulignent l’intérêt du dosage sérique de la protéine HER2 circulante : 1) comme marqueur du statut HER2, étant donné la bonne corrélation avec les techniques IHC et FISH, le dosage sérique peut être proposé comme méthode alternative de l’IHC ou de la FISH, notamment lorsque la tumeur primaire n’est plus accessible ; 2) comme facteur prédictif d’une évolution vers la progression, devant un taux de décroissance < 41 % après un mois de traitement Herceptin® + Taxol, le clinicien pourra modifier la chimiothérapie associée avant que sa patiente n’évolue vers la progression mise en évidence par les examens radiologiques.

n 74

Gemcitabine (G) et doxorubicine (D) en première ligne dans le cancer du sein métastatique (MBC) : essai de phase II, résultats préliminaires

Bensalem A1, Bouzid K2

1 Oncologie Médicale, Constantine ;
2
 Oncologie Médicale, Centre P et M Curie, Alger, Algérie.

Le cancer du sein est la première pathologie cancéreuse chez la femme algérienne. Diagnostiqué à un stade tardif, le MBC représente 18 à 20 % des cancers du sein.

Matériel et méthodes. C’est un essai de phase II concernant le MBC et l’utilisation du protocole G-D en première ligne métastatique chez les patientes âgées de (-) de 78 ans, avec un consentement éclairé. Sur une période allant de novembre 2001 à janvier 2004, 30 patientes de stade IV ont été recrutées, d’âge moyen de 46,9 ans ayant consulté dans un délai moyen de 23,7 mois. Une localisation métastatique a été retrouvée dans 60 % (18 patientes), une double localisation chez 10 patientes (33,3 %), plus de deux localisations chez 2 patientes (6,7 %). Les métastases osseuses ont concerné 26 patientes (86,7 %), hépatiques 9 (30 %), pulmonaires 6 (20 %) et ganglionnaires (sus-claviculaire) 3 (10 %). Le protocole a consisté en l’association de G 1250 mg/m2 à J1 et J8 et D 25 mg/m2 à J1 et J8 avec J1 = J22. On s’est proposé de faire quatre cures de chimiothérapie (CT). La toxicité hématologique a été une leucopénie de grade II de 1,4 % et grade III de 0,5 %, une anémie de grade II de 0,9 % et une thrombopénie de grade I de 1,8 %. La toxicité digestive a été de type nausées et vomissements de grades I à II dans 5,9 %.

Résultats. Après deux cures de CT, la réponse clinique locale sur le sein est de 60 % (18 patientes), les douleurs osseuses, hépatiques ou thoraciques ont disparu chez 21 patientes (70 %). Après 4 cures de CT, 19 patientes sont évaluables (les autres sont encore en cours de CT), la réponse clinique locale est de 68,4 %, la réponse sur la symptomatologie est de 84,2 % et la réponse radiologique complète est de 42,1 %. 14 patientes ont été opérées avec 6 réponses histologiques complètes (42,8 %).

Conclusion. Le protocole G-D est un bon et effectif protocole dans le MBC en première ligne. La toxicité des drogues est gérable et acceptable. L’activité combinée des deux drogues est bonne et demande un suivi plus long pour déterminer des résultats de survie à long terme.

n 75

Identification des patients à risque de progression tumorale élevé après néphrectomie pour carcinome à cellules rénales de type conventionnel (RCC)

Rioux-Leclercq N1, Banssard JY2, Patard JJ3, Bellaud F1, Jouan P1, Moulinoux JP2

1 Département d’Anatomie Pathologique ;
2 Groupe de Recherche en Thérapeutique Anti-Cancéreuse ;
3 Service d’Urologie, Faculté de Médecine, 35033 Rennes Cedex.

But du travail. Déterminer un groupe de patients dont le risque de progression tumorale est élevé après néphrectomie pour RCC.
Méthodes. 73 patients ont été inclus dans cette étude rétrospective. Aucun patient n’avait bénéficié d’un traitement préopératoire. L’étude en immunohistochimie de l’expression des anticorps anti-(vimentine, Ki67, p53, Bcl2, Fas, Fas-ligand, CD44H, VEGF) et l’étude de l’apoptose par la technique Tunel ont été réalisées sur coupes en paraffine. L’expression des différents anticorps, le stade tumoral TNM, le grade de Fuhrman et la taille tumorale ont été corrélés à la survie. L’analyse factorielle des correspondances (AFC) et la classification ascendante hiérarchique (CAH) ont été utilisées afin de déterminer les facteurs pronostiques statistiquement significatifs. L’analyse de survie a fait appel à la méthode de Kaplan-Meier et le test de Cox a défini les facteurs pronostiques indépendants pour la survie.
Résultats. En analyse multivariée, Ki67 = 20 %, CD44H = 20 % et VEGF = 30 % étaient des facteurs pronostiques indépendants pour la survie chez les patients avec métastases (p < 0,04, p < 0,02, p < 0,00001 respectivement) et chez les patients sans métastase (p < 0,006, p < 0,00001, p < 0,00001 respectivement). L’AFC et la CAH incluant 6 facteurs pronostiques (le stade TNM, le grade de Fuhrman, la taille tumorale, l’expression de Ki67, CD44H et VEGF) ont défini deux groupes de patients. Le groupe 1 était caractérisé par la présence de moins de 4 facteurs, le groupe 2 étant défini par la présence de 4 ou plus de 4 facteurs pronostiques. La médiane de survie pour le groupe 1 était de 73 ± 2 mois, celle du groupe 2 étant significativement plus faible de 37 ± 7 mois (p < 0,00001) avec dans le groupe 2, 50 % des décès survenant dans les 24 mois après la néphrectomie.
Conclusion
. Nous avons montré que l’utilisation d’un panel d’anticorps associés aux facteurs pronostiques classiquement utilisés permettait dans les RCC de définir les patients qui avaient un risque de progression tumorale dans les 2 ans qui suivaient la néphrectomie.

n 76

Risque infectieux et nutrition parentérale : enregistrement prospectif des septicémies chez des patients cancéreux recevant une chimiothérapie

Labourey JL1, Chevalier E1, Martin J1, Desport JC2, Garnier F3, Lavau-Denes S, Fraysse JL4, Lagarde A5, Tubiana-Mathieu N1

1 Service d’oncologie médicale,
2 Unité de nutrition et EA 3174,
3 Service de bactériologie,
4 Société Alair-AVD,
5
Pharmacie Centrale, CHU Dupuytren, 87042 Limoges Cedex.

La dénutrition est un problème majeur en cancérologie, avec un impact sur la réponse thérapeutique et la qualité de vie. Grâce aux chambres à cathéter implantable (CCI) et à la simplicité de la mise en place d’une nutrition parentérale (poche tri compartimentée, stockage à température ambiante,…), nous assistons à un accroissement des prescriptions, en particulier à domicile.
But. Incidence des septicémies chez des patients bénéficiant de façon concomitante, d’une chimiothérapie intraveineuse (CTIV) et d’une nutrition parentérale (NP).
Matériels et méthodes. Enregistrement sur l’année 2003 dans une unité d’oncologie, des hémocultures positives (hémoc+) effectuées devant tout épisode fébrile, sur voie veineuse périphérique et sur CCI (en cas de retour veineux).
Résultats
. 94 patients (33 femmes et 61 hommes) sous CTIV bénéficient d’une NP. L’âge médian est de 63 ans (30-80). Les trois principales indications de NP concernent les cancers ORL (28,7 %), coliques (19,1 %) et œsophagiens (12,8 %). La durée médiane de NP est de 30 jours (2-239). Parmi les patients sous NP, 33 ont des hémoc+ (soit 36,7 %), avec une prédominance de staphylocoque à coagulase négative (18 ou 54,5 %). Sur les 400 patients sous CTIV qui ne reçoivent pas de NP, 18 septicémies sont constatées (soit 4,5 %). Le risque d’hémoc+ est donc 11,48 fois plus élevé en cas de NP (intervalle de confiance 6-21). Le risque de septicémie s’avère aussi majoré par la durée de la NP (p = 0,04), sans relation avec le taux de polynucléaires.
Conclusion. L’association CTIV et NP augmente fortement le risque de septicémie et doit être prise en compte lors de la décision de mise en place d’une NP.

n 77

Hyperplasie canalaire atypique (HCA) sur macrobiopsies : un défi pour le pathologiste

Baranzelli MC1, Cabaret V1, Chauvet MP2, Uzan R3, Ceugnart L3, Giard S2, Bonneterre J2

1 Laboratoire d’Anatomie Pathologique,
2 Département de Sénologie,
3 Département d’Imagerie, Centre Oscar Lambret, 3 rue Frédéric Combemale, BP307, 59020 Lille Cedex.

La différence diagnostique entre les hyperplasies canalaires atypiques (HCA) et les carcinomes intracalaires (CIC) est difficile et d’une reproductibilité variable entre pathologistes. Avec la pratique des macrobiopsies mammaires pour microcalcifications, les pathologistes sont de plus en plus fréquemment confrontés à ces lésions dont l’évolution est encore mal connue et pour lesquelles l’attitude thérapeutique est imprécise.
Matériel, méthodes et résultats. Entre février 2000 et octobre 2003, sur 1295 macrobiopsies (diamètre 11 gauge), 178 HCA (13,7 %) ont été diagnostiquées, utilisant les critères diagnostiques de Page et de Tavassoli ; 84 des 178 (47,3 %) patientes ont bénéficié secondairement d’une exérèse chirurgicale. La cicatrice de macrobiopsie antérieure a été retrouvée sur toutes les pièces d’exérèse. Pour 19 patientes (22,6 %), les lésions retrouvées étaient plus péjoratives : 8 CIC de grade 1, 7 CIC de grade 2, 3 CIC de grade 3 et 1 carcinome infiltrant associé à un CIC de grade 1. Pour 18 de ces cas discordants, les lames de macrobiopsies ont été revues par deux pathologistes, en aveugle ; dans 6 cas le diagnostic final retenu restait HCA alors que dans 12 cas il était CIC de grade 1 (5) ou 2 (7), avec une bonne reproductibilité entre pathologistes (94,4 %). Le nombre de fragments biopsiques atteints était plus grand chez les patientes avec CIC (méd = 4) que chez les patientes avec HCA (méd = 2) (p < 0,01) alors que le nombre de biopsies réalisées était identique dans les deux groupes (11 et 10). Le diagnostic différentiel entre HCA et CIC de grade 1 est surtout quantitatif ; ceci explique certaines sous-estimations sur des prélèvements de petite taille. Pour le CIC de grade 2 ou 3, le diagnostic différentiel repose sur la cytologie d’autant que la nécrose comédonienne peut être absente. Il est aussi établi que HCA peut être voisine de lésions plus importantes (CIC ou carcinome invasif) non prélevées par la biopsie.
Conclusion. L’utilisation de critères diagnostiques reproductibles et d’une classification commune réduit le taux de sous-estimations du diagnostic histopathologique dans les macrobiopsies mammaires ; néanmoins le problème de la représentativité de l’échantillonnage reste entier.

n 78

Analyse des complications des voies veineuses centrales en oncologie médicale : étude prospective à propos de 644 cas

Boussen H, Mtaallah MH, Amri H, Bouzid T, Khmosi F, Makhlouf MR, Khallfallah S, Hechiche M, Rahal K

Institut Salah Azaiz, Tunis, Tunisie.

Objectifs. Evaluer et analyser les complications liées à la pose et à l’utilisation des voies veineuses centrales (VVC) en oncologie médicale à l’institut Salah Azaïz, Tunis.

Patients et méthodes. De juin 1992 à juillet 2003, nous avons mis en place 644 VVC (chez 552 adultes et 92 enfants). Les VVC ont été posées sous anesthésie locale chez les adultes et sous anesthésie générale chez 80 % des enfants. La veine sous-clavière a été abordée chez 75 % des malades, la veine jugulaire chez 24,3 % et la veine fémorale dans 0,7 % des cas.

Résultats. Les complications précoces ont consisté en 3 échecs de poses chez deux adultes (0,3 %) et un enfant (1,1 %), 6 pneumothorax (0,9 %) et 15 conversions après échec de la première tentative (2,3 %). Les complications tardives étaient dominées par l’infection (2,8 %), la thrombose (1,7 %) et plus rarement la migration du cathéter (0,4 %). Nous avons rencontré les problèmes suivants lors de la pose et du maniement : distorsion du guide métallique (10 %), déformation du bout distal du dilatateur veineux (5 %), coudure du cathéter au niveau de la jonction avec le site ou l’entrée dans le cou (5 % des cas) et lâchage de la bague de fixation (4 cas).

Discussion. Les complications inhérentes aux VVC peuvent être mieux contrôlées par une acquisition de l’expérience de pose, un maniement avec asepsie rigoureuse et un respect des règles d’hygiène par le personnel soignant et la famille. Les sites implantables, bien que plus coûteux, exposent à moins de risques infectieux et permettent un meilleur confort de traitement. Une approche de matério-vigilance peut permettre de diminuer les problèmes lors de la pose et du maniement des sites implantables.

Conclusion. L’acquisition d’une expérience de plus de 10 ans dans la pose et le maniement des VVC nous permet actuellement un meilleur contrôle des complications précoces et tardives.

n 79

Approche épidémiologique et anatomo-pathologique des tumeurs de l’ovaire : à propos de 547 cas

Beddar L1, Boudjedaa B1, Benahsene K1, Mokrani N1, Tebbi Z1

Laboratoire d’Anatomie Pathologique du CHU Benbadis, Constantine, 25000 Algérie.

Les tumeurs de l’ovaire sont très polymorphes ayant chacune leurs propres caractéristiques et leur histoire naturelle, ce qui permet de distinguer les différents types histologiques. Cependant il faut souligner la difficulté de les classer en tumeurs bénignes, malignes ou borderline. Nous avons réalisé une étude rétrospective sur 547 patientes colligées sur une période de 8 ans, de 1995 à 2002. Les différentes pièces opératoires ont toutes bénéficié d’un examen macroscopique, de coupes sériées colorées à l’hémalun-éosine et parfois des colorations spéciales à la demande.

Nos résultats sont les suivants : les tumeurs bénignes représentent 76,4 %, soit 418 cas, elles touchent la femme entre 20 et 30 ans ; les tumeurs malignes de notre série sont de 109 cas, soit 19,9 % ; Elles concernent la tranche d’âge 40-50 ans. Parmi ces tumeurs, 150 tératomes dont 2 immatures, l’un d’entre eux répond à un goitre ovarien ; 20 cas étaient des tumeurs borderline, les tumeurs épithéliales restent les plus fréquentes.

Au terme de cette étude analytique, nous constatons que nos résultats concordent avec ceux de la littérature : classification histopathologique de l’OMS. Toutefois la prise en charge de ces tumeurs, et particulièrement des malignes dont le pronostic reste sombre, nécessite des méthodes diagnostiques précises, des protocoles thérapeutiques adaptés visant à réduire la mortalité par cancer de l’ovaire.

n 80

Résultats à plus de 5 ans d’une étude prospective du traitement radio-chimiothérapie en concomitant de 90 cancers avancés (stades IIB et III) du col utérin

Ferdi N1

1 Centre anti-cancéreux, CHU Benbadis, 25000 Constantine, Algérie.

Le cancer du col utérin représente le 2e cancer de la femme en Algérie. Plus de 70 % sont des formes avancées. De 1994 à 1996, 90 patientes présentant un carcinome épidermoïde du col utérin ont été traitées par radio-chimiothérapie concomitante, elles ont toutes été suivies pendant plus de 5 ans. L’âge moyen était de 52 ans avec des extrêmes (27 à 75 ans), les 90 cancers se répartissaient en 49 (54,4 %) de stade IIB et 41 (45,6 %) de stade III.
La chimiothérapie à base de cisplatine à la dose de 20 mg/m2 hebdomadaire administrée avant la première séance de radiothérapie dose totale (160 mg) la cobaltothérapie à la dose de 45 à 50 Gy a été réalisée chez toutes les patientes survie d’une curiethérapie à la dose de 10 à 15 Gy. La survie globale à 5 ans était de 60 %. La survie à 5 ans est de 74 % pour les stades IIB et de 20 % pour les stades III (p < 0,05). La survie à 5 ans en fonction de l’âge est de 53 % pour les femmes dont l’âge est inférieur à 50 ans et de 48 % pour les femmes de plus de 50 ans (p = 0,4). La survie à 5 ans en fonction de la taille (T) était de 52 % pour les T < 4 cm et de 42 % pour les T > 4 cm (p = 0,4). La survie en fonction du type histologique était de 60 % pour les carcinomes bien différenciés et de 21 % pour les carcinomes indifférenciés (p < 0,05). La survie à 5 ans en fonction du taux d’hémoglobine était de 56 % pour les taux supérieurs à 10 g/dl et de 35 % pour les taux inférieurs à 10 g/dl. Notre série comportait 12 récidives (13,3 %) et 10 métastases (11,1 %). 41 patientes (45,6 %) présentaient 7 ans de recul (en mars 2003). L’association concomitante était le plus souvent utilisée et doit être préconisée dans les stades avancés.

n 81

Le médulloblastome chez l’enfant et l’adulte jeune : à propos de 80 cas

Hamlaoui R1, Taleb S1, Djemaa A1

1 Centre anti-cancéreux, CHU Benbadis, 25000 Constantine, Algérie.

Le médulloblastome tumeur neuro-ectodermique primitive du cervelet (FCP) représente 10 à 20 % des tumeurs cérébrales de l’enfant, 1 à 2 % de l’adulte jeune. Nous rapportons une série de 80 médulloblastomes, 46 cas chez l’enfant (57,7 %) et 34 cas chez l’adulte jeune (42,3 %) colligés au centre d’oncologie-radiothérapie du CHU de Constantine entre janvier 1990 et décembre 2003. L’âge moyen de nos malades était de 8,2 ans chez l’enfant (2-15 ans) et de 23,1 ans chez l’adulte jeune (15-36 ans) avec une nette prédominance masculine 63,3 % versus 43,7 %. La symptomatologie révélatrice était dominée par le syndrome HIC (75 % de cas), syndrome cérébelleux (65 %), troubles visuels (25 %). Le bilan préthérapeutique comprend un fond d’œil dans 65 % cas, un scanner ou une IRM dans 100 % des cas, tous nos malades avaient reçues. Une chirurgie d’exérèse complète dans 66,3 % (53 cas), incomplète dans 52,5 % (26 cas) ; 1 cas inopérable, cette chirurgie est précédée dans 75 % des cas d’une dérivation ventriculo-péritonéale, une chimiothérapie adjuvante type CDDP/VP16 (3 cures) dans 91 % cas (73 cas) et une irradiation de l’encéphale et de l’axe spinal à la dose de 35 Gy et de la fosse cérébrale de 55 Gy dans 94 % cas (75 cas). L’analyse des résultats retrouve 31,3 % (25 cas) de récidives survenues dans les 3 premières années dont 2 cas de métastase sus-tentoriel et 4 cas en spinal, 7,5 % ont été perdues de vue et 5 décédés (4 %). La survie sans maladie était de 54 % à 3 ans, 42 % à 5 ans et 28 % à 10 ans. Les séquelles du traitement à long terme retrouvent 1 retard psychomoteur et 1 retard scolaire ; les séquelles endocriniennes n’ont pas été évaluées.
Hautement curable, le médulloblastome reste de bon pronostic. Une prise en charge par une équipe multidisciplinaire (neurochirurgien, oncologue-radiothérapeute) est essentielle. Le traitement standard comprend une chirurgie d’exérèse la plus complète possible, une irradiation aux doses conventionnelles du système nerveux central et une chimiothérapie, surtout dans les formes à haut risque, une surveillance multidisciplinaire post-thérapeutique (séquelles de la maladie et du traitement).

n 82

Rôle de l’expression des transcrits alternatifs de la survivine dans le cancer du sein

Boidot R, Vegran F, Oudin C, Riedinger JM, Cadouot M, Hahnel L, Lizard-Nacol S

Laboratoire de Génétique Moléculaire, Centre Georges-François Leclerc, Inserm U517, 1, rue du Professeur Marion, 21076 Dijon.

Le gène de la survivine, membre de la famille des IAP (inhibitor of apoptosis protein), donne naissance à trois transcrits alternatifs : le transcrit principal (survivine), la survivine ΔEx3 et la survivine 2B. L a survivine 2B aurait un rôle pro-apoptotique, contraire à celui des deux autres. Bien que le rôle de la survivine dans la résistance aux traitements soit bien établi, l’implication de l’expression de ses variants n’est pas connue jusqu’à présent.
Dans le but de préciser le rôle de chaque transcrit dans la résistance à la chimiothérapie dans le cancer du sein, deux groupes de patientes, A et B, traités respectivement avec 5-fluorouracile-épirubicine-cyclophosphamide (18 cas) et avec docétaxel-épirubicine (15 cas) sont étudiés. L’analyse des transcrits est réalisée par RT-PCR quantitative en temps réel, grâce à des amorces et des sondes spécifiques de chaque transcrit. Des corrélations sont recherchées entre les taux d’expression obtenus avant (28 échantillons), après la première cure (25 intermédiaires) et à la fin du traitement (21) avec les données clinico-pathologiques, ainsi qu’avec la réponse histologique par les tests de Wilcoxon, de Mann-Whitney et du χ2.
Nos résultats ne montrent aucune variation significative de l’expression de chaque transcrit entre les tumeurs avant, intermédiaires et après traitement. De plus, l’expression des différents transcrits n’est pas significative avec les données clinico-pathologiques, sauf pour le grade 3 de la tumeur (survivine, p = 0,0284 ; survivine ΔEx3, p = 0,0024 ; survivine 2B, p = 0,0124) et pour la présence des récepteurs à la progestérone (survivine ΔEx3, p = 0,0148 ; survivine 2B, p = 0,0066). Aucune expression de ces transcrits dans les trois types d’échantillons (avant, intermédiaires et après traitement) n’est corrélée avec la réponse histologique, et ce quel que soit le traitement. Cependant, des variations ont été observées entre l’expression avant traitement et l’expression après une seule cure. Ces variations sont liées à la réponse histologique uniquement pour le traitement A. En effet, une chimiorésistance est significativement liée à une augmentation de chaque transcrit dans les tumeurs intermédiaires (survivine, p = 0,0005 ; survivine ΔEx3, p = 0,0005 ; survivine 2B, p = 0,0009).
Ces résultats mettent en évidence que la variation (augmentation) de l’expression assez précoce de ces transcrits serait un facteur prédictif très spécifique de la non-réponse au traitement A. Il serait donc intéressant de déterminer la valeur pronostique de ces variations d’expression précoces de la survivine et de ses transcrits alternatifs en les corrélant avec la survie des patientes à 5 ans puis à 10 ans.

n 83

Association paclitaxel hebdomadaire et vinorelbine bimensuelle dans le cancer du sein métastatique : résultats finaux de l’étude de phase II

Saintigny P, Morin F, Bouillet T, Levy E, Spano JP, Pommeyrol A, Brun B, Bennamoun M, Des Guetz G, Breau JL, Morère JF

Groupe Nord d’Oncologie Multidisciplinaire, APHP Avicenne, Bobigny, France.

Rationnel. Dans une précédente étude clinique (ASCO 2000 # 417), nous avions démontré une synergie thérapeutique en combinant paclitaxel (P) et vinorelbine (V), deux poisons du microtubule ayant des mécanismes d’action opposés. Pour évaluer l’efficacité et la tolérance de cette association, nous élaborons un schéma de P hebdomadaire et de V bimensuelle.
Méthodes. Les patientes ayant un cancer du sein métastatique préalablement traités par anthracyclines, ont reçu jusqu’à progression ou toxicité inacceptable, toutes les semaines P 80 mg/m2 et toutes les 2 semaines V 25 mg/m2, pendant 8 semaines suivies de 2 semaines de repos.
Résultats. 20 patientes (pts) ont été incluses dans l’étude, avec les caractéristiques suivantes : âge médian 64 ans (amplitude 31-74), performance status 0 (12 pts, 60 %) et 1 (8 pts, 40 %), 15 post-ménopausées (75 %), 14 avec des récepteurs aux estrogènes négatifs (70 %), 5 patientes ayant rechuté dans les 12 mois après une chimiothérapie adjuvante avec anthracyclines (25 %) ; 13 patientes (65 %) ont reçu une chimiothérapie de première ligne métastatique. Un total de 189 semaines de traitement ont été administrées, avec une moyenne de 9,5 semaines (étendue 1-16). Aucun décès n’a été enregistré. Les toxicités les plus fréquentes étaient hématologiques avec des neutropénies de grade 2 (1 pt, 5 %), grade 3 (10 pts, 50 %) et de grade 4 (4 pts, 20 %), incluant 5 (20 %) neutropénies fébriles. Le support hématologique avec G-CSF (lénograstime) concernait 12 pts (60 %). Une seule thrombopénie de grade 4 a été observée. Les toxicités non hématologiques n’étaient pas nombreuses et concernaient principalement des neurotoxicités périphériques de grade 1-2 chez 4 pts (20 %) et de grade 3 chez 1 pt (5 %). Un seul épisode de nausées/vomissements de grade 4 a été notifié. Une réponse objective a été observée chez 10/18 patientes évaluables (55,5 %, intervalle de confiance 95 % = 32-78) avec une réponse complète. Une maladie stable est observée chez 7/18 pts. Le temps médian jusqu’à progression est de 174 jours (amplitude 12-440).
Conclusion. Avec un support hématologique, ce schéma hebdomadaire est faisable chez les patientes traitées préalablement par anthracyclines pour un cancer du sein métastatique. Les neurotoxicités périphériques ne sont pas fréquentes et sont aisément gérables. Le bénéfice clinique est prometteur.

n 84

Analyse rétrospective sur un an des prescriptions d’érythropoïétine humaine recombinante en cancérologie médicale à l’Hôpital européen Georges Pompidou

Levée M1, Scotte F2, Lillo-Le Louët3, Bonan B1, Andrieu JM2, Prognon P1

1 Services de pharmacie,
2 d’oncologie médicale,
3 Centre Régional de Pharmacovigilance, Hôpital Européen G. Pompidou, 20-40 rue Leblanc, 75908 Paris Cedex 15.

La transfusion sanguine seule ne peut traiter l’anémie des patients souffrant de cancer. L’alternative thérapeutique repose sur la prescription d’érythropoïétine humaine recombinante (rHu-EPO).
Objectif. Explorer les modalités de prescriptions de rHu-EPO sur un an au sein d’un service de cancérologie.
Patients et méthode. Sont inclus les patients suivis pour tumeur solide ou hémopathie maligne, recevant un traitement par rHu-EPO prescrit par un médecin du service, lors d’une hospitalisation conventionnelle et/ou de jour. Trois groupes sont constitués, selon la réponse au traitement correspondant à une élévation d’un gramme par décilitre du taux d’hémoglobine, sans limite de temps : répondeurs (R), non répondeurs (NR) et non évaluables (NE).
Résultats
. Les dossiers médicaux de 134 patients ont été revus et analysés. Respectivement 64 %, 13 % et 12 % des patients inclus sont en situations métastatique, adjuvante et néoadjuvante d’une tumeur solide et 11 % sont suivis pour hémopathie maligne. Les cancers pulmonaires constituent le plus gros contingent (33 %). Les trois quarts des patients ont bénéficié d’au moins une thérapeutique adjuvante (fer, folates, vitamine B12). Des antécédents de radiothérapie externe sont relevés chez 37 %. La transfusion de globules rouges, le jour de la mise sous rHu-EPO, concerne 15 %. La durée moyenne de traitement par rHu-EPO est de 78 jours (étendue 7-294 jours) pour une hémoglobine de départ à 9,7 g/dL (étendue 6,5-13,8 g/dL). 46 % des patients sont répondeurs, tandis que 37 % ne sont pas évaluables pour la réponse, en raison de transfusion dans les trois premières semaines de traitement. Sur 17 % des patients NR, 70 % n’ont pas bénéficié d’un doublement de posologie. Le temps de réponse moyen des patients R s’élève à 32 jours (étendue 4-111). Les patientes souffrant d’un cancer de l’ovaire constituent la cohorte ayant le mieux répondu au traitement (71 %).
Conclusion
. Cette étude révèle des carences de prise en charge. Une collaboration accrue entre service clinique et pharmacie optimiserait la prescription de rHu-EPO afin de combattre l’anémie en cancérologie.

n 85

Étude rétrospective d’une série de 34 patients atteints d’un cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) traités par gefitinib (Iressa®) au CHU et au CRLCC d’Angers

Hureaux J1, Gautier-Felizot L2, Le Guen Y1, Soulié P2, Jeanfaivre T1, Urban T1

1 Département de Pneumologie, CHU d’Angers, 4, rue Larrey, 49033 Angers Cedex 01 ;
2 Centre Régional de Lutte contre le Cancer d’Angers, Département d’Oncologie Médicale, 2, rue Moll, 49033 Angers Cedex 01.

Population. Entre décembre 2002 et mars 2004, 34 patients atteints d’un CBNPC ont reçu 250 mg de gefitinib par jour dans le cadre d’une autorisation temporaire d’utilisation nominative en 2e ligne de traitement (1 patient), en 3e ligne (25) ou en 4e ligne ou plus (8) ; 22 hommes/12 femmes, âge moyen 54,3 ± 10,3 ans, stade métastatique 76,5 % ; type histologique : 22 adénocarcinomes dont 2 bronchiolo-alvéolaires, 8 épidermoïdes, 3 carcinomes à grandes cellules et 1 indifférencié ; un sel de platine dans 100 % des cas et un taxane dans 79,4 % en 1re ou 2e ligne de chimiothérapie ; score d’activité OMS 0-1 : 97,0 % ; symptômes induits par le cancer 73,5 %, en progression 97,0 %.
Résultats. Durée médiane d’administration 78 jours [24-430]. Effets indésirables de grade 1-2 (échelle NCI-CTC) : rash 44,1 %, diarrhée 35,3 %, surdosage avec anticoagulants oraux dans 3 cas, dont 2 hémorragies digestives. Activité selon critères OMS : réponse partielle 5,9 %, stabilisation 17,6 % (médiane 91 jours [30-210]), progression 70,6 %, réponse non évaluable 5,9 % (décès avant évaluation). Amélioration de symptômes induits par le cancer à 1 ou 2 mois : 50 % des patients. Dans notre série de patients non sélectionnés, l’Iressa® est bien toléré et réduit transitoirement des symptômes dus au cancer dans 1 cas sur 2. L’emploi concomitant d’anticoagulants oraux impose une adaptation des doses des anticoagulants.

n 86

Cancer de l’œsophage et cirrhose : fréquence de cette association et problèmes thérapeutiques. A propos d’une série cas-témoins

Trivin F1, Vauléon E2, Desclos H1, Tran Vuong TN1, Cumin I2, Boucher E1, Le Prisé E1, Raoul JL1

1 Centre Eugène Marquis (CEM), rue de la Bataille Flandres, Dunkerque CS 44229, 35042 Rennes Cedex ;
2 Département d’oncologie médicale, Centre Hospitalier de Bretagne Sud (CHBS), BP 2233, 56322 Lorient Cedex.

Nous avons voulu, au cours d’une étude rétrospective, apprécier la fréquence de l’association cancer de l’œsophage (CO) – cirrhose (C) et étudier le devenir sous traitement de ces patients par rapport à une série appariée sans cirrhose.
De janvier 1993 à décembre 2002, 958 patients avec CO ont été traités au CEM et au CHBS ; 26 avaient une C associée (cas) ; ils ont été appariés 1 pour 2 (sur âge, stade TNM, localisation, histologie, période de traitement) à 52 patients sans C (témoins).
Les cas (21 hommes de 58,9 ± 7,7 ans) avaient une tumeur (épidermoïde 23 ou adénocarcinome 3) du tiers moyen (46 %), 6 classées T1-T2 et 20 T3-T4, 21 N+ et 3 M+. Le diagnostic de C précédait celui du CO chez 11 ; 19 patients étaient classés Child A et 4 Child B (3 non classés). Traitement : pas de différence significative de proposition thérapeutique entre les deux groupes : schéma de Herskovic ; 16 dans le groupe cas et 29 dans le groupe témoin, 0 cas et 4 témoins étaient opérés. Toxicité du traitement : décès sous traitement, 5 dans chaque groupe ; toxicité hématologique, rénale, vomissements : semblables ; moins de mucite parmi les cas (p = 0,05). La dose de radiothérapie délivrée était semblable (50,4 ± 12,5 Gy versus 47,5 ± 13,2 Gy), la dose intensité de CDDP et de 5FU était la même. Le devenir en fin de traitement était semblable : décès/RC/persistance de la maladie : 5/15/6 chez les cas versus 5/33/14 chez les témoins. Les courbes de survie globale (survie à 2 ans : cas = 28 ± 9 %, témoin = 34 ± 6 %) et sans récidive étaient semblables. La sévérité de la cirrhose était un facteur pronostique important, avec une survie plus faible (p = 0,004) pour les Child B (aucun survivant à 1 an) notamment du fait d’une toxicité accrue du traitement (2 décès/4 patients).
L’association C + CO est rare. Les patients atteints d’un CO, ayant une cirrhose Child B, ont une toxicité majeure et une survie faible sous traitement combiné, ils devraient être traités par radiothérapie seule. Par contre la tolérance et la réponse au traitement sont semblables entre Child A et témoin ainsi que leur survie ; la découverte d’une cirrhose Child A ne doit pas remettre en cause la décision d’un traitement médical classique.

n 87

Chimiothérapie des cancers colorectaux métastatiques : les pauses thérapeutiques sont-elles possibles ?

Trivin F1, Tran Vuong TN1, Desclos H1, Egreteau J1, Boucher E1, Raoul JL1

1 Centre E Marquis, rue de la Bataille Flandres-Dunkerque, CS 44229, 35042 Rennes Cedex.

Lors des chimiothérapies palliatives des cancers colorectaux métastatiques (CCR), nous proposons au patient une pause thérapeutique une fois obtenue une réponse (RO) ou une stabilité (SD) sous couvert d’une surveillance clinique à 6 semaines puis scanographique tous les 3 mois. Nous avons voulu, rétrospectivement, évaluer cette pratique.

Patients et méthodes. Analyse rétrospective d’une sélection aléatoire de dossiers des patients ayant un CCR métastatique vus ou suivis dans les 4 dernières années et ayant bénéficié d’au moins une pause de chimiothérapie.

Résultats. 62 patients (23 femmes) de 60,9 ± 10,8 ans ayant des métastases de cancers coliques (46) ou rectaux traités à visée palliative (sont exclus les patients réséqués à visée curative), ont bénéficié de pauses. Les pauses sont définies comme des périodes pendant lesquelles une chimiothérapie serait possible mais n’est pas délivrée ; sont exclus les périodes de soins palliatifs et les arrêts dus à des effets secondaires. Ces pauses survenaient 1 fois après une seconde ligne et 61 fois dès la première du fait d’une RO (41) ou d’une SD (20) après 4,5 mois (médiane) de chimiothérapie (sans différence entre RO et SD) ; ces premières pauses duraient (médiane) 6 mois ; après 6 mois d’arrêt 52,5 ± 6,4 % (Kaplan-Meier) des patients restaient en pause, 30,7 ± 6 % après 9 mois et 20,5 ± 5,2 % après 1 an. La durée de la pause était plus longue (Logrank ; p < 0,02) après une RO (médiane > 6 mois) qu’après une SD (médiane = 4 mois). Après cette première pause, 57 reprenaient la chimiothérapie, 35 selon la même association (10 RO, toutes après RO initiale, 14 SD et 8 PD), 22 selon une autre (8 RO, 13 SD et 1 PD). Après ce second cycle, 40 avaient une nouvelle pause de 5 mois en médiane (29,5 ± 7,4 % à 6 mois et 13 % à 12 mois étaient encore en pause) ; 32 avaient un troisième cycle (de 3 mois en médiane) et 13 ensuite une pause (médiane = 4 mois) ; 9 reprenaient le traitement (6 mois) et 5 avaient une nouvelle pause (4 mois). Au total dans cette population la durée médiane de traitement était de 8,5 mois (extrêmes : 3 à 30 mois) et celle des pauses de 11 mois (extrêmes 1 à 75). En valeur médiane la durée des pauses était 1,3 fois supérieure à celle des traitements. Au 10 octobre 2003 29 patients étaient décédés, 4 en situation de soins de confort, 14 en pause et 15 en cours de traitement. La survie de ces 62 patients était de 95,2 ± 2,7 % à 1 an, de 70,8 ± 6,5 % à 2 ans et de 48 ± 8 % (11 patients exposés) à 3 ans.

Conclusion. Cette étude rétrospective nous permet de dire : 1) qu’il semble possible de faire des pauses thérapeutiques en cas d’efficacité d’une chimiothérapie pour CCR métastatique ; 2) de les répéter ; 3) sans évidence de perte de survie et 4) ces résultats méritent d’être évalués au cours d’une étude prospective de grande échelle.

n 88

Analyse moléculaire des translocations MLL dans les leucémies aiguës

Maroc N1, Morel A1, Lamy de la Chapelle A1, Harrison C2, Griffiths M3, Mitterbauer-Hohendanner G4, Shurtleff S5, Cayuela JM6, Macintyre E7, Gottardi E8, Schnittger S9, Colomer D10, Fert V1, Hermitte F1, Castéras V1

1 Ipsogen SAS, Marseille, France,
2
 LRF Cytogenetics Group/Univ of Southampton, Southampton, United Kingdom,
3 West Midlands Regional Genetics Laboratory, Birmingham, United Kingdom,
4 University of Vienna, Vienna, Austria,
5 St. Jude’s Children Research Hospital, Memphis, TN,
6 Inserm U462, Hôpital St. Louis, Paris, France,
7 Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, France,
8 Ospedaliera San Luigi Gonzaga, Orbassano, Italy,
9 University Hospital Groβhadern, Munich, Germany,
10 Hospital Clinic, Barcelona, Spain.

La classification des leucémies aiguës myéloïdes a connu des modifications majeures à la suite de l’introduction de la classification WHO en 2001. Cette nouvelle hiérarchisation a pour but de ranger les LAM en quatre catégories principales sur la base de critères morphologiques, immunophénotypiques, génétiques et cliniques. Toutes les catégories proposées présentent une bonne homogénéité intragroupe à l’exception du sous-groupe dans lequel sont classées les anomalies chromosomiques 11q23/MLL. Ces dernières sont généralement associées à un pronostic défavorable. Plus de 50 partenaires de fusion du gène MLL ont été décrits, dont 35 ont été clonés et caractérisés à l’échelle moléculaire. Le rôle fonctionnel précis de chacun des transcrits de fusion dans l’apparition et l’évolution de la maladie reste à être élucidé pour pouvoir être pris en compte d’un point de vue clinique. L’exploitation diagnostique d’un phénomène d’une telle hétérogénéité représente un véritable défi technique. Les tests standard de diagnostic appliqués aux patients atteints de leucémie comprennent couramment une analyse cytogénétique complétée d’une FISH et/ou d’une analyse par RT-PCR. Ce type de stratégie peut se révéler être difficile à gérer du fait que l’identification précise du gène partenaire de fusion pouvant nécessiter de multiples et longues analyses. Nous présentons ici les résultats d’une étude multicentrique internationale ayant pour but de tester les performances cliniques du kit MLL FusionChipTM. Ce nouvel outil d’analyse moléculaire a été conçu de façon à permettre la confirmation de la présence d’une anomalie 11q23 et l’identification du gène partenaire de fusion de MLL. Une étude antérieure a déjà apporté la démonstration que les performances analytiques de ce dispositif onco-diagnostique sont compatibles avec son champ d’application. Dans l’étude présentée ici, les critères d’inclusion des échantillons sont basés sur les procédures standard de diagnostic. L’analyse d’un total de 137 échantillons a permis, pour 76 patients la détection d’une fusion de MLL avec l’un de ses 32 partenaires représentés sur la puce et dans 54 cas la mise en évidence d’un transcrit normal. Au total, 9 partenaires différents ont pu être détectés au cours de cette étude. La répartition du nombre de cas de chacune de ces différentes translocations est en accord avec les données de la littérature. Globalement, le pourcentage de corrélation entre les analyses diagnostiques de routine et le kit MLL FusionChipTM est supérieur à 90 %. Ces résultats suggèrent que le kit MLL FusionChipTM peut être un dispositif clinique d’onco-diagnostic permettant l’amélioration de la stratification moléculaire des leucémies aiguës. Par ailleurs, en ce qu’il permet la mise en évidence précise d’un marqueur moléculaire spécifique de l’échantillon et la définition d’amorces et de sondes de PCR quantitative, ce nouvel outil doit également pouvoir contribuer à un meilleur suivi de la maladie résiduelle. L’une des conséquences de l’affinement de la stratification des patients peut être le développement de thérapies personnalisées parallèlement à l’optimisation de thérapeutiques moléculaires ciblées.

n 89

Le défibrotide (Prociclide®) dans la prise en charge de la maladie veino-occlusive hépatique

Nueffer C1, Passemard R1, Levêque D1, Beretz L1

Service de Pharmacie, Stérilisation, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Hôpital de Hautepierre, 1 avenue Molière, 67098 Strasbourg Cedex.

La maladie veino-occlusive (MVO) hépatique survient dans 5,6 % [0,9-29 %] des greffes de cellules souches hématopoïétiques (GCSH). Elle est sévère dans 28 % des cas avec un taux de mortalité de 66 % [1].
Il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour la prise en charge de la MVO sévère. Le défibrotide (DF), un sel d’acide deoxyribonucléique extrait de muqueuses de mammifères, permet une résolution des signes cliniques chez environ 35 % des patients présentant une MVO sévère [2, 3] (Rem : Ce résultat a été comparé à une mortalité de 98 % [4]). Trois patients ont été traités, aux Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, par DF pour une MVO sévère. Le patient 1 a développé une MVO (ascite, hépatomégalie, hépatalgie, cholestase, thrombopénie et insuffisance respiratoire) à J7 après la GCSH. Le DF a été instauré à J14. La réponse est complète (bilirubinémie à 20 µmol/L, disparition des œdèmes, poids stable, hépatomégalie stable, non douloureuse, bilan hépatique normal) à J26. Le patient 2 a développé une MVO (ascite, cholestase, prise de poids et hépatalgie) à J29 après sa deuxième GCSH. Ce diagnostic a été confirmé, par PBF transjugulaire à J35. Le DF a été instauré à J42. La réponse est complète à J52. Le patient 3 a développé une MVO (ascite, cholestase, prise de poids et insuffisance respiratoire) à J29 après sa deuxième GCSH. Il y a eu une amélioration clinique grâce à un traitement symptomatique. Une rechute de la MVO (ascite, prise de poids, hyperbilirubinémie à 138 µmol/L, thrombopénie à 24 000) s’est produite à J60. Le DF a été instauré à J68. La réponse est complète, mais le patient a bénéficié d’un TIPS à J81. Les trois patients sont toujours en vie à J100 après la GCSH.
Il semblerait cependant que l’on ne puisse attribuer, de façon certaine, la guérison au DF, que chez le patient 1. L’efficacité du DF dans la MVO sévère reste à prouver grâce à des études prospectives sur une population de taille suffisante. Les résultats devront être comparés à des données épidémiologiques fiables.

1. Carreras et al. Blood 1998

2. Richardson et al. Blood 2002

3. Chopra et al. Br J Haematol 2000.

4. Mc Donald et al. Ann Intern Med 1993.  

n 90

Chimiothérapie palliative ELF-EAP dans les tumeurs de Krkenberg d’origine gastrique

Mahfouf H, Oukkal M, Djedi H, Boulouh I, Sakhri S, Raouli S, Bouzid K

Service Oncologie Médicale, EHS, Centre Pierre, Marie Curie, Alger, Algérie.

Les tumeurs de Krkenberg sont des tumeurs ovariennes d’origine digestive (70 % d’origine gastrique), elles représentent 1 à 2 % des tumeurs ovariennes. La chirurgie reste le traitement standard. La chimiothérapie en situation palliative reste peu efficace.
But de l’étude. Evaluation de la réponse thérapeutique, de la toxicité et de la survie.
Résultats. De janvier1996 à avril 2004, 18 patientes (pts) d’âge moyen 38,3 ans (22-70 ans) ont été incluses dans l’étude. Les métastases ovariennes étaient bilatérales dans 64 % des cas, synchrones dans 2/3 des cas. Une gastrectomie type D2 a été pratiquée dans 6 cas, une hystérectomie avec annexectomie et omentectomie dans 5 cas. Les pts ont bénéficié d’une chimiothérapie selon le protocole alterné (4 cures) ELF : étoposide 120 mg/m2 J1-J2-J3, lederfoline 300 mg/m2 J1-J2-J3, 5FU 500 mg/m2 J1-J2-J3 ; EAP : étoposide 120 mg/m2 J1-J2-J3, doxorubicine 50 mg/m2 J1, cisplatine 70 mg/m2 J1 avec (J1 = J21). Après un total de 68 cures, 16 pts sont évaluables pour la réponse thérapeutique avec 5 réponses partielles, 11 maladies stables soit une réponse objective de 31 %. Dix-huit pts sont évaluables pour la toxicité (grade 3 et 4 OMS) : alopécie 53 %, anémie 12 %, thrombopénie 2 %, neutropénie 4 %, vomissements 12 %. La médiane de survie est de 9,3 mois.
Conclusion. Les tumeurs de Krkenberg sont de pronostic sombre. L’inclusion dans des essais multicentriques et l’utilisation de nouvelles molécules pourrait améliorer la survie des patientes.

n 91

Les tumeurs borderline de l’ovaire : à propos de 36 cas

Ben Hassouna J, Dhiab T, Chargui R, Bouzid T, Bouzaïène H, Khomsi F, Mtaallah M, Makhlouf R, Gamoudi A, Boussen H, Benna F, Héchiche M, Rahal K

Service de Chirurgie carcinologique, Institut Salah Azaïz.

Les tumeurs borderline de l’ovaire sont des tumeurs rares. Elles représentent 10 à 20 % des tumeurs épithéliales malignes de l’ovaire. Dans près de 75 % des cas il s’agit d’un stade I au moment du diagnostic. Leur pronostic est excellent et le traitement est clairement différent de celui des tumeurs malignes de l’ovaire.
La présente étude est une étude rétrospective à propos de 36 cas de tumeurs borderline de l’ovaire traités dans le service de chirurgie carcinologique de l’Institut Salah Azaïz sur une période de 11 ans (1991-2002). L’âge moyen de nos patientes était de 43 ans avec 50 % de femmes âgées de moins de 35 ans et 33 % des nulligestes. Nous avons réalisé une chirurgie conservatrice préservant un ovaire et l’utérus chez 14 patientes. Il s’agissait de 16 tumeurs séreuses, 19 mucineuses et une mixte. Des implants invasifs à distance étaient retrouvés dans 3 cas. Des implants invasifs existaient chez 8 patientes dont 4 pseudomyxomes. Dans 65 % des cas la maladie était limitée au pelvis (stades I et II de la FIGO). Deux patientes ont eu une chimiothérapie adjuvante devant la présence d’implants invasifs à distance. Nous avons noté 7 cas de récidive après un délai de 24 à 264 mois. Parmi ces patientes, 4 étaient classées stade I. Trois patientes ont accouché d’enfants à terme après traitement conservateur.
La prise en charge des tumeurs borderline nécessite une étroite collaboration entre chirurgien et anatomopathologiste. La stratégie thérapeutique est délicate : il faut concilier les impératifs carcinologiques et le désir de grossesse. L’apport des traitements adjuvants n’est pas démontré.

n 92

À propos d’une tumeur desmoplastique à petites cellules rondes paratesticulaire

Thuret R, Renaudin K, Batesti S, Bouchot O, Leclerc J, Théodore C.

Institut Gustave Roussy, 94800 Villejuif, CHU, 1 place Alexis Ricordeau, 44000 Nantes.

Un homme de 34 ans, sans antécédent notable, est adressé pour une augmentation de volume testiculaire droite, asymptomatique découverte lors d’une visite d’embauche. L’examen clinique est par ailleurs normal et le bilan biologique, dont les marqueurs de tumeur testiculaire l’est également. L’échographie testiculaire met en évidence un volumineux testicule avec plusieurs zones hypo-échogènes et nodule extratesticulaire développé entre la paroi scrotale et la tête de l’épidydime. La pièce d’orchidectomie pesait 192 g et présentait de nombreux nodules blanchâtres dans et autour du testicule. Microscopiquement, il s’agissait d’une tumeur constituée de nids de petites cellules rondes au sein d’un stroma fibreux dense. Les cellules présentaient des nucléoles hyperchromatiques et un cytoplasme éosinophile, des limites floues et un index mitotique élevé. L’immunohistochimie était positive pour la kératine, l’antigène épithélial de membrane, la vimentine, l’enolase neuro-spécifique et pour la desmine mais négative pour la protéine S100 et le HBA71. La RT-PCR sur tissu fixé a montré le produit de fusion EWS WT1, traduisant la translocation t(11.22) (p13.q12) avec réarrangement des gènes de la tumeur de Wilms et du sarcome d’Ewing spécifique des tumeurs desmoplastiques. Le bilan d’extension mettait en évidence des métastases pulmonaires bilatérales et deux images rétropéritonéales de respectivement 19 mm et 13 mm compatibles soit avec des adénopathies, soit avec des images de carcinose péritonéale. Une polychimiothérapie a été entreprise.
Les diagnostics différentiels de tumeur à petites cellules rondes paratesticulaires sont le rhabdomyosarcome, le lymphome, le carcinome du rete testis, les PNET et le mésothéliome malin. Bien que la morphologie puisse être similaire, l’immunohistochimie polyphénotypique des tumeurs desmoplastiques est très suggestive. De toute façon, la mise en évidence du transcrit EWS-WT1 permet d’affirmer le diagnostic. Les tumeurs desmoplastiques sont des tumeurs rares de l’enfant ou de l’adulte jeune, décrites récemment, hautement malignes, se développant au niveau des séreuses, le plus souvent du péritoine, plus rarement de la plèvre, ici de la vaginale paratesticulaire. Par rapport aux tumeurs desmoplastiques intra-abdominales, la variante paratesticulaire ne s’accompagne pas nécessairement d’une très volumineuse masse tumorale ni de signes généraux, notamment de cachexie. Le pronostic est moins péjoratif sous réserve que l’exérèse chirugicale soit complète. La chimiothérapie est indiquée dans tous les cas. La description de ce cas souligne l’importance d’un diagnostic histologique précoce de toutes les masses intrascrotales, même asymptomatiques.

n 93

Étude rétrospective du rôle de la chimiothérapie (CT) dans la survenue de métastases du système nerveux central chez les patientes porteuses d’un cancer du sein

Baylot D1, 2, Queudeville A1, Kloos-Muresan I1, Raymond E1, Madelaine I2, Faure P2, Misset JL1

1 Service d’Oncologie Médicale ;
2 Service Pharmacie, Hôpital Saint-Louis (AP-HP), 1 av. Claude Vellefaux, 75010 Paris.

L’apparition d’une métastase cérébrale ou méningée représente un événement de plus en plus fréquent au cours de l’évolution des cancers du sein. Une analyse rétrospective, de cohorte, a été réalisée sur des patientes atteintes d’un cancer du sein avec ces localisations secondaires, de 1990 à 2003. Trente patientes, de 48 ans d’âge médian [30-69] ont été analysées. La tumeur était un carcinome canalaire dans 73 % des cas, lobulaire dans 13 %, mixte dans 3 % et non différenciée dans 14 %. Les tumeurs étaient de stades T1 à 13 %, T2 à 30 %, T3 à 3 %, T4 à 37 % et non retrouvées à 17 % ; 7 % étaient de grade SBR I, 33 % étaient SBR II, 47 % étaient SBR III et 14 % étaient non documentées. Les récepteurs hormonaux étaient positifs dans 50 % des cas, non documentés à 10 %. Toutes les patientes avaient un envahissement ganglionnaire axillaire (nombre moyen 5). Après chirurgie, 70 % des patientes ont eu un traitement adjuvant à base d’anthracyclines et 80 % une radiothérapie ; 17 % des patientes étaient métastatiques d’emblée. Sinon, le délai moyen d’apparition de la première métastase (M) était de 29,9 mois. La première évolution métastatique était multifocale dans 27 % des cas, au SNC seul dans 23 % et de 7 % de façon concomitante, hépatique dans 13 %, cutanée, osseuse et pulmonaire dans 7 %, ganglionnaire, locale et controlatérale dans 3 %. Le délai moyen d’apparition entre la première M et la M cérébrale est de 16,3 mois. L’atteinte du SNC est parenchymateuse dans 43 % des cas, méningée dans 17 %, mixte dans 40 % des cas. Au stade métastatique, 67 % des patientes ont reçu une ligne de CT passant la barrière hémato-encéphalique (méthotrexate haute dose, CMF, ifosfamide, VP16…). À ce jour, 50 % des patientes sont décédées, 37 % sont toujours traitées, 13 % sont en traitement palliatif.
L’étude montre que les patientes présentant une première rechute cérébrale ont un âge inférieur à la moyenne d’apparition du cancer du sein et des caractéristiques notables d’agressivité tumorale (SBR III, N+). Il semble également que la nature des CT antérieures influencerait le délai de survenue des localisations cérébrales : en effet, depuis plusieurs années, l’utilisation de nouvelles molécules (docetaxel, trastuzumab…) pourrait contribuer à prolonger la durée de survie de ces patientes mais celles-ci seraient moins efficaces pour retarder l’apparition de ces localisations.

n 94

Hémopathie maligne après cancer du sein : évaluation du risque lié aux anthracyclines et à la mitoxantrone. Résultats de l’étude cas-témoins multicentrique nationale

Le Deley MC1, Suzan F1, Cutuli B2, Delaloge S1, Samand A1, Fenaux P3, Hill C1

1 Institut Gustave-Roussy, Villejuif ;
2
 Clinique Courlancy, Reims ;
3 Hôpital Beaujon, Paris.

La survenue d’une hémopathie maligne après traitement d’un premier cancer met en jeu le pronostic vital à un moment où, souvent, le risque lié au premier cancer décroît. But de l’étude. Estimer le risque de développer une hémopathie maligne chez des patientes traitées pour un cancer du sein, en fonction des traitements reçus, en particulier en fonction de la dose de mitoxantrone sur risque de cancer et d’anthracyclines.
Méthodes. Nous avons étudié le risque de développer une leucémie aiguë myéloblastique (LAM) ou lymphoblastique (LAL), un syndrome myélodysplasique (SMD) ou une leucémie myéloïde chronique (LMC) après traitement d’un cancer du sein. Une étude cas-témoins a été réalisée en France et a inclus 202 cas appariés à 594 témoins. Les caractéristiques du premier cancer, l’histoire familiale de cancer ainsi que les traitements (type et doses cumulées de chimiothérapie, schéma d’administration, dose-intensité, type de radiothérapie et dose de radiothérapie reçue par la moelle osseuse active) ont été comparés entre les cas et les témoins au moyen d’une régression logistique conditionnelle.
Résultats. Cette étude démontre pour la première fois que le risque est largement supérieur après exposition à la mitoxantrone (OR = 14,1 ; IC95 % = 6,8 – 29,9) qu’après exposition aux anthracyclines (OR = 2,9 ; IC95 % = 1,8 – 4,8). Le risque lié à l’épirubicine est comparable au risque observé après la doxorubicine, avec une équivalence de risque entre une cure de FEC100 et une cure de FAC50. Le risque n’apparaît pas lié à la dose cumulée, au schéma d’administration ou à la dose-intensité de ces drogues. La radiothérapie augmente également le risque d’hémopathie d’un facteur 3,5 (IC95 % = 1,4-9,0), là encore sans relation dose-effet significative. Le petit groupe de femmes ayant reçu des facteurs de croissance hématopoïétique (G-CSF) a un risque très supérieur aux autres (OR = 6,4 ; IC95 % = 2,0-20,3, p = 0,0005) et ceci indépendamment des doses de chimiothérapie, mais l’interprétation de ce résultat doit être prudente. Par ailleurs, il est important de noter que ces résultats paraissent homogènes quand on considère les principaux types d’hémopathie séparément (LAM, SMD).
Conclusion. Les inhibiteurs de la topo-isomérase II, et plus particulièrement la mitoxantrone, sont les principaux facteurs de risque d’hémopathie maligne après traitement d’un cancer du sein en France dans les dernières années. Ce résultat conforte la décision de retrait de l’AMM pour la mitoxantrone dans le traitement adjuvant du cancer du sein. De nouvelles études pharmaco-épidémiologiques seront nécessaires pour évaluer le risque de survenue de cette complication rare mais grave après les nouveaux traitements.

n 95

Lymphomes malins non hodgkiniens primitifs du cavum : expérience du centre d’oncologie Ibn Rochd de Casablanca

Khouchani M, Benchakroun N, Jouhadi H, Tawfiq N, Sahraoui S, Acharki A, Benider A

Centre d’oncologie Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Les LNH de la sphère ORL représentent la deuxième localisation extraganglionnaire des LNH. L’atteinte primitive du cavum est très rare ; seulement 270 cas sont décrits dans la littérature. Nous rapportons une série de 21 cas colligés au COIR entre janvier 1985 et décembre 2001 afin de ressortir les particularités épidémiocliniques, anatomopathologiques et thérapeutiques de cette entité rare.
La moyenne d’âge de nos malades a été de 51 ans (20-90), il s’agissait de 11 hommes et 10 femmes, le délai moyen de consultation a été de 5,5 mois (1,5-12), la symptomatologie clinique a comporté un syndrome ganglionnaire dans 67 % des cas, un syndrome otologique dans 61 % des cas, un syndrome rhinologique dans 50 % des cas et un syndrome neurologique dans 12 % des cas. Les signes généraux ont été notés chez 22 % des malades. Le LNH à grandes cellules a été le plus fréquent, retrouvé dans 62 % des cas et le phénotype B chez les deux tiers des malades. Au terme d’un bilan d’extension locorégional et général, nos malades ont été classés (Ann Arbor) en stade IE dans 27 % des cas, stade IIE dans 68 % des cas et stade IV dans 5 % des cas.
Sur le plan thérapeutique, 6 malades ont été PDV avant tout traitement, 14 ont reçu une chimiothérapie type CHOP (cyclophosphamide, doxorubicine, vincristine et prednisone), la rémission complète (RC) a été obtenue chez 7 patients. La radiothérapie externe a été réalisée à la dose moyenne de 40 Gy chez 12 patients dont 5 étaient en évolutivité après la chimiothérapie, la RC a été obtenue dans 8 cas. A la fin de notre étude, 6 malades sont en RC maintenue avec un recul moyen de 50 mois. Un malade a présenté une récidive locale après un délai de 16 mois et un autre une récidive ganglionnaire après un délai de 7 mois.
Les auteurs discutent à travers cette série les données de la littérature.

n 96

Chimiothérapie des cancers coliques : expérience du centre d’oncologie Ibn Rochd de Casablanca

Mazouzi A, Bouih N, Bourezgui H, Benchakroun N, Jouhadi H, Tawfiq N, Sahraoui S, Acharki A, Benider A.

Centre d’oncologie Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Le cancer colique est le deuxième cancer en Europe, il représente 25 % des cancers digestifs et 60 % des cancers colorectaux. Son incidence augmente de façon significative entre 40 et 45 ans. Le sexe ratio est approximativement de 1. L’adénocarcinome est le type histologique le plus fréquent. Il est souvent découvert à un stade avancé. Son traitement de base est la chirurgie.
De 1995 à 2000, 116 patients ont été suivis au centre d’oncologie Ibn Rochd de Casablanca pour cancer colique. La moyenne d’âge a été de 53 ans. L’occlusion digestive avait marqué le tableau clinique (44 cas), une hémicolectomie a été effectuée dans 68 cas. L’adénocarcinome a été retrouvé dans 105 cas. Selon la subdivision en stade, on a noté 49 cas de stade C2, 36 cas de stade B2, 29 cas de stade D et 2 cas dont le stade n’a pas été précisé. L’indication d’une chimiothérapie adjuvante a été posée dans 77 cas, selon le protocole Fufol (5-fluoro-uracile, acide folinique) dans 64 cas. L’évolution a été marquée par la survenue d’une rémission complète à la fin du traitement dans 88 cas, maintenue dans 38 cas. On a noté 13 cas de métastases, 7 cas de récidives locorégionales et 6 cas de récidives avec métastases. La survie globale et la survie sans rechute à 3 ans ont été respectivement de 24 % et de 19 %.
A travers ce travail et une revue de la littérature, les auteurs montrent l’apport d’une chimiothérapie adjuvante dans le traitement des cancers coliques, qui reposent avant tout sur une exérèse large.

n 97

Oxaliplatine, acide folinique et 5-fluorouracil (Folfox 7) dans le traitement des cancers colorectaux localement évolués et/ou métastatiques

Oukhal M, Raouli S, Sakhri S, Baloul S, Bouzid K

Oncologie Médicale EHS Centre Pierre et Marie Curie, Alger, Algérie.

Les cancers colorectaux sont fréquents surtout en Occident, leur incidence en Algérie est en constante progression : 14,3/105 (hommes) et 13,8/105 (femmes) [Registre des tumeurs INSP 2001]. Leur pronostic reste réservé et plus de la moitié des patients meurent de l’évolution de leur maladie. Dans cet essai nous avons évalué l’association oxaliplatine (OXA), acide folinique (AF) et 5-fluorouracil (5FU) chez des patients atteints de cancer du côlon ou du rectum localement évolué et/ou métastatique.
Méthodes. Critères d’inclusion : adénocarcinome du côlon ou du rectum prouvé histologiquement, lésions mesurables, pas de chimiothérapie antérieure sauf adjuvante depuis plus de 6 mois, pas de métastases cérébrales, pas de neuropathie > grade 2, ECOG PS =, bilan biologique correct et consentement éclairé. Le protocole de chimiothérapie est OXA 130 mg/m2 perfusion de 2 h à J1, AF 400 mg/m2/2 h à J1 et 5FU 2400 mg/m2/perfusion continue de 46 h avec J1 = J14.
Résultats. De mars 2003 à mars 2004 nous avons recruté 28 patients (M/F = 16/12, côlon/rectum = 13/15) d’âge moyen 46 ans (22-71). Onze avaient une affection localement évoluée et 17 étaient en situation métastatique avec les sites métastatiques suivants : foie/poumon/os = 15/4/1. Un total de 121 cycles a été administré (2-9). Les 28 patients sont évaluables pour la toxicité et 23 pour les réponses. Nous avons obtenu 2 réponses complètes (8,6 %), 9 réponses partielles (39,1 %), 4 stabilisations (17,4 %) et 8 progressions (34,7 %) avec un taux de réponses objectives (RC + RP) de stabilisations (17,4 %) et 8 progressions (34,7 %) avec un taux de réponses objectives (RC + RP) de 47,7 %. La toxicité sévère (grades 3 et 4 de l’OMS) estimée sur les 121 cycles retrouve une anémie dans 0,8 %, une thrombopénie 1,6 %, des vomissements 2,4 %, une diarrhée 1,6 %, une mucite 1,6 % et une neuropathie sensitive 0,8 %. Le recul est insuffisant pour calculer la médiane de survie.
Conclusion. L’association OXA-AF-5FU (Folfox 7) est efficace et bien tolérée en première ligne de traitement des cancers colorectaux localement évolués et/ou métastatiques.

n 98

La chimiothérapie néoadjuvante dans les carcinomes du cavum

Bayla A, Jennani A, Elmoatazbillah N, Jouhadi H, Tawfiq N, Acharki A, Benchekroun N, Sahraoui S, Benider A

Centre d’Oncologie Ibn Rochd, Casablanca, Maroc.

Les carcinomes du cavum constituent une entité particulière des cancers de la tête et du cou. Ce sont des tumeurs chimiosensibles et radiocurables. Le but de ce travail est de déterminer le rôle de la chimiothérapie néoadjuvante dans le pronostic des carcinomes du cavum.
De 1993 à 1996, 108 cas de carcinomes nasopharyngés ont été traités au service d’oncologie Ibn Rochd de Casablanca par une chimiothérapie néoadjuvante. Il s’agissait de 73 % d’hommes et 27 % de femmes, d’un âge moyen de 38 ans. Le carcinome indifférencié représentait 70 % des types histologiques. Selon la classification TNM de 1987, les stades localement avancés T3-T4 et/ou N2-N3 ont été retrouvés dans 94 % des cas.
La chimiothérapie néoadjuvante a été à base de protocole BEC (bléomycine, épirubicine ou doxorubicine et cisplatine) dans 72 % cas et d’autres protocoles non-BEC dans 28 %. Un à quatre cycles ont été administrés avant la radiothérapie. Cette dernière a été réalisée par un appareil de cobalt, à la dose de 70 Gy en moyenne, au niveau du cavum et des sites ganglionnaires initialement atteints, et 45 Gy pour le reste des aires ganglionnaires cervico-susclavulaires.
La tolérance à la chimiothérapie a été bonne. La réponse objective a été de 84 % dont 37 % de rémission complète. A la fin du traitement, 77 % des malades étaient en contrôle de leur maladie. Ce contrôle a concerné en particulier les malades de plus de 40 ans (79 % versus 74,5 %), les stades T1-2 (83 % versus 71 %), T3 et T4 (78 %), les NO (93 % versus 64 % N3), le protocole BEC (79 % versus 70 %) et les bons répondeurs à la chimiothérapie (79 % versus 50 %). Le délai entre la chimiothérapie et la radiothérapie de moins de 3 semaines a été également un facteur de bon pronostic (85 % versus 60 %), ainsi que la dose d’irradiation de plus de 60 Gy (80 % versus 73 %).
Le taux de récidives locorégionales a été de 47 % à 4 ans et de métastases de 13 %. A 4 ans la survie sans maladie a été de 27 % et la survie globale de 47 %. Cette dernière a été positivement influencée par l’âge supérieur à 40 ans (49 % versus 38 %), le sexe féminin (52 % versus 40 %), le stade localisé T1-2 (52 % versus 42 % T3 et 44 % T4) et le protocole BEC (54,6 % versus 37 %). De même l’intervalle de moins de 3 semaines entre la fin de la chimiothérapie et le début de la radiothérapie a été un élément de bon pronostic avec 51 % versus 27 %. La dose de radiothérapie dépassant 60 Gy a été un facteur positif de survie (48 % versus 37 %).

n 99

Chimiothérapie néoadjuvante dans les thymomes malins : à propos de 7 cas

Bayla A, Jennani A, Jouhadi H, Benchekroun N, Tawfiq N, Sahraoui S, Acharki A, Benider A

Centre d’oncologie lbn Rochd,Casablanca, Maroc.

Les thymomes malins sont des tumeurs malignes rares des cellules épithéliales du thymus, elles surviennent essentiellement chez l’adulte et elles sont exceptionnelles chez l’enfant ; leur pronostic dépend de leur extension. Elles posent un réel problème diagnostique, clinique, anatomopathologique et de prise en charge thérapeutique. Le but de ce travail et de discuter, à travers une série de 7 patients, le rôle de la chimiothérapie néoadjuvante dans le traitement des thymomes malins.
Entre janvier 1998 et décembre 2003, 7 patients porteurs d’un thymome malin confirmé à l’histologie ont été colligés au centre d’oncologie Ibn Rochd de Casablanca. L’âge moyen de nos malades est de 35 ans, le sex ratio est de 1,3. Dans les antécédents, la notion de tabagisme a été notée dans 4 cas et de tuberculose dans 2 cas. Sur le plan clinique, la douleur thoracique a constitué le premier motif de consultation, la myasthénie a été retrouvée dans 3 cas, le délai moyen au diagnostic est de 10 mois. La radio du thorax a montré un élargissement médiastinal dans tous les cas ; elle a été complétée par une tomodensitométrie thoracique dans tous les cas qui a montré une masse médiastinale antérieure. L’histologie a été confirmée par ponction-biopsie scanoguidée dans 4 cas et biopsie chirurgicale dans 3 cas. Sur le plan thérapeutique une chimiothérapie première a été instaurée dans tous les cas, suivie d’une chirurgie puis d’une radiothérapie dans 4 cas et d’une radiothérapie seule dans 3 cas. L’évolution a été marquée par 6 rémissions complètes et un décès. Les thymomes malins ont une extension essentiellement locorégionale. La chimiothérapie néoadjuvante et la radiothérapie postopératoire permettent d’améliorer le contrôle local et le pronostic de ces tumeurs.

n 100

Intérêt pronostique de l’octréoscan et de l’expression des récepteurs de la somatostatine sst1-5 par immunohistochimie dans les tumeurs endocrines malignes : étude rétrospective sur 98 patients

Asnacios A1, Rochaix P2, Courbon F3, Bauvin E4, Susini C5, Schulz S6, Boneu A3, Buscail L7, Guimbaud R1

1 Fédération d’Oncologie Digestive,
2 Services d’Anatomopathologie et de ;
3 Médecine Nucléaire, Centre Claudius Regaud ;
4 d’Epidémiologie Faculté de Médicine Purpan ;
5 Inserm U531 et
7 Service de Gastroentérologie, CHU Rangueil, Toulouse, France ;
6 Service d’Obstétrique et Gynécologie, Université Otto-Von-Guericke, Magdeburg, Allemagne.

Les tumeurs endocrines (TE) bien différenciées malignes représentent une entité clinique hétérogène. L’identification de sous-groupes plus homogènes, notamment sur le plan pronostique, permettrait une meilleure approche thérapeutique. Une de leurs caractéristiques essentielle est leur richesse en récepteurs à la somatostine (sst), base de l’utilisation diagnostique de l’octréoscan et du traitement par analogues de la somatostatine.
But
. Dans les TE bien différenciées malignes, déterminer le caractère pronostique de la fixation à l’octréoscan et du profil d’expression des récepteurs sst1-5.
Parmi 461 malades ayant eu un octréoscan entre 1994 et 2002, 98 patients porteurs de TE bien diffrenciée maligne de site primitif digestif ou bronchique ont été étudiés. Cette population comportait deux groupes appariés différant par leur résultat à l’octréoscan (groupe octréoscan non fixant, n = 48 et groupe octréoscan fixant, n = 50). Les données clinico-biologiques ont été recueillies et une relecture systématique anatomopathologique a été réalisée avec l’étude par immunohistochimie de l’expression des récepteurs sst1-5. L’absence de fixation à l’octréoscan est un facteur de mauvais pronostic sur la survie globale (analyse multivariée ; p < 0,05) ainsi que l’âge, la présence de métastases hépatiques et l’absence de syndrome hormonal. L’expression de sst2 en immunohistochimie est corrélée au profil de fixation à l’octréoscan (p < 0,001). Par ailleurs, l’expression par immunohistochimie de sst2 est prédictive de la réponse thérapeutique de la somatostatine à visée symptomatique anti-sécrétoire pour le traitement du syndrome carcinoïde (p = 0,001).
Il s’agit de la première étude mettant en évidence la valeur pronostique du profil de fixation de l’octréoscan des TE malignes bien différenciées. L’étude du profil d’expression de sst2 par immunohistochimie étant prédictive de la fixation à l’octréoscan d’une part, et de la réponse au traitement par les analogues de la somatostatine d’autre part, sa réalisation devrait être intégrée dans la stratégie de prise en charge des patients.

n 101

Phase II weekly paclitaxel in patients with recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma

Merad-Boudia Z1, Marti A2

1 Service d’Oncologie médicale, 62200 Boulogne-sur-mer, France ;
2 Hôpital de jour chimiotherapie, 62100 Calais, France.

The aim of this study was to assess the efficacity and the toxicity of weekly paclitaxel in patients (pts) with recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma. Pts who failed to the standard first ligne chemotherapy 5FU-cisplatinum have poor prognosis survival and even if methotrexat is currently used. There is no efficient second ligne chemotherapy. Monthly paclitaxel is an active an interesting drug in several solid tumors as breast, lung and bladder cancer. Weekly paclitaxel seems less toxic and probably more efficient that monthly paclitaxel (possibly because of the proapoptotic and anti-angiogenic activity), the dose-intensity is quit higher and the toxicities are mild.
Materials and Methods. Ten recurrent and/or metastatic head and neck cancer pts with PS : 0 to 2 and adequat organ function all previously pretreated with the standard 5FU-cisplatinum regimen and/or radiotherapy and/or surgery where assigned to receive paclitaxel 80 mg/sqm/week during 4 weeks every 6 weeks until documented progression or unacceptable toxicity. There were 7 males and 3 females, median age 50y (range : 42-72y).
Toxicity
. A total of 67 cycles was administred (range 1- 27). 5 pts (50 %) died 3 of them from related toxicity : 1 pts two days after the first administration, 1 stopped because of dyspnea after 4 cycles and 1pts had a partial response > 50 % but developped immunoallergic pneumopathy after 7 months and died of progression and pneumopathy, respectively.There were no hematological or neurological toxicity., 5 pts (50 %) are stable deasease and are still treated.
Conclusion. Treatment with weekly paclitaxel is feasible and active but it should be be reserved to pts with good PS and, regarding to our non selected and small population, it should be rapidly stopped in patients in case of any respiratory dysfonction before or during the treatment.

n 102

La diversité du transcrit bcr-abl dans les leucémies à chromosome Philadelphie

Menif S, Dellagi K

Laboratoire d’Hématologie, Institut Pasteur, Tunis, Tunisie

Décrit pour la première fois par Nowell et Hungerford en 1960, le chromosome Philadelphie est une anomalie génétique acquise qui accompagne différentes formes de leucémies. En effet ce chromosome est retrouvé dans 95 % des leucémies myéloïdes chroniques (LMC), 15 % des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et 1 % des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM). Interprété initialement comme une délétion du chromosome 22, l’apparition des techniques de banding ont permis de démontrer qu’il s’agit d’une translocation réciproque entre les chromosome 9 et 22 qui transfère le proto-oncogène abl du chromosome 9 sur le chromosome 22 générant ainsi un transcrit de fusion bcr-abl qui sera traduit en une protéine douée d’une activité tyrosine kinase dérégulée à l’origine de la transformation maligne.
L’étude approfondie de ce remaniement a permis d’identifier différents variants de transcrit bcr-abl selon la localisation des points de cassure sur bcr et abl et à chaque variant bcr-abl correspond une oncoprotéine différente qui s’associera à un phénotype particulier de leucémie. Ainsi dans la LMC la plupart des points de cassure se situe dans la région M de BCR qui s’étend entre les exons 12 à 16 de BCR ; pour abl les points de cassures se situent essentiellement entre les exons a1 et a2 ; ainsi les variants e13a2 et e14a2 sont les transcrits les plus fréquemment retrouvés dans la LMC et génèrent la protéine p210. Dans les LAL c’est surtout le variant e1a2 qui génère la protéine p190. Cependant d’autres variants plus rares ont été rapportés tels que e19a2, e15a2, e6a2, e8a2, e13a3,e1a3, avec une incidence variable selon les séries analysées.
Nous rapportons l’analyse d’une cohorte de 40 patients suivis dans les différents services d’hématologie de la Tunisie répertoriés au laboratoire d’hématologie de l’Institut Pasteur de Tunis. Cette série comprend 34 cas de LMC et 6 cas de LAL tous Ph+. Une RT-PCR multiplexe utilisant des amorces couvrant les points de cassure les plus fréquents a permis d’identifier chez ces malades différents variants bcr-abl, mais pour deux cas de LMC Ph+ aucun variant bcr-abl n’a été identifié avec les amorces utilisées. Une analyse plus approfondie et un séquençage sont nécessaires pour pouvoir individualiser ces variants.
La revue de la littérature a montré la présence de plusieurs variants rares associés à des formes de LMC typiques, d’où l’intérêt d’identifier le variant associé à chaque LMC au diagnostic afin d’éviter une évaluation erronée de la maladie résiduelle.

n 103

Survie relative de 965 cancers thyroïdiens différenciés : expérience de l’Institut Bergonié

Bonichon F1,Taïeb A2, Mathoulin-Pélissier S3, Picot V3, Soubeyran I4

1 Service de Médecine Nucléaire, Institut Bergonié, 229 Cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex ;
2 Unité Inserm 593 ;
3 Service de Biostatistiques, Institut Bergonié, 229 Cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex ;
4 Service d’Anatomie Pathologique, Institut Bergoni, 229 Cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Objectifs. Les cancers différenciés thyroïdiens sont en général de bon pronostic et la survie globale prenant en compte la totalité des décès ne reflète pas toujours les bons résultats thérapeutiques. La survie relative, qui fait le rapport entre survie observée et survie attendue d’une population équivalente, nous semble plus utile pour parler de guérison et d’absence de létalité liée au traitement.
Méthodes. Nous avons étudié la cohorte hospitalière des 965 patients atteints de cancers thyroïdiens différenciés vus à l’Institut Bergonié de 1961 à 2001 inclus. Une relecture anatomopathologique a été faite à l’Institut pour 95 % des cas. Perdus de vue : 1,2 %. Recul médian : 7,8 ans. Nous avons employé la technique de Hakulinen [1] pour estimer la survie attendue ainsi que le logiciel Surv3 (http ://www.cancerregistry.fi/surv3/) utilisé par les Finlandais pour calculer la survie relative à partir des registres de tumeurs. Les tables de mortalité du moment de la population française ont été reformatées avec SASTM pour être incorporées dans le logiciel SURV3.
Résultats. La survie relative à 10 ans est de 0,93 (IC95 % : 0,89-0,96) pour la cohorte globale et diminue en fonction du stade, stade 1 : 1,01 (IC95 % : 0,98-1,02), stade 2 : 0,98 (IC95 % : 0,89-1,05), stade 3 : 0,73 (IC95 % : 0,60-0,87), stade 4 : 0,29 (IC95 % : 0,16-0,48). Pour les stades 1 le plateau se maintient après 10 ans.
Conclusion. Les résultats de notre étude confirment que les patients atteints de cancer thyroïdien différencié à un stade précoce ont une survie comparable à celle de la population des mêmes âge et sexe et ne devraient pas être pénalisés comme ils le sont actuellement dans leur vie quotidienne, en particulier lorsqu’ils veulent faire des emprunts bancaires.

1. Hakulinen T, Abeywickrama KH. A computer program package for relative survival analysis. Comput Programs Biomed 1985 ; 19 : 197-207.

n 104

Le carcinome insulaire de la thyroïde : revue de la littérature et expérience de l’Institut Bergonié (27 patients)

Tychyj C1, Bonichon F1, Soubeyran I2

1 Service de Médecine Nucléaire,
2 Service d’Anatomie Pathologique, Institut Bergonié (CRLCC), 229, Cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Objectifs. Le carcinome insulaire (CI) est un cancer peu différencié de la thyroïde rare, d’origine folliculaire, décrit par Carcangiu en 1984. Son diagnostic histologique est souvent difficile et son pronostic réputé péjoratif. Mais aucun consensus thérapeutique n’est établi actuellement. Cette étude a pour but de mieux connaître l’histoire naturelle du CI et d’en dégager des facteurs pronostiques.
Méthodes. Une revue exhaustive de la littérature (554 cas publiés depuis sa description) et une méta-analyse sur données individuelles publiées de 205 patients ont été réalisées. De plus nous avons étudié une série exhaustive de 27 patients porteurs de CI, avec relecture anatomo-pathologique de chaque cas, parmi 1170 patients consécutifs traités pour cancer de la thyroïde d’origine folliculaire à l’Institut Bergonié sur la période de 1953 à 2003. Analyses de survies comparées par test du logrank.
Résultats. Le CI représente environ 4 % des cancers de la thyroïde. L’âge moyen au diagnostic est de 52,15 ans, avec une nette prédominance féminine. La présentation clinique se fait souvent à un stade avancé avec une extension extrathyroïdienne dans 56,3 % des cas et des métastases à distance dans 34,6 % des cas. Il existe généralement une bonne fixation de l’I131 qui reste un traitement de choix. Son comportement évolutif est commun aux carcinomes papillaires et folliculaires avec une tendance à l’extension à la fois ganglionnaire et à distance, notamment au niveau de sites rares. La survie globale de 61,2 % à 10 ans est intermédiaire entre les carcinomes bien différenciés et les carcinomes anaplasiques mais l’âge de plus de 40 ans, l’extension extrathyroïdienne et le stade M1 semblent être les principaux facteurs de mauvais pronostic.
Conclusion. Cette étude confirme le comportement agressif du CI, nécessitant une approche thérapeutique chirurgicale efficace dès le diagnostic. Mais d’autres études sont encore nécessaires pour identifier des facteurs pronostiques spécifiques et la place d’autres moyens thérapeutiques comme la radiothérapie externe ou la chimiothérapie.

Chirurgie

n 105

Carcinose péritonéale : résultats préliminaires

Berkane S, Bennani A, Abid L

Service de chirurgie viscérale, Hôpital de Bologhine, Alger.

La carcinose péritonéale est un tournant très péjoratif dans la maladie cancéreuse. Sa prise en charge a néanmoins bénéficié depuis une vingtaine d’années d’une nouvelle approche thérapeutique combinant la chirurgie d’exérèse et la chimiothérapie intrapéritonéale ou systémique. Matériel et méthode. Nous avons adopté une attitude thérapeutique mixte de prise en charge des carcinoses péritonéales d’origine diverse combinant une chirurgie d’exérèse la plus complète possible et une chimiothérapie intrapéritonéale immédiate ou systémique.
Résultats. De mai 1999 à décembre 2003, 21 patients sur 100 avec une carcinose péritonéale ont bénéficié de cette approche thérapeutique. Ils se répartissent en 20 femmes et 1 homme, d’un âge moyen de 45 ans. Les cancers en cause sont par ordre décroissant 6 cancers vésiculaires, 4 cancers de l’ovaire, 3 cancers colorectaux, 2 léiomyosarcomes, 1 cancer duodénal, 1 cancer gastrique et 1 cancer d’origine indéterminée. La prise en charge thérapeutique a consisté en une chirurgie d’exérèse R0 chez 6 patients suivie d’une chimiothérapie intrapéritonéale immédiate. Une chimiothérapie néoadjuvante intrapéritonéale et systémique suivie d’une chirurgie d’exérèse secondaire chez 8 patients. Chez 4 patients la chimiothérapie intrapéritonéale a fait suite à une chirurgie d’exérèse incomplète. Nous déplorons une mortalité et une morbidité postopératoires respectives de 22 % et 39 %. La survie à 12, 24 et 33 mois est de 44, 16 et 11 %.
Conclusion. Cette approche thérapeutique nous semble une voie prometteuse pour certains patients sélectionnés (jeunes, non tarés et avec une maladie résécable d’emblée ou secondairement).

n 106

Lymphadénectomie extensive dans la chirurgie radicale du cancer de la vésicule biliaire : fréquence, sites et significations

Berkane S, Ali Benamara F, Bennani A, Taieb F, Abid L

Service de chirurgie viscérale, Hôpital de Bologhine, Alger.

Le cancer vésiculaire est très lymphophile et la place de la lymphadénectomie reste très controversée dans la littérature.
Matériel et méthode. Cette étude s’intéresse à tous les patients ayant bénéficié dans le cadre d’une chirurgie radicale du cancer vésiculaire d’une lymphadénectomie extensive définie par une exérèse de toutes les structures lymphoganglionnaires du pédicule hépatique (N1), de la région rétroduodénopancréatique, de l’artère hépatique commune (N2), du tronc cœliaque et de la région interaorticocave (N3). Nous avons étudié la fréquence de l’infiltration ganglionnaire et le devenir des patients selon la présence ou non d’une atteinte ganglionnaire.
Résultats
. Sur un total de 70 patients ayant une étude histologique des ganglions réséqués, 35 patients ont bénéficié d’une lymphadénectomie extensive telle que définie dans le protocole. Globalement, 50 % des patients ont une atteinte ganglionnaire. Une infiltration des niveaux N1, N2 et N3 est respectivement de 55 %, 35 % et 19 %. Nous notons une survie à 24, 36, 48 et 60 mois chez respectivement 5, 2, 4 et 1 patiente avec atteinte ganglionnaire. Deux patients avec une infiltration ganglionnaire en interaorticocave sont en vie à 48 mois et 60 mois.
Conclusion. Une atteinte ganglionnaire même à distance (N2 et N3) n’est pas pour nous une contre-indication à l’exérèse, mais au contraire une résection à visée curative est à réaliser chaque fois que la tumeur est résécable et le patient apte à supporter le geste chirurgical.

n 107

Contrôle de qualité en chirurgie cervicofaciale, arguments pour un nouveau management des structures de santé et du circuit patient

Dolivet G1, Verhaeghe JL1, Rauch P1, Marchal F1, Montange F1, Michel V1, Louviot I1, Largeron O1, Meistelman C1, Lefebvre JL2, Guilemin F1

1 Centre Alexis Vautrin, Vandœuvre-lès-Nancy ;
2
 Centre Oscar Lambret, Lille.

L’assurance qualité dans la chirurgie oncologique cervicofaciale ne peut pas actuellement être considérée comme implementée au même titre que dans la chirurgie oncologique en général. Il existe actuellement une nécessité absolue d’améliorer le contrôle de qualité dans ce domaine pour en évaluer l’efficacité et pour éviter toute interprétation erronée sur l’efficacité des traitements adjuvants ou associés. Méthodes. De plus en plus de patients sont soumis à des procédures complexes en cancérologie cervicofaciale depuis le diagnostic jusqu’au suivi incluant des traitements spécifiques et soins périthérapeutiques. Les publications dans le domaine du contrôle de qualité, dans tous les domaines de la chirurgie oncologique, ont été comparées à notre propre méthode de management des patients en chirurgie oncologique cervicofaciale que ce soit pour les traitements spécifiques ou pour les soins périthérapeutiques.
Résultats. Il n’y a pas de standard de l’assurance qualité en chirurgie oncologique actuellement, mais certains points cruciaux peuvent être “ identifiés ” et appliqués à la chirurgie oncologique cervicofaciale : détermination la plus exacte possible avec les technologies les plus avancées de l’extension tumorale, protocoles de traitements appropriés basés sur des preuves scientifiques, comité de décision de traitement multidisciplinaire (chirurgien, radiothérapeute, oncologue, anatomopathologiste, radiologue, anesthésiste, chirurgien dentiste, orthophoniste, infirmière), prise en charge en centres de traitement globlal du cancer ou centre hospitalier universitaire, résections complètes des tumeurs et des ganglions confirmées par un pathologiste entraîné, chirurgien spécialisé et entraîné (éventuellement évalués par un audit), indicateurs du respect du protocole de traitement planifié et prise en charge périthérapeutique multidisciplinaire coordonnée semblent être obligatoires pour obtenir une bonne qualité de prise en charge.
Conclusion. La qualité du management des tumeurs de la tête et du cou impliquent des procédures précises et des protocoles globaux depuis le début jusqu’à la fin de la prise en charge de la maladie. Un management transverse par une équipe multidisciplinaire entraînée dans une structure de prise en charge globale du cancer semble être plus approprié, cette organisation étant basée sur des unités fonctionnelles coordonnées. Cette tendance s’affirme actuellement du fait de la complexité des traitements combinés, de l’intrication des pathologies associées, la nécessité de compétences hautement spécialisées et d’arguments économiques.

n 108

L’adrénaline comme alternative à l’hyperthermie dans le traitement local par cisplatine des carcinoses péritonéales d’origine colique (étude expérimentale chez le rat)

Gouy S1, Benoit L2, 3, Rat P2, Chauffert B1, 3

1 Centre G.F. Leclerc, 1, rue du Pr Marion, 21000 Dijon ;
2 Service de Chirurgie Digestive, Thoracique et Cancérologique, Hôpital du Bocage, 2, bd Maréchal de Lattre de Tassigny, 21000 Dijon ;
3
 Unité Inserm 517, Faculté de Médecine, 21000 Dijon.

En clinique l’hyperthermie permet d’augmenter l’efficacité de la chimiothérapie intrapéritonéale alors qu’expérimentalement l’adrénaline administrée localement aurait les mêmes propriétés.
Nous avons comparé chez le rat BDIX, porteurs de carcinoses péritonéales classées IIIC, l’efficacité de ces deux stratégies sur la pénétration intratumorale et la distribution dans l’organisme du cisplatine (CDDP) administré en intrapéritonéal (IP). Deux groupes de rats ont reçu, en IP, à « ventre fermé » du CDDP (10 mg/kg) avec ou sans adrénaline (10 mg/ml) pendant 2 heures. Quatre autres groupes ont été traités à « ventre ouvert » à 37° ou à 42° avec ou sans adrénaline pendant 1 heure. A ventre fermé, les concentrations intratumorales en platine étaient significativement augmentées en présence d’adrénaline. A ventre ouvert et à 37 °C, l’adrénaline augmentait également de façon significative les concentrations intratumorales en antimitotique par rapport aux groupes traités sans adrénaline. L’hyperthermie seule, comparée aux autres modalités d’administrations (ventre fermé ou ventre ouvert à 37 °C), permettait d’accroître significativement la diffusion du CDDP dans les nodules tumoraux. Il n’existait aucune différence statistique entre les résultats obtenus après traitement à 37 °C en présence d’adrénaline et ceux obtenus en hyperthermie sans adrénaline sur la pénétration intratumorale du CDDP. Adrénaline et hyperthermie n’étaient pas synergiques. Le passage tissulaire du CDDP au niveau de l’organisme était constamment diminué en présence d’adrénaline aussi bien pour les rats traités à ventre fermé qu’à ventre ouvert. Quelle que soit la température du dialysat, en présence d’adrénaline, les concentrations rénales en platine, étaient 6 à 7 fois moins importantes.
L’adrénaline IP pourrait constituer une alternative thérapeutique comparable à l’hyperthermie dans la prise en charge des carcinoses péritonéales avec un passage systémique moindre de l’agent anticancéreux et une utilisation moins complexe

n 109

Risques d’envahissement ganglionnaire axillaire des cancers du sein 1 cm : 318 cas

Le Bouëdec G, Kwiatkowski F, Dalle C, de Latour M, Feillel V, Dauplat J

Centre Jean Perrin, 58 rue Montalembert, BP 392, 63011 Clermont-Ferrand Cedex 1

Àl’heure de l’engouement pour le ganglion sentinelle, nous rapportons notre expérience du curage axillaire classique dans les cancers ≤ 1 cm mettant l’accent sur les facteurs prédictifs d’envahissement.
Matériel et méthodes. Travail rétrospectif (1985-2003) sur 318 dossiers cliniques et anatomo-pathologiques de carcinomes mammaires infiltrants ≤ 10 mm (pT1a et pT1b) avec curage axillaire conventionnel lors de la chirurgie première. Paramètres considérés : âge, caractère palpable ou non de la lésion, taille macroscopique de l’élément infiltrant, type histologique et grade SBR, emboles néoplasiques lymphatiques ou vasculaires péritumoraux, teneur en récepteurs aux estrogènes (RO) et à la progestérone (RP), nombre de ganglions prélevés et envahis (N+). L’analyse statistique univariée (test du chi2 pour les variables qualitatives et test h ou t de Student pour les variables quantitatives) a permis d’identifier les paramètres associés au N+ axillaire, ou associés entre eux, avec calcul des risques relatifs (RR) et du risque d’erreur (p).
Résultats. L’âge moyen était de 57 ans (32-81) ; 81 % des cancers étaient impalpables ; la taille tumorale était 72 fois ≤ 5 mm (23 % de pT1a), 246 fois entre 6 et 10 mm (77 % de pT1b) en moyenne de 7,6 mm. Les formes histologiques étaient : 86 % de carcinomes canalaires invasifs (CCI), 11 % de carcinomes lobulaires infiltrants (CLI) et 3 % de mixtes ou mucineux. Parmi les 275 CCI, on distinguait 71 % de grade I, 24 % de grade II et 5 % de grade III. Le nombre moyen de ganglions prélevés était de 12 (5-27). Le taux de N+ global était de 15 % (49/318) : 4 % (3/72) pour la catégorie pT1a, 19 % (46/246) pour la catégorie pT1b. Le taux de N+ des « méga T1b » – mesurant exactement 10 mm – était de 26 % (30/116) : 65 % (15/23) pour les centimétriques avec emboles versus 16 % (15/93) pour les centimétriques sans emboles. En analyse univariée, trois paramètres affichaient un lien significatif avec le statut N+ : le caractère palpable (p = 0,018 ; RR = 1,9 [1,1 ; 3,4]), la taille tumorale (p = 0,00011 ; RR = 2,8 [1,7 ; 4,6] pour un diamètre = 10 mm), les emboles péritumoraux (p < 0,0001 ; RR = 4,2 [2,6 ; 6,8]). En analyse multivariée, le caractère palpable perd sa significativité car corrélé avec la taille. Seules les emboles (OR = 6,7 [3,2 ; 13,6]) et la taille > 9 mm (OR = 2,9 [1,5 ; 5,7]) demeurent significativement liés au statut N+. La notion d’emboles néoplasiques péritumoraux pourrait représenter une contre-indication à l’adénectomie sentinelle exclusive.

n 110

Limites de l’ablathermie par radiofréquence peropératoire des métastases hépatiques

Evrard S, Fonck M, Becouarn Y, Brunet R, Larrue C

Groupe des Tumeurs Digestives, Institut Bergonié, 229 cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Combinée avec la résection parenchymateuse, l’ablathermie par radiofréquence (ARF) serait à même d’augmenter le taux de résécabilité des métastases hépatiques. Les limites critiques de la technique sont toutefois mal connues. Le but de ce travail était de préciser ces limites, techniques ou stratégiques, relativement aux complications induites et au taux de récidive locale.
Patients et méthode. De mai 2000 à septembre 2003, 74 patients ont été opérés de métastases hépatiques colorectales (37) ou non colorectales (37) dont 48 par radiofréquence seule ou combinée avec une ou plusieurs résections parenchymateuses. L’ARF était réalisée par aiguilles perfusées (30 à 130 ml/h), alimentées par un générateur monopolaire à 375 khz de puissance variable (5 à 60 W) (BerchtoldTM) guidée par échovidéoscopie (B,KTM). Un scanner était réalisé à deux mois puis tous les quatre mois. Le suivi prospectif était réalisé sur une base MedlogTM et dans le cadre du Stic Quasar. Les lésions juxtavasculaires faisaient appel aux techniques de clampage pédiculaire et éventuellement cave. Une réfrigération des voies biliaires était instaurée pour les lésions juxtapédiculaires.
Résultats. 129 lésions ont été traitées par ARF. La taille médiane était de 11 mm avec des extrêmes allant de 3 à 50. La durée médiane de courant était de 9 min par lésion (extrêmes 2 à 68 min).
Deux patients sont décédés. L’un de 38 ans des suites compliquées d’un ulcère gastrique perforé après une 4e ligne de traitement par ARF (2 opératoires, 2 percutanées) de métastases d’un sarcome ; l’autre de 79 ans à J8 dans un tableau d’insuffisance hépatocellulaire et rénale avec écho-doppler hépatique normal. Cinq autres patients ont présenté une complication relative à l’ARF : deux abcès, une thrombose de la branche portale droite en laparoscopie, une dilatation de la voie biliaire gauche, un épanchement pleural. Deux patients ont présenté une récidive locale à 2 mois des lésions traitées. Conclusions. 1) Au-delà de 35 mm, le risque d’insuffisance de traitement local n’augmente pas mais le temps de courant atteint une heure et le risque d’abcédation de la nécrose est important, surtout en cas de gestes septiques associés, lesquels doivent être proscrits. La résection parenchymateuse doit alors être préférée si elle est possible. 2) La localisation juxtavasculaire est une excellente indication en association avec une exclusion vasculaire. Le risque de rupture vasculaire, bien qu’insuffisamment documenté, paraît faible. 3) La toxicité biliaire du traitement des lésions juxtapédiculaires est un facteur limitant et ce malgré le recours à la réfrigération des voies biliaires.

n 111

Lésions frontières mammaires diagnostiquées par macrobiopsies : qu’en faire ? À propos d’une série de 104 patientes opérées

Chauvet MP1, Uzan R2, Baranzelli MC3, Giard S1, Ceugnart L2, Belkacémi Y4, Bonneterre J1

1 Département de sénologie,
2
 Département d’imagerie médicale,
3
 Département des laboratoires,
4 Département de radiothérapie, Centre Oscar Lambret, 3, rue Frédéric Combemale, BP307, 59020 Lille Cedex.

Les lésions mammaires dites frontières (hyperplasie canalaire atypique et néoplasie lobulaire) posent actuellement différents problèmes non résolus : de définition, de valeur pronostique et donc de prise en charge. Le but de ce travail était d’étudier les caractéristiques de ces lésions diagnostiquées par macrobiopsies.
Entre février 2000 et octobre 2003, 1 295 macrobiopsies pour microcalcifications (dont 85 % classées ACR 4) ont été réalisées au centre Oscar Lambret. Deux cent trente lésions (17,7 %) dites frontières ont été diagnostiquées et 104 patientes ont été opérées secondairement. Les lésions sur macrobiopsies se répartissaient en 84 hyperplasies canalaires atypiques (HCA) (81 %), 17 néoplasies lobulaires (NLOB) (16 %) et 3 lésions de type CAPSS avec atypies (3 %). Le taux de sous-estimation global (correspondant à la découverte de lésions au minimum de type carcinome intracanalaire (CIC) de grade 1 sur la pièce opératoire) est de 21 % (19 cas pour l’HCA, soit 22,6 %, et 3 cas pour les NLOB, soit 17,6 %). Ces taux sont superposables à ceux décrits dans la littérature de l’ordre de 19 %. Dans tous les cas, la cicatrice histologique de la macrobiopsie a été retrouvée. Les cas d’HCA sous-estimées correspondaient dans 7 cas à des lésions de CIC de grade 1, dans 9 cas à un CIC de grade 2, dans 2 cas à un CIC de grade 3 et dans 1 cas à des lésions invasives. Nous n’avons retrouvé aucun facteur prédictif de sous-estimation : antécédents familiaux (p = 0,26), exérèse complète ou partielle des microcalcifications par macrobiopsie (p = 0,43), taille du foyer de microcalcifications (p = 0,37), caractère débutant ou au contraire marqué des atypies (p = 0,48).
En conclusion, avec un taux de sous-estimation de l’ordre de 20 % sans facteur prédictif évident, la prudence voudrait que toute lésion frontière diagnostiquée par macrobiopsie soit reprise chirurgicalement de manière systématique.

n 112

Traitement conservateur du cancer du sein après chimiothérapie neoadjuvante

Bendib A1, Hadddam N1, Samy S2, Feghir R2

1 Service de Sénologie,
2
Service d’Oncologie médicale, centre Pierre et Marie Curie Alger, Algérie

Du 1er janvier 1999 au 31 décembre 2003, soit sur une période de 5 ans, 205 patientes sur 3 000 (6,8 %) présentant un cancer du sein ont bénéficié d’une chimiothérapie néoadjuvante. L’âge moyen était de 44,7 ans (23-77 ans). La période moyenne d’évolution était de 10,2 mois (1-72 mois). La taille clinique moyenne était de 6 cm (3-18 cm). Ces tumeurs ont été classées cliniquement T1 dans 3 cas (1,5 %), T2 dans 64 cas (31,5 %), T3 dans 26 cas (12,8 %), T4 dans 110 cas (54,2 %). Le statut axillaire était classé N0 dans 26 cas (12,8 %), N1 dans 139 cas (68,5 %), N2 dans 38 cas (18,7 %). La stadification a retrouvé 15 stades IIA (7,4 %), 35 stades IIB (17,2 %), 22 stades IIIA (10,8 %), 131 stades IIIB (64,5 %). 159 patientes (77,9 %) ont bénéficié d’un protocole FAC, 24 (11,8 %) d’un protocole TAC et 21 (10,3 %) d’un protocole CMF, sans complications majeures. Toutes ces patientes ont été opérées après 4 cures (C4) dans 18 cas (8,8 %), après C5 et C6 dans 151 cas (73,6 %) et après C7 à C12 dans 36 cas (17,6 %). Toutes les patientes ont été opérées. 178 patientes (86,8 %) ont bénéficié d’un traitement radical et 27 (13,2 %) d’un traitement conservateur, 22 (10,7 %) ont bénéficié d’une biopsie du ganglion sentinelle au bleu patent, suivie dans tous les cas d’un curage axillaire. La réponse thérapeutique a été de 69,9 % (125/205) sur le sein avec une réponse histologique totale dans 10 cas (8 %), un reliquat microscopique dans 8 cas (6,4 %) et un reliquat macroscopique entre 2 et 30 mm dans 107 cas (85,6 %). La réponse thérapeutique sur les ganglions axillaires a été de 60 cas sur 177 (33,9 %). Les patientes qui ont bénéficié d’un traitement radical avaient un envahissement ganglionnaire dans 139 cas sur 173 (80,3 %). Dans 89 cas sur 139 (66,4 %), cet envahissement ganglionnaire était supérieur à 3. Les patientes qui ont bénéficié d’un traitement conservateur avaient un envahissement ganglionnaire dans 18 cas sur 26 (69,2 %). Cet envahissement ganglionnaire était supérieur à 3 dans 9 cas sur 18 (50 %). Au total 65 patientes sur 205 (31,7 %) ont pu bénéficier grâce à la chimiothérapie néoadjuvante soit d’un traitement conservateur, dans 27 cas (41,5 %), soit d’un curage axillaire dans 38 cas de N2 (58,5 %). Le traitement conservateur a été possible dans 11 cas sur 24 après TAC (45,8 %) et après FAC dans 16 cas sur 159 (10 %).

n 113

Cancer du sein chez l’homme (à propos de 150 cas)

Bendib A, Bouaddou M, Kouchkar A

Service de sénologie, Centre Pierre et Marie Curie Alger, Algérie

De 1977 à 2002, soit sur une période de 26 années, 150 cancers du sein ont été traités. Le diagnostic a été établi cytologiquement dans 11 cas (7,3 %) et histologiquement dans 139 cas (92,7 %). Les patients étaient âgés entre 22 et 93 ans avec un âge moyen de 63,8 ans. 21 patients (14 %) présentaient une gynécomastie et 1 patient présentait un syndrome de Klinefelter. La période d’évolution variait entre 1 et 72 mois avec une moyenne de 7,8 mois. La taille clinique de la tumeur oscillait entre 1 et 15 cm avec une moyenne de 4,9 cm. La classification a retrouvé 15 stades X (10 %), 1 stade I (0,7 %), 11 stades IIA (7,3 %), 11 stades IIB (7,3 %), 8 stades IIIA (5,3 %), 86 stades IIIB (57,3 %) et 18 stades IV (12 %). 139 patients ont bénéficié d’un examen anatomopathologique qui a révélé 3 carcinomes intracanalaires (2,1 %), 119 carcinomes canalaires infiltrants (85,6 %) et 17 formes particulières (12,2 %). 114 mastectomies avec curage axillaire ont été réalisées. La taille histologique de la tumeur se situait entre 0 et 11 cm avec une moyenne de 3,1 cm. Le curage axillaire a ramené une moyenne de 14,5 ganglions. Ils étaient N- dans 31 cas sur 103 (30 %). L’envahissement ganglionnaire était = 3 dans 39 cas sur 103 (37,9 %) et > 3 dans 33 cas (32 %). Le grading de SBR a été précisé pour 16 patients. Dans 2 cas (12,5 %) il était de grade I, dans 13 cas (81,3 %) de grade II et dans 1 cas (6,2 %) de grade III. Les récepteurs hormonaux étaient RE+ RP+ dans 21 cas sur 28 (75 %), RE+ RP– dans 4 cas (14,3 %), RE– RP+ dans 1 cas (3,6 %) et RE– RP– dans 2 cas (7,1 %). La recherche de la surexpression de HER2 a été négative chez les 28 malades qui en ont bénéficié. 50 patients sur 114 (43,8 %) ont reçu une radiothérapie complémentaire et une chimiothérapie de type FAC, 62 patients sur 114 (54,4 %) ont bénéficié d’une hormonothérapie de type tamoxifène. La survie à 5 ans pour la première série de 100 malades de 1977 à 1994 est de 42,5 %. Elle est de 69 % pour la deuxième série de malades qui va de 1995 à 2002.
En conclusion le cancer du sein chez l’homme est très rare (< 1 %). Il survient 15 ans plus tard que le cancer de la femme avec des formes moins évoluées, plus souvent hormonodépendantes, ne surexprimant pas HER2. Son pronostic reste cependant plus réservé.

n 114

Étude du ganglion sentinelle dans le mélanome malin cutané

Marchal F

Département de chirurgie, Centre Alexis Vautrin, av. de Bourgogne, Vandœuvre-les-Nancy.

L’incidence du mélanome malin ne cesse de croître en France. Dans 80 % des cas, la maladie est diagnostiquée au stade 1 ou 2. En France, les curages ganglionnaires ne sont réalisées que de nécessité alors qu’aux Etats-Unis, la recherche du ganglion sentinelle est considérée comme un standard.
Buts de l’étude. Le but de cette étude était d’évaluer l’apport de la technique de détection du ganglion sentinelle (GS) par lymphoscintigraphie préopératoire et injection de bleu patenté dans la prise en charge des patients présentant un mélanome malin cutané (MM).
Matériel et méthodes. 63 patients porteurs de MM de stade 1 ont été opérés entre mars 1999 et janvier 2003. La recherche du GS a fait appel à une lymphoscintigraphie réalisée la veille de l’intervention et à une injection de bleu patenté peropératoire. Tous les ganglions hyperfixants et/ou colorés ont été prélevés et examinés en histologie standard et en immunohistochimie.
Résultats. L’étude a concerné 31 hommes et 32 femmes. Les lésions étaient réparties de la façon suivante : membre supérieur (9), membre inférieur (24), tronc (19), tête et cou (11). Le taux d’identification du GS a été de 98 %. Un site de drainage inhabituel a été constaté dans 13 % des cas. Le nombre moyen de ganglions prélevés a été de 3,6 [0-15]. La sensibilité de la méthode a été de 87,5 %, la valeur prédictive négative de 96 %. Une atteinte ganglionnaire histologique a été trouvée chez 14 patients (22 %), neuf fois sous forme de micrométastases. Le taux de faux négatifs a été de 12,5 % avec un recul médian de 14 mois.
Conclusion
. La lymphoscintigraphie avec imagerie préopératoire et détection peropératoire par sonde, combinée à une injection de bleu patenté paraît être une technique fiable pour individualiser le premier relais ganglionnaire de drainage d’un MM.

n 115

Étude des ganglions sentinelle pelviens dans les cancers précoces du col utérin

Samouëlian V1, Baranzelli MC1, Lambaudie E2, Cabaret V1, Narducci F2, Leblanc E2

Centre Oscar Lambret, 3 rue Frédéric Combemale, BP307, 59020 Lille Cedex,
1
 Laboratoire d’Anatomopathologie,
2 Département de Gynécologique.

Le statut ganglionnaire est un facteur pronostique essentiel dans les cancers du col utérin (CCU). La stadification chirurgicale est pronostique, orientant le traitement ultérieur. L’étude des ganglions sentinelle (GS) permettrait d’augmenter la précision de l’examen extemporané limité à l’étude d’un ou deux ganglions et de réduire la morbidité opératoire en limitant les indications de curages aortiques aux seules patientes ayant des GS positifs.
Matériel et méthodes. Entre avril 2001 et octobre 2003, 26 patientes avec un CCU de stade IA2-IB1 ont bénéficié d’une étude du GS (repérage combiné isotopique et bleu patenté) avec examen extemporané. En cas de positivité, un CLA était immédiatement effectué. Dans cette étude prospective, le GS était systématiquement complété par un CGP. En microscopie définitive, les GS étaient tranchés (2 à 3 mm d’épaisseur) puis inclus en cassettes individuelles. Trois coupes sériées à 300 µm d’intervalle, colorées à l’hématoxyline-éosine, étaient réalisées. En cas de négativité de cet examen standard, une étude immunohistochimique sur 3 coupes sériées par les pancytokératines de haut poids moléculaire (KL1) était réalisée.
Résultats
. Dans cette série nous avons colligé 26 patientes dont 7 étaient pN1 (26,9 %). Parmi ces 7 patientes : 4 patientes présentaient des GS bilatéraux, une patiente un GS médian et deux patientes des GS unilatéraux. Le nombre des GS variait entre 1 et 4 (moyenne de 2 GS par patiente). L’examen extemporané était positif chez 3 patientes. Il n’a pas été réalisé dans un cas. A l’examen histopathologique définitif, 6 patientes avaient un GS positif (3 positifs, 2 faux négatifs en extemporané et 1 GS non examiné en extemporané). Les curages pelviens complets étaient positifs chez seulement 2 patientes dont une avait une micrométastase (1,5 mm) dans un GS et l’autre un GS médian négatif. Au total, parmi les 7 patientes pN1, 5 n’avaient qu’un envahissement ganglionnaire sentinelle.
Conclusion. Chez plus de 50 % des patientes pN1, seuls les GS sont positifs. L’examen extemporané est en défaut chez 2 patientes sur 5, mais il n’y a pas de faux positif. Nous proposons donc d’adopter l’attitude suivante : si GS pelvien positif, pas de curage pelvien, CLA dans le même temps ; si GS pelvien négatif, CGP et, si positif, évaluation lombo-aortique dans un deuxième temps

n 116

Place de la chimio-hyperthermie avec cytoréduction dans le traitement du cancer de l’ovaire récidivé : résultats d’une étude clinique de phase II

Bereber JM1, Bernard JL1, Perus O2, Bouregba M2, De La Chapelle A2, Benchimol D1, Bourgeon A1

1 Service de chirurgie générale et de cancérologie digestive,
2 Département d’anesthésiologie et de réanimation, Hôpital de l’Archet 2, 151, route de Saint Antoine de Ginestière, 06202 Nice.

Le traitement optimal des récidives péritonéales du cancer de l’ovaire n’est pas bien établi avec des réponses faibles aux chimiothérapies de deuxième ligne ou plus. Dans ce contexte, nous avons proposé une étude clinique de phase II associant une cytoréduction à une chimiohyperthermie peropératoire (CHIP) prolongée ou non d’une chimiothérapie intrapéritonéale postopératoire(CIPPI). 21 patientes ont été incluses d’avril 2001 à décembre 2002, l’âge moyen était de 57,8 ans, la durée d’évolution avant chimiohyperthermie était de 38,2 mois, les patientes avaient reçu en moyenne 3,1 lignes de chimiothérapie et échappaient à tout traitement systémique. 22 chimiohyperthermies ont été réalisées pour 21 patientes. L’intervention a consisté en une cytoréduction la plus radicale possible associée à une chimiohyperthermie intrapéritonéale avec cisplatine à la dose de 50 mg/m2, doxorubicine à la dose de 15 mg/m2 ; la solution est portée à 42 °C ; la procédure de chimiohyperthermie est réalisée à ventre ouvert. La durée moyenne a été de 9 h 30 (420-720 minutes). L’index de carcinose médian était de 13. La réduction a pu être considérée complète dans tous les cas au prix d’une exérèse large associant des reconstructions digestives protégées par une iléostomie (21/22). Six patientes ont eu une chimiothérapie intrapéritonéale postopératoire J1 à J5 (docetaxel à la dose de 20 mg/m2/j).
Les suites opératoires ont été marquées par une mortalité nulle et une morbidité de 36 % (2 fistules digestives, 2 thrombopénies, 1 hémorragie postopératoire). La durée d’hospitalisation a été de 18,7 jours. 20/21 stomies ont été fermées. 9 patientes ont eu un deuxième look avec 3 récidives résécables. Le délai moyen de suivi était de 21 mois, la survie cumulée à un an était de 55 % ; 3 patientes sont décédées de récidive avec un délai moyen de 8,3 mois.
La chimiohyperthermie dans le cancer de l’ovaire récidivée est une méthode faisable standardisée et reproductible. La morbidité est acceptable avec un confort de vie amélioré à partir du troisième mois. Des études contrôlées incluant les patientes échappant à une première ligne de chimiothérapie et les seconds looks positifs sont nécessaires pour déterminer la place de la méthode.

n 117

Place de la chirurgie d’exérèse large des récidives locales de cancer de l’endomètre

Houvenaeghel G, Butarelli M, Gonzague L, Ronda I, Martino M, Delpero JR.

Institut Paoli-Calmettes, 232 bd Sainte-Marguerite, 13009 Marseille.

Les cancers de l’endomètre, fréquemment diagnostiqués à un stade de début, sont de bon pronostic. La survenue de récidives se manifeste dans la majorité des cas sur un mode métastatique. Cependant, des récidives locales, en majorité vaginales, s’observent dans 5 à 15 % des cas en fonction du stade et du traitement postopératoire. Les récidives vaginales sont habituellement accessibles à un traitement par les agents physiques avec des résultats de survie de plus de 70 % à 8 ans. Les indications de résection chirurgicale sont donc peu fréquentes. Le but de cette étude est de rapporter notre expérience d’exentérations pelviennes (EP) pour récidive de cancer de l’endomètre et les données de la littérature.
De janvier 1980 à décembre 2003, 21 EP ont été réalisées pour une récidive locorégionale de cancer de l’endomètre, parmi 232 EP pour cancer gynécologique (9 %) : il s’agissait 2 fois d’une deuxième récidive. L’âge moyen des patientes était de 61,7 ans (médiane 65). Le type d’EP était de type I (supralévatorienne) 20 fois : 7 EP antérieures, 7 postérieures, 6 totales et 1 atypique. Une anastomose colorectale a été réalisée 11 fois parmi les 13 EP postérieures ou totales de type I, 7 fois protégée par une stomie temporaire. Une dérivation urinaire a été réalisée 13 fois. Une curiethérapie avait été réalisée 10 fois et une radiothérapie 10 fois lors du traitement initial. Le délai entre le diagnostic initial et l’EP a été de 25 mois en moyenne (médiane 22, E 8-60).
Les suites opératoires ont été compliquées 10 fois et la durée d’hospitalisation a été de 33 jours en moyenne (médiane 28, E 10-107). L’exérèse a pu être réalisée à visée curative 10 fois (limites d’exérèse saines et absence de carcinose) : 8 fois parmi 12 récidives centropelviennes et 2 fois parmi 9 récidives latéropelviennes (p = 0,056). Les survies globales et survies sans récidive à 2 et 5 ans ont été respectivement de 43,6 et 34,9 %, 36,4 et 27,3 %. Il existait une différence de survie significative entre les exérèses curatives et les autres (p = 0,0013) : 78,8 % à 5 ans versus 0 %.
En conclusion, les indications d’EP pour récidive locale de cancer de l’endomètre sont rares : 3 autres séries de la littérature comportent respectivement 20, 36 et 44 cas. Cependant, en cas de récidives locales non accessibles à une thérapeutique par les agents physiques en fonction des traitements initiaux, en cas de récidives locales plus étendues ou en cas de récidives vaginales itératives, ces interventions de rattrapage sont susceptibles d’apporter des rémissions prolongées après exérèse curative dans des cas très sélectionnés : 14 %, 23 % et 56 % dans la littérature.

n 118

Un curage axillaire est-il toujours nécessaire après le diagnostic de micrométastase des ganglions sentinelles des cancers du sein ?

Houvenaeghel G, Nos C, Classe JM, Mignotte H, Giard S, Rouanet P, Bonnier P, Dauplat J, Garbay R, Cohen M, Fraisse J, Martel P, Lorimier G, Verhage JL, et al. GCFCC (Groupe des chirurgiens de la Fédération de centre de lutte contre le cancer)

Institut Paoli-Calmettes, 232 bd de Sainte-Marguerite, 13009 Marseille.

Le ganglion sentinelle (GS) est le seul ganglion axillaire envahi chez la majorité des patientes atteintes d’un cancer du sein, en particulier en cas de micrométastase, et un curage axillaire complémentaire pourrait être évité. L’objectif de cette étude est d’identifier la fréquence de l’envahissement des ganglions non sentinelles (GNS) au curage axillaire et de déterminer les facteurs prédictifs de survenue de l’envahissement des GNS chez les patientes présentant une micrométastase.

Parmi les patientes ayant bénéficié de la technique du GS sur 16 centres, la présence d’une micrométastase a été détectée chez 694 patientes qui ont toutes subi un curage axillaire. Les critères cliniques et anatomopathologiques de la tumeur et des GS ont été étudiés et analysés afin de déterminer leur valeur prédictive de l’atteinte des GNS.

Le risque de métastase des GNS était de 13,54 % (94/694) avec un seul GNS envahi dans 66 % des cas (62/94). Les principaux facteurs prédictifs de cette atteinte étaient la taille clinique de la tumeur (p < 0,002), la présence d’emboles péritumoraux (p = 0,013), un grade SBR III (p = 0,025), le type histologique de la tumeur (p < 0,02), la découverte en histologie standard (HES) versus par immunohistochimie seule (p = 0,018), le nombre de sections des GS (2, 3, 4 versus 6) (p = 0,026). Les autres facteurs étaient non significatifs, en particulier la taille de la micrométastase et la localisation des GS. Seules les tumeurs de moins de 10 mm présentaient un faible taux d’atteinte des GNS (5,8 %, soit 10/171), en particulier en l’absence d’emboles et de grade III, représentant 24 % de l’effectif global.

En conclusion, les facteurs cliniques et anatomopathologiques permettent de prédire de manière significative le taux de GNS envahis. Le sous-groupe de patientes pour lesquelles un curage axillaire ou un autre traitement pourrait être omis reste limité (24 % de ces patientes), avec cependant un risque de 6 % environ de laisser un ganglion envahi. Dans l’attente des études randomisées en cours, la réalisation d’un traitement axillaire reste donc de mise.

n 119

Un envahissement ganglionnaire pelvien après radio-chimiothérapie concomitante dans les cancers avancés du col utérin est-il fréquent ?

Rigouard AL, Houvenaeghel G, Buttarelli M, Jacquemier J, Braud AC, Gonzague L

Institut Paoli-Calmettes, 232 bd Sainte-Marguerite, 13009 Marseille.

Le traitement standard, admis de façon consensuelle, des cancers du col utérin avancés (T1b2 à T4) est la radio-chimiothérapie concomitante associée à la curiethérapie. De façon optionnelle, une exérèse chirurgicale peut être proposée. L’objectif de cette étude est de mettre en évidence la fréquence de l’atteinte ganglionnaire pelvienne résiduelle après radio-chimiothérapie concomitante.

Matériel et méthodes. 131 patientes, d’âge moyen 47,92 ans (E 27-74) ont été incluses entre févier 1988 et décembre 2003. Les stades FIGO étaient : 19,8 % de T1 (26/131), 44,3 % de T2 (58/131), 20,6 % de T3 ((27/131) et 15,3 % de T4 (20/131). 3 patientes ont bénéficié d’un curage pelvien après radio-chimiothérapie, 110 ont bénéficié d’un curage pelvien après radio-chimiothérapie. Un curage lombo-aortique a été réalisé 99 fois : 24 fois lors d’un curage initial sous cœlioscopie.

Résultats. Le nombre moyen de ganglions prélevés a été de 11 (médiane 10) au niveau pelvien et de 7 (médiane 6) au niveau lombo-aortique. 16,4 % (18/110) des patientes présentaient un envahissement ganglionnaire pelvien après radio-chimiothérapie, dont 10 présentant 1 seul envahi. 14,1 % (14/99) présentaient un envahissement ganglionnaire lombo-aortique après radio-chimiothérapie. Une atteinte ganglionnaire pelvienne était retrouvée dans 8,8 % (5/57) des cas sans résidu ou avec un résidu tumoral microscopique du col, et dans 24,4 % (11/45) des cas en présence d’un résidu au niveau du col (p = 0,03).

Conclusion. Si le traitement chirurgical est retenu après radio-chimiothérapie concomitante, faut-il réaliser un curage pelvien ? Dans notre centre, le traitement chirurgical est réalisé de façon systématique et semble justifié : au niveau du col en tenant compte de la fréquence du reliquat tumoral (46,6 %) et du risque de récidive locorégionale, et au niveau des ganglions pelviens en tenant compte de la fréquence du reliquat ganglionnaire (16,4 %) et donc du risque de récidive latéropelvienne, cela quelle que soit l’atteinte ganglionnaire lombo-arotique.

n 120

Potentialisation du traitement par ultrasons focalisés de l’adénocarcinome prostatique par une chimiothérapie concomitante associant estramustine phosphate et paclitaxel

Paparel P1, 2, Chapelon JY2, Curiel L2, Chesnais S2, Gelet A1, 2

1 Service d’urologie et de chirurgie de la transplantation rénale et pancréatique, Hôpital Edouard Herriot, 5, Place d’Arsonval, 69437 Lyon Cedex 03 ;
2
 Inserm U 556 (Application physique des ultrasons), 151 Cours Albert Thomas, 69003 Lyon.

Objectifs de l’étude. Démontrer une synergie d’action entre les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) et une chimiothérapie associant paclitaxel et estramustine-phosphate (EMP) sur un modèle de carcinome prostatique.
Matériel et méthodes. Le modèle animal est le rat Copenhague. Le modèle tumoral est un modèle d’adénocarcinome prostatique hormono-indépendant de la lignée Dunning R 3327-AT 2. 15 jours après l’implantation sous-cutanée de la tumeur (la tumeur mesure alors 10 cc), les 41 rats de l’étude sont répartis en 4 bras : 6 témoins, 11 HIFU seuls, 12 chimiothérapie seule et 12 HIFU – chimiothérapie. La chimiothérapie est administrée pendant une semaine avec deux administrations de paclitaxel à la dose de 4 mg/kg/j et d’EMP à la dose de 15 mg/kg/j. Le traitement par HIFU se fait au milieu de la semaine avec une seule séance de tir et seul 75 % du volume tumoral est traité. Le critère d’efficacité du traitement est l’évolution du volume tumoral.
Résultats. Trois semaines après l ’administration des traitements, il existe une différence statistiquement significative entre les volumes tumoraux des différents bras de l’étude : témoins (84,07 cc), HIFU seul (38,44 cc), chimiothérapie seule (27,08 cc), HIFU – chimiothérapie (13,61 cc). L’association HIFU – chimiothérapie donne un effet synergique et non simplement un effet additionnel.
Conclusion. L’association HIFU-paclitaxel-EMP est plus efficace qu’un traitement par HIFU seul ou par paclitaxel-EMP seul sur la croissance des tumeurs Dunning dès les premières semaines de traitement.

n 121

Valeur de la recoupe du lit tumoral dans la chirurgie du cancer du sein

Ben Dhiab T, Bouzid T, Gamoudi A, Ben Hassouna J, Khomsi F, Makhlouf R, Boussen H, Benna F, Hechiche M, Rahal K

Institut Salah Azaiz, Bab Saadoun 1006, Tunis, Tunisie.

Le traitement conservateur du cancer du sein représente le standard pour les stades précoces. Ce protocole thérapeutique doit associer la sécurité carcinologique et le bénéfice cosmétique. La préoccupation majeure étant l’état des marges d’exérèses. Le but de notre travail est d’évaluer l’intérêt de la recoupe systématique du lit tumoral dans la détermination des marges d’exérèses et de l’appréciation de l’état du reste de la glande.
De ce fait, nous avons réalisé une étude rétrospective portant sur 164 patientes traitées à l’institut Salah Azaïz de 1988 à 1995 pour cancer du sein à des stades T1-T2 en vue d’une conservation mammaire. Ces patientes ont été soumises après tumorectomie à une recoupe systématique du lit tumoral, l’état de la recoupe était primordial pour la décision de conservation. Une recoupe envahie faisait considérer la tumeur comme multifocale et de ce fait une mammectomie était prônée. La fréquence du traitement conservateur était de 5 % par rapport à tous les cancers du sein traités pendant la même période. Il s’agissait d’un protocole thérapeutique réservé plutôt aux femmes jeunes, 85 % sont âgées de moins de 50 ans. La taille tumorale moyenne était de 25 mm. Dans notre série, la recoupe du lit tumoral était saine dans 75 % des cas, siège d’un carcinome in situ dans 18 % des cas et d’un carcinome infiltrant dans 7 % des cas. Une mammectomie complémentaire a été pratiquée pour 32 patientes, l’examen histologique a mis en évidence un reliquat, infiltrant dans 9 cas in situ dans 6 cas et dans un cas une maladie de Paget. La recoupe a renseigné sur l’état du reste du sein dans la moitié des cas.
L’évolution a été marquée par l’apparition d’une récidive locale dans 9 % des cas et par la dissémination de la maladie dans 26 % des cas. La survie globale à 5 ans était de 76 % et le facteur pronostique majeur était l’envahissement ganglionnaire.

n 122

Cryochirurgie trans-pleuro-diaphragmatique, intérêt dans le traitement des métastases hépatiques colorectales itératives ou non résécables

Stella M1, Mithieux F1, Meeus P1, Kaemmerlen P2, Rivoire M1

1 Service de chirurgie digestive et oncologique ;
2 Service de radiologie, Centre anticancéreux Léon Bérard, 28 rue Laennec, 69373 Lyon Cedex 08.

La résection hépatique est le gold standard dans le traitement des métastases hépatiques colorectales. Les hépatectomies itératives représentent une augmentation des difficultés techniques et du risque opératoire en raison des modifications de l’anatomie hépatique, de la diminution du volume restant et des adhérences. La voie d’abord abdominale itérative ne permet pas un accès simple pour traiter les métastases qui se trouvent au niveau du dôme hépatique (segments 4, 7 et 8), au contact de la veine cave inférieure, des veines sus-hépatiques ou du diaphragme. La cryochirurgie permet une destruction focalisée des tumeurs hépatiques non résécables. Une voie d’abord transthoracique a donc été utilisée.
Entre septembre 1999 et septembre 2003, dix patients avec des métastases hépatiques colorectales, itératives et non résécables ont été traités par cryochirurgie trans-pleuro-diaphragmatique par une mini-thoracotomie antérieure droite dans le 8e espace intercostal. Tous les patients avaient déjà eu une hépatectomie ; dans un cas la cryochirurgie transthoracique a été la troisième procédure hépatique et dans deux cas la quatrième. Onze lésions ont été traitées, le diamètre médian a été 30 mm (extrêmes de 10 à 40 mm). Une à quatre sondes de cryochirurgie étaient utilisées selon le diamètre et la position de la tumeur par rapport aux vaisseaux. L’échographie peropératoire était toujours utilisée pour localiser les métastases, pour positionner les cryosondes et pour contrôler le glaçon. La durée médiane de la procédure était de 150 minutes, la perte sanguine médiane était de 100 ml. Il n’y a eu aucun décès peropératoire, 3 patients ont développé des complications mineures (2 hématomes pariétaux et une bactériémie). La durée médiane d’hospitalisation était de 10 jours. Un scanner abdominal était pratiqué une semaine, un mois et 3 mois postopératoire afin d’évaluer le traitement effectué. Après un suivi médian de 10 mois, neuf patients sont vivants dont cinq en vie sans récidive. Trois patients ont eu une récidive hépatique à distance du site de cryochirurgie.
L’utilisation d’une cryochirurgie par un abord transthoracique droit est une technique reproductible, permettant un contrôle local satisfaisant avec une tolérance acceptable dans le traitement des métastases non résécables ou itératives.

n 123

Apport de l’ablathermie par radiofréquence en situation palliative

Marchal F1, Bazin C2, Boccacini H2, Troufleau P3, Henrot P3, Verhaeghe JL1, Guillemin F1

1 Département de Chirurgie, Centre Alexis Vautrin, Avenue de Bourgogne, 54511 Vandœuvre-lès-Nancy ;
2 Service de Radiologie, Hôpitaux de Nancy, Brabois, rue du Morvan, 54511 Vandœuvre-lès-Nancy ;
3
 Département de Radiologie, Centre Alexis Vautrin, Avenue de Bourgogne, 54511 Vandœuvre-lès-Nancy, France.

La radiofréquence est devenue une alternative à la chirurgie dans le traitement des métastases ou des tumeurs primitives hépatiques. L’ablathermie par radiofréquence de tumeurs pulmonaires, rénales ou osseuses se développe petit à petit. Nous rapportons notre expérience de l’utilisation de cette technique en situation palliative.
Matériels et méthodes. Quatre patients ont été traités pour des tumeurs rénales. Deux, âgés de 75 et 79 ans, avaient une tumeur primitive et avaient été récusés en raison de leur état général. Deux autres, âgés de 65 et 79 ans, présentaient une récidive d’adénocarcinome rénal, l’un dans la loge de néphrectomie avec extension à la queue du pancréas associée à des douleurs invalidantes ; l’autre patient présentait une récidive sur le seul rein restant, déjà traité chirurgicalement pour une métastase de son cancer controlatéral. Ces deux patients avaient été récusés pour la chirurgie. Le cinquième patient présentait une métastase osseuse de la tête humérale d’un cancer du sein. Cette métastase avait été traitée par radiothérapie mais la patiente présentait une impotence fonctionnelle douloureuse 1 an après son traitement. Le sixième patient présentait une nouvelle récidive douloureuse d’un chordome sacré traité depuis 1989 à de multiples reprises par chirurgie (6 interventions) et radiothérapie (85 Gy). Cette évolution était inaccessible tant à la chirurgie qu’à une nouvelle radiothérapie. Les cinq premiers patients ont été traités par voie percutanée, le sixième en peropératoire après refoulement de l’uretère gauche et du sigmoïde. Le matériel de radiofréquence était un générateur RF Rita® modèle 1500 (Rita Medical System, INC, Mountain View, USA). Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie générale.
Résultats. Les 4 patients traités pour des adénocarcinomes du rein n’ont pas présenté de récidive locale. Trois étaient en vie sans évolution à distance avec un recul de 12, 16 et 20 mois. Le patient avec sa récidive au contact du pancréas avait été soulagé de ses douleurs et est décédé d’une carcinomatose péritonéale 6 mois après le geste. La patiente porteuse de la métastase osseuse a récupéré la mobilité de son épaule, sans douleur ni nécessité de prendre des antalgiques. Les douleurs induites par le chordome s’étaient amendées. Le scanner de contrôle montrait une nécrose du chordome. Ce patient était hospitalisé en urgence 2 mois après la laparotomie pour rectorragies avec état de choc. L’artériographie mis en évidence une fistule, en site opéré et irradié, à partir d’un faux anévrisme septique entre l’artère hypogastrique et le sigmoïde. Malgré une embolisation permettant de stabiliser le patient, le décès survenait quelques heures plus tard après reprise de l’hémorragie.
Discussion. L’ablathermie par radiofréquence permet, chez des patients jugés inopérables, d’assurer le contrôle local de tumeurs [1-3]. Cette technique est aussi un moyen supplémentaire dans le traitement de douleurs résistantes aux traitements classiques [4, 5]. Toutefois son utilisation n’est pas exempte de possibles complications, parfois mortelles. D’autres séries sont nécessaires afin de déterminer les modalités d’utilisation de la radiofréquence.

1. McLaughin CA et al. Radiofrequency ablation of isolated local recurrence of renal cell carcinoma after radical nephrectomy. Am J Roentgenol 2003 ; 181 : 93-4.

2. Steinke K et al. Percutaneous imaging-guided radiofrequency ablation in patients with colorectal pulmonary metastases : 1-year follow-up. Ann Surg Oncol 2003 ; 11 : 207-12

3. Neeman Z et al. Percutaneous radiofrequency ablation of chordoma. Am J Roentgenol 2002 ; 179 : 1330-2.

4. Goetz MP et al. Percutaneous image-guided radiofrequency ablation of painful metastases involving bone : a multicenter study. J Clin Oncol 2004 ; 22 : 303-6.

5. Evrard S. Surgical lesioning of splanchnic nerves using wet needle radiofrequency thermoablation. J Surg Oncol 2002 ; 80 : 171-2.

n 124

Cancer de l’œsophage radio-induit après irradiation pour un cancer du sein : à propos de quatre cas

Desclos H, Tran Vuong T N, Trivin F, Boucher E, Gédouin D, Williaume D, Le Prisé E, Raoul J-L

Centre E. Marquis, rue de la Bataille Flandres-Dunkerque, CS 44229, 35042 Rennes Cedex.

Nous avons analysé dans notre population de cancers de l’œsophage (CE) chez la femme la proportion de celles ayant précédemment eu une irradiation pour cancer du sein. De 1993 à 2002, 132 patientes ont été traitées pour un CE dans notre centre. Quatre (3 %) avaient un antécédent d’irradiation médiastinale pour un cancer du sein. Ces femmes avaient au moment du diagnostic du CE de 48 à 74 ans ; elles avaient été irradiées respectivement 12, 20, 27 et 28 ans auparavant ; toutes avaient eu une irradiation de la chaîne mammaire interne (CMI). Seule une patiente avait une intoxication tabagique. Il s’agissait de 3 cancers épidermoïdes et d’une tumeur mixte glandulaire et épidermoïde, localisés 2 fois au tiers moyen et deux fois au tiers inférieur de l’œsophage. Deux fois nous avons eu accès au dossier technique radiothérapique confirmant la localisation du CE dans le champ de la CMI ; la dose reçue a été estimée entre 10 et 15 Gray (Gy). Une troisième avait présenté une œsophagite sévère en cours d’irradiation laissant penser que l’œsophage était dans le champ. La quatrième avait eu une irradiation exclusive à très forte dose avec des séquelles majeures : plexite radique, remaniements sternaux, cancer de la thyroïde puis CE. Ces 4 cas ont été observés entre 1999 et 2002. Une patiente était métastatique et n’a reçu qu’une chimiothérapie sans efficacité. Une patiente a été opérée et a récidivé localement 2 ans plus tard. Les deux autres ont pu recevoir une association radio-chimiothérapique permettant chez une de délivrer 50 Gy (schéma Herskovic) et l’autre 60 Gy (5FU mal toléré, seul du CDDP a été délivré). Ces irradiations ont été réalisées par une technique de radiothérapie conformationelle ; les patientes n’ont pas présenté de complications en rapport avec l’irradiation. Toutes deux sont en rémission complète à 1 et 3 ans.
En conclusion, dans notre population les antécédents d’irradiation pour cancer du sein sont retrouvés chez 3 % des femmes développant un cancer de l’œsophage. Toutes avaient eu une irradiation de la chaîne mammaire interne 12 à 28 ans auparavant. Une réirradiation a été possible sans complications. Ces quatre cas sont récents : problème de recueil des données ? avant-garde ?

n 125

Dans le cancer du sein, la découverte d’une micrométastase isolée dans le ganglion sentinelle justifie-t-elle de compléter le curage axillaire ?

Favier L1, Boichot C2, Gelly M3, Fleury G2, Berriolo-Riedinger A2, Benoit L4, Fraisse J4, Cuisenier J4, Brunotte F2, Fumoleau P1, Chauffert B1

1 Services d’oncologie médicale,
2 de médecine nucléaire,
3 d’anatomo-pathologie,
4 de chirurgie oncologique ; Centre G.F. Leclerc, 1, rue Professeur Marion, BP 77980, 21079 Dijon Cedex.

But. Pour les cancers du sein T1N0, la biopsie sélective du ganglion sentinelle (GS) est une technique largement répandue en routine car elle permet de déterminer de façon adéquate le statut ganglionnaire en limitant la morbidité du geste chirurgical. Les progrès de l’examen anatomopathologique des GS (augmentation du nombre de coupes, étude immunohistochimique) ont permis la mise en évidence de micrométastases (< 2 mm) pour lesquelles il n’existe pas à l’heure actuelle de consensus concernant la stratégie thérapeutique. Cette étude vise à évaluer l’intérêt du curage axillaire classique chez les patientes porteuses de micrométastase au niveau du GS.
Matériel et méthodes. 33 patientes avec micrométastase dans le GS et ayant bénéficié d’un curage axillaire classique complémentaire ont été incluses dans cette étude rétrospective. Deux groupes ont été individualisés : 19 patientes ont eu un curage immédiat (groupe 1), et 14 un curage retardé après chimiothérapie adjuvante du fait de facteurs de mauvais pronostic (groupe 2). Les dossiers des patientes du groupe 1 ont été revus pour déterminer si les données du curage complémentaire ont entraîné une modification de l’indication potentielle de chimiothérapie adjuvante. Pour cela, il a été jugé, selon les critères de St Gallen, si les patientes relevaient d’une chimiothérapie adjuvante : d’abord en se basant uniquement sur les données cliniques, histologiques et biologiques de la tumeur, puis, en prenant en compte le statut ganglionnaire. Les dossiers des patientes du groupe 2 ont été revus afin de rechercher une atteinte ganglionnaire au niveau du curage.
Résultats. Parmi les patientes du groupe 1, deux ont présenté une vraie métastase dans le complément de curage : une patiente avec une tumeur de 50 mm, et la 9e patiente de la courbe d’apprentissage d’un des chirurgiens, mais sans que cela modifie les indications de chimiothérapie adjuvante (12 patientes traitées par FEC100). Parmi les patientes du groupe 2, aucune n’a présenté de métastase ganglionnaire ou de cicatrice tumorale au niveau du curage.
Conclusion. Si les indications de la biopsie sélective du GS sont respectées, ces premiers résultats montrent que le curage axillaire immédiat ou retardé semble avoir peu d’intérêt. De plus, le curage complet expose les patientes à perdre le bénéfice de la technique en termes de morbidité.

n 126

Prise en charge cœlioscopique des cancers digestifs 

Christidis C, Denet C, Perniceni T, Levard H, Mal F, Blain A, Gayet B

Département médico-chirurgical de pathologie digestive, Institut Mutualiste Montsouris, 42 Boulevard Jourdan, 75014 Paris.

La cœlioscopie a été validée dans la chirurgie des pathologies digestives bénignes. Le but de cette étude rétrospective monocentrique était d’étudier la faisabilité de la voie cœlioscopique pour la prise en charge des cancers digestifs.
Résultats. De janvier 1996 à décembre 2003 au sein d’un département de chirurgie digestive comportant 4 chirurgiens temps plein, il y a eu 5318 actes chirurgicaux (exclusion faite de la chirurgie pariétale et des reprises pour complication). Les voies d’abord utilisées étaient respectivement une cœlioscopie et une laparotomie dans 61,8 et 32,5 % des cas. Vingt-huit pour cent de ces malades étaient opérés d’un cancer (n = 1496), par cœlioscopie et laparotomie dans respectivement 44,7 % et 55,3 % des cas. Le tableau indique les principaux organes atteints :

 

Œsophage Estomac Grêle Côlon Rectum Foie Pancréas Total
Total 243 124 19 481 268 164 120 1419
Cœlioscopie 164 19 5 217 136 65 29 635
laparotomie 79 105 14 264 132 99 91 784

Discussion. La chirurgie cœlioscopique permettait l’exérèse des cancers de tous les organes digestifs. L’abord cœlioscopique permettait outre les avantages cosmétiques et un meilleur confort postopératoire de réaliser une exploration complète de la cavité abdominale afin d’éliminer une carcinose (3 % des malades) évitant ainsi une laparotomie inutile. La durée moyenne de séjour et la durée moyenne de reprise des activités étaient statistiquement inférieures dans le groupe cœlioscopie, permettant notamment une prise en charge chimiothérapique plus rapide. En ce qui concerne les critères oncologiques, tous les types de cancers ont été opérés (cancer épidermoïde, adénocarcinome ou tumeur stromale), le nombre moyen de ganglions analysés était supérieur aux recommandations actuelles et la résection était R0 dans la quasi-totalité des cas. Deux malades ont eu des greffes tumorales sur les trajets de trocart. Dans les deux cas il s’agissait d’une carcinose péritonéale en rapport avec des cancers pancréatiques.
Conclusion. Au sein d’une équipe multidisciplinaire par des chirurgiens entraînés à la chirurgie carcinologique, l’approche cœlioscopique permet une exploration satisfaisante de la cavité abdominale et la réalisation de l’ensemble des gestes chirurgicaux à l’identique de ceux réalisés par laparotomie permettant une durée d’hospitalisation plus courte, une résection oncologiquement satisfaisante, un préjudice esthétique moindre et un meilleur confort post-opératoire.

Radiothérapie

n 127

Radiothérapie des plasmocytomes solitaires extra-osseux des voies aérodigestives supérieures : quelle dose nécessaire ?

Tournier-Rangeard L1, Lapeyre M1, Jounnaud C2, Brunaud-Chara C1, Hoffstetter S1, Marchal C1, Peiffert D1

1 Département de radiothérapie, Centre Alexis Vautrin, 54511 Vandœuvre-lès-Nancy ;
2 Institut Jean Godinot, Reims.

La radiothérapie (RT) est le traitement standard des plasmocytomes solitaires (PS) des voies aérodigestives supérieures (VADS). Le but de cette étude a été de déterminer la dose d’irradiation à délivrer sur la tumeur (ou le lit tumoral) et les aires ganglionnaires cervicales.
Matériels et méthode. De 1979 à 2001, 16 patients ont été traités au Centre Alexis Vautrin pour un PS des VADS. Le sex ratio était de 13/3. Il s’agissait de 14 stades 1 (N0) et de 2 stades 2 (N+). Il y avait 6 fosses nasales, 7 cavums, 2 oropharynx et un sinus maxillaire. L’âge moyen était de 62,5 ans (39-80). Le recul moyen était de 84 mois (4,56-174). Huit patients avaient eu une exérèse avant la RT. La dose moyenne en postopératoire était de 50 Gy (40-60 Gy) et de 56 Gy (44-65 Gy) sur la tumeur en place. Sur 10 pts N0, 4 ont reçu une RT ganglionnaire cervicale prophylactique à la dose moyenne de 36,5 Gy (30-40 Gy). Les deux patients N+ ont eu une RT ganglionnaire à la dose de 40 et 60 Gy.
Résultats. La survie globale était à 5 et 10 ans de 80 % et 62,1 %. Le taux de contrôle local était de 71,3 % à partir de 4,5 ans. Une couverture limite du volume cible par les champs d’irradiation était pronostique de récidive locale (p = 0,03). Pour les 10 patients ayant eu une dosimétrie, la dose de 45 Gy était pronostique de récidive locale. Il n’y a pas eu de récidive ganglionnaire chez les patients N0. Il y a eu une récidive ganglionnaire chez les 2 patients N+. Le taux de survie sans maladie à 5 et 10 ans était de 62,1 % et 51,8 %. Le facteur pronostique était la sécrétion d’Ig monoclonale (p = 0,013).
Conclusion. Une dose de l’ordre de 50 Gy est recommandée sur le volume cible tumoral avec un complément éventuel en cas de grosse tumeur en place.

n 128

Une nouvelle technique de radiothérapie : la radiothérapie asservie à la respiration

Giraud P1, Simon L1, Servois V2, Saliou M1, Campana F1, Rosenwald JC1, Cosset JM1

Départements de1 Radiothérapie et de2 Radiodiagnostic, Institut Curie, 26, rue d’Ulm, 75005 Paris.

Les techniques d’asservissement respiratoire représentent un progrès important pour le traitement des tumeurs mobiles avec la respiration, comme les cancers pulmonaires, mammaires et hépatiques. Elles permettent de mieux adapter les champs d’irradiation à la tumeur et ainsi de protéger certains organes critiques (le poumon, le cœur…). Il s’agit d’un outil d’optimisation des méthodes thérapeutiques complémentaire des autres techniques innovantes comme la radiothérapie conformationnelle avec et sans modulation d’intensité. Deux principales approches peuvent être actuellement distinguées : dans la première, la respiration du patient est bloquée, soit volontairement, soit par l’occlusion d’une valve. Nous avons étudié cette dernière technique pour l’acquisition TDM des données anatomiques à différents moments du cycle respiratoire de 10 patients adressés pour un cancer bronchique non à petites cellules. Sélectionnés initialement sur leur capacité respiratoire et leur état général, tous les patients ont pu tenir une apnée entre 16 et 20 secondes en inspiration puis en expiration maximales autour du volume courant. Le blocage volontaire, en général inspiratoire, de la respiration a été plus étudié que le blocage actif. La technique utilisée à l’Institut Curie emploie un spiromètre couplé à un écran ou à des lunettes équipées de récepteurs vidéo retransmettant en temps réel, pour le patient lui-même et les techniciens, le niveau respiratoire souhaité et celui effectivement atteint. Ce type de blocage volontaire est en cours d’évaluation pour différentes localisations tumorales (cancers du sein et du poumon). La seconde approche consiste à suivre en temps réel le rythme ventilatoire spontané et à déclencher le scanner ou l’accélérateur linéaire à un niveau, toujours identique, du cycle respiratoire. Cette technique s’adapte au cycle respiratoire de chaque personne. Les mouvements respiratoires peuvent être détectés grâce à plusieurs types de capteurs (caméra CCD dans le système testé à l’Institut Curie). Une nouvelle utilisation de ces systèmes vient d’être développée : la TDM corrélée à la respiration. Cette nouvelle stratégie consiste à associer à chaque coupe une information indiquant sa situation dans le cycle respiratoire. Elle permet de reconstruire rétrospectivement un examen complet pour chaque phase du cycle respiratoire, de mesurer les mouvements résiduels et de choisir la phase optimale où ces mouvements sont les plus petits. Notre expérience de ces différentes approches dans les cancers du poumon et du sein est rapportée

n 129

Apport de la radiothérapie bifractionnée dans le cancer du cavum : expérience du centre anticancéreux (CAC) de Constantine

Naoun L1, Melais K1, Hamlaoui R1, Bali S1, Bensalem A2, Djemaa A1

1 Service de Radiothérapie ;
2 Service d’Oncologie,CAC, Constantine.

Le cancer du nasopharynx représente la pathologie la plus fréquente des voies aérodigestives supérieures en Algérie. Notre étude porte sur une série de 773 malades atteints d’un UCNT (undifferenciated carcinoma of naseo-pharyngeal tumor) du cavum ayant bénéficié d’une chimiothérapie (CT) néoadjuvante de type doxorubicine (D) - cisplatin (CDDP) suivie d’une radiothérapie (RT) bifractionnée sur un total de 1360 UCNT traités au CAC de Constantine de janvier 1990 à décembre 1999. L’âge moyen de nos malades est de 41,8 ans (4-80 ans), avec un sex ratio de 1,88. Le délai moyen de consultation est de 9,6 mois (1-66 mois). 88,4 % de nos malades étaient classés T3/T4, 69,8 % étaient N3 et 6,5 % étaient métastatiques d’emblée. Tous nos malades ont bénéficié de 3 à 4 cures de CT néoadjuvante (D 60 mg/m2, CDDP 100 mg/m2) J1 = J22, suivie d’une irradiation bifractionnée au cobalt 60 avec un fractionnement de 1,6 Gy/séance, 2 fois par jour, espacé de 6 heures, avec une dose totale de 70,4 Gy sur le cavum, une dose de 45 à 50 Gy sur les ganglions sus-claviculaires et une surimpression de 10 à 15 Gy sur les ganglions cervicaux. La RT est réalisée en deux séries, la première dure 16 jours et la deuxième 12 jours, avec un repos de 7 à 14 jours entre les deux séries en fonction de la tolérance du malade. Les complications précoces sont dominées par des mucites de grades II et III et des érythèmes cutanés qui régressent lors du repos. Les complications tardives telles que les scléroses cervicales et les trismus sont moins importantes que celles retrouvées chez les malades traités classiquement. La survie globale moyenne de nos malades à 5 ans est de 51,2 % et à 10 ans elle est de 40,8 %.
Ces résultats montrent que l’irradiation bifractionnée avec une même dose totale permet d’obtenir un meilleur contrôle local de la maladie, donc une meilleure survie globale, tout en ayant moins de complications tardives et une diminution de la durée d’hospitalisation qui passe de 47 jours à 28 jours.

n 130

Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique seule pour la radiothérapie conformationnelle du cancer de la prostate

Pasquier D1-3, Palos G3, Betrouni N3, Rousseau J2-3, Lartigau E1-2

1 Service de Radiothérapie, Centre O. Lambret, Lille ;
2
 Faculté de médecine, Lille 2 ;
3
ERT 23

L’IRM permet une meilleure définition du volume prostatique, mais n’est actuellement utilisée que conjointement avec la tomodensitométrie (TDM). L’utilisation de l’IRM seule permettrait d’éviter à la fois les erreurs induites lors de la fusion d’images et la réalisation d’un examen supplémentaire irradiant. Les obstacles sont la distorsion liée au système et à l’objet étudié (déplacement chimique et susceptibilité magnétique), l’absence d’informations sur les densités électroniques et la compatibilité avec certains systèmes de planification de dose.
Les mesures de distorsion liée au système ont été réalisées sur deux machines à aimant supraconducteur de 1,5 Tesla grâce à un fantôme de géométrie connue de 40 x 30 x 21 cm, avec des séquences Turbo Spin Echo pondérées en T2. Les valeurs mesurées restent inférieures à 2 et 3 mm pour des champs de vues de 20 cm et 45 cm. Le déplacement chimique et la susceptibilité magnétique ont été mesurés chez 4 volontaires sains après inversion des gradients de phase et de fréquence. Les valeurs mesurées (0,3 mm à 3 mm pour la prostate, la vessie et le contour externe) sont inférieures aux valeurs théoriques en raison de l’adaptation de la fréquence de résonance au patient étudié. Le retentissement sur la dosimétrie de l’absence de données sur les densités électroniques a été évalué en assignant différentes densités électroniques aux tissus mous et aux structures osseuses sur les images de TDM. Les plans de traitement obtenus étaient comparés à celui réalisé sur l’examen original de TDM. L’absence de prise en compte des hétérogénéités électroniques conduit à un sous-dosage de 2,8 % du volume cible. Après assignation des valeurs recommandées par l’International Commission on Radiation and Units and Measurements aux tissus mous et à l’os, l’écart en termes d’unité moniteur n’est que de 0,3 %. La réalisation de Digitally Reconstructed Radiograph, nécessaire pour la vérification du positionnement du patient, est possible après assignation de densités électroniques aux images IRM. La distorsion liée au système et à l’objet étudié ne représentent pas des obstacles majeurs ; de même l’assignation de densités électroniques permet d’obtenir une dosimétrie identique à celle obtenue sur scanner. De nouvelles séquences IRM utilisant des gradients élevés vont être développées. L’IRM pourrait être utilisée seule dans un avenir proche pour la planification dosimétrique du cancer de la prostate.

n 131

Radiothérapie hypofractionnée dans le cancer du sein

Melais K, Naoun L, Hamlaoui R, Bali S, Djemaa A

Centre anticancéreux, CHU Benbadis, 25000 Constantine, Algérie.

Le cancer du sein représente la première localisation féminine en Algérie. La radiothérapie constitue une étape essentielle du traitement. L’irradiation classique consiste à étaler la dose totale prescrite sur plusieurs séances à raison de 2,5 Gy/4 séances, qui peut être contraignant dans certaines circonstances (patientes âgées, éloignement des malades, capacité d’accueils des appareils dépassée). La réduction de la durée du traitement et du nombre des séances serait alors souhaitable.
De janvier 2000 à décembre 2002, 1211 malades présentant un cancer du sein ont été traités au centre anticancéreux de Constantine. L’âge moyen est de 47 ans. Le délai moyen de consultation est de 8 mois. 60 % sont des T3-T4, 68 % des N1. 20 % des malades étaient métastatiques d’emblée, le carcinome canalaire infiltrant est dominant avec un taux de 89,5 %.
91 % de nos malades ont été opérées, la chimiothérapie a été réalisée dans 95 % des cas et la radiothérapie chez 98,3 % des malades. Les modalités de la radiothérapie ont consisté en une radiothérapie classique chez 105 malades, une radiothérapie palliative (flash) chez 111 patients, une radiothérapie hypofractionnée J1J3-J15J17-J29J31 selon une dose alternative 5/6,5Gy pratiquée chez 72 malades (âgées de plus de 65 ans en mauvais état général) et enfin une radiothérapie hypofractionnée semi-concentrée un jour sur deux (3 Gy × 3) ; 13 séances pour une dose équivalente à 44,6 Gy et 16 séances équivalent à 54,9 Gy, chez les malades de moins de 65 ans réalisée pour 903 patientes. Parmi les 903 malades traitées par une radiothérapie hypofractionnée semi-concentrée (3 Gy × 3), 6 ont présenté une récidive locale et 77 des métastases à distance.
En conclusion, pour une durée de traitement moindre que l’irradiation classique et à tolérance égale, le protocole (3 Gy × 3) permet de doubler le nombre de malades au niveau des machines dans un pays où le nombre de ces dernières est insuffisant et la capacité d’accueil des appareils est dépassée.

n 132

Résultats à long terme du traitement de 116 malades porteurs de carcinomes des cavités aériennes de la face

Lachos A, Arroyo R, Dessard-Diana B, Simon JM, Racadot S, Mazeron JJ, Baillet F

Service de Radiothérapie, Hôpital Pitié-Salpêtrière, 47 bd de l’Hôpital, 75651 Paris Cedex 13.

Cette étude des résultats à long terme obtenus par une même équipe avant l’ère de la radiothérapie conformationnelle chez 116 malades porteurs de carcinomes des cavités aériennes de la face a été entreprise, pour pouvoir comparer ces résultats avec ceux obtenus ultérieurement par les radiothérapies conformationnelles. La population comprend 58 adénocarcinomes, 52 carcinomes épidermoïdes, 4 carcinomes indifférenciés, 2 carcinomes mixtes. Les localisations sont : sinus ethmoïde 67, sinus maxillaire 45, fosses nasales 3, sinus sphénoïdal 1. Les adénocarcinomes représentent 79 % des carcinomes de l’ethmoïde et les carcinomes épidermoïdes 89 % de ceux du sinus maxillaire. Il y a 77 % d’hommes. L’âge moyen est de 59 ans (26 à 86 ans). Il y a 16 T1, 10 T2, 16 T3 et 74 T4 (64 % du total) et, selon la taille en cm, 18 T < 3 cm, 47 T ≤ 5 cm, 51 T > 5 cm. Les atteintes orbitaires concernent 53 % des malades (22 parois seulement 39 intra-orbitaires), les atteintes intracérébrales 14 % et les atteintes ptérygomaxillaires 15 %. Le traitement chirurgical réalisé chaque fois que possible a concerné 94 malades (81 %) avec 4 exentérations. L’exérèse a été considérée comme complète dans 50 % des cas. La radiothérapie a été faite par 2 ou 3 faisceaux orthogonaux aux doses de 55 à 70 Gy en postopératoire (85 % avec 70 Gy) et aux doses de 75 Gy en radiothérapie exclusive. La survie globale de l’ensemble est de 35 % à 5 ans, 24 % à 10 ans et 19 % à 15 ans. La survie des adénocarcinomes est de 36, 26, 20 et celle des épidermoïdes de 29, 16, 13. La survie des carcinomes de l’ethmoïde est de 42, 31, 25 et celle des carcinomes du sinus maxillaire de 20, 13, 10. La survie des T1 est de 76, 62, 41 ; celle des T2 de 70, 56, 42 ; celle des T3 de 25, 17, 17 ; celle des T4 de 24, 14, 14. La survie des malades opérés et irradiés est de 40, 29, 23 et celle des inopérables irradiés de 13 % et 0 % à 8 ans. En cas de chirurgie « complète », elle est de 64, 45, 35 et dans le cas contraire de 17, 14, 14. Les 40 rechutes locales après chirurgie surviennent dans 83 % des cas dans les deux premières années, les 10 rechutes ganglionnaires dans 90 % et les 19 rechutes métastatiques dans 84 %. Les 30 rechutes locorégionales sans métastase associée ont bénéficié 11 fois d’une chirurgie de rattrapage. 64 % de ces cas ont récidivé à nouveau. Sur le plan oculaire, 7 malades ont perdu la vision d’un œil, 3 fois à cause de la tumeur, 4 fois par exentération, 1 fois par toxicité de la radiothérapie (atteinte bilatérale). La radiothérapie conformationnelle doit permettre d’améliorer ces résultats.

n 133

Utilisation de la fusion d’images IRM-scanner et du TEP-scanner pour déterminer les volumes à irradier par radiothérapie conformationnelle avec modulation d’intensité : expérience préliminaire en ORL au centre René Huguenin à Saint-Cloud

Gardner M1, Valinta D1, Alberini JL2, Plantet MM3, Banal A4, Hans S5, Lagarde F5, De Mones H5, Halimi P6, Floiras JL1

1 Service de Radiothérapie,
2 Service de Médecine Nucléaire ;
3 Service de Radiologie,
4 Service ORL, Centre René Huguenin, 35, rue Dailly, 92210 Saint-Cloud ;
5 Service ORL,
6 Service de Radiologie, Hôpital Européen Georges Pompidou, 20, rue Leblanc, 75015 Paris.

La radiothérapie conformationnelle avec modulation d’intensité (RCMI) permet d’optimiser la dose délivrée aux tissus tumoraux en limitant celle délivrée aux organes à risque. Pour les cancers ORL, la détermination avec une grande précision des volumes à irradier est essentielle compte tenu de la proximité des organes critiques. Une étude préliminaire d’utilisation de la fusion des images scanner-IRM et du TEP-scanner en position de traitement a été initiée au Centre René Huguenin. La fusion des images acquises au scanner et en IRM permet une détermination optimale des volumes d’intérêt. Le TEP-scanner permet d’une part de réaliser un bilan d’extension complet et d’autre part d’identifier des ganglions dont la nature hypermétabolique est en faveur de leur envahissement. Ces modalités sont pour l’instant réservées dans notre centre aux patients traités par RCMI pour des cancers de l’oropharynx ou du nasopharynx non métastatiques. Cinq patients (3 cancers du nasopharynx et 2 cancers de l’oropharynx) traités par RCMI ont bénéficié de cette prise en charge complexe. La préparation du dossier technique débute par la confection du masque en position de traitement qui permettra un repositionnement identique lors des différentes étapes des explorations (scanner, IRM et TEP) et du traitement. Les repères positionnés sur le masque permettent de réaliser un repositionnement précis. Le TEP-scanner est réalisé en deux temps d’acquisition : l’examen du corps entier, puis des coupes plus fines centrées sur la sphère ORL. L’IRM et le scanner sont transférés sur une console de dosimétrie Corvus, afin de réaliser la fusion des images. Les contours des organes à risques, des organes à protéger et des volumes à irradier sont tracés en utilisant les images fusionnées. Les ganglions visibles au scanner et hypermétaboliques en TEP sont inclus dans les volumes recevant une dose plus importante. Les images acquises en IRM et scanner sont comparées aux zones hypermétaboliques en TEP pour préciser l’extension de la tumeur. Les contours ainsi déterminés sont utilisés pour élaborer le plan de traitement en RCMI avec l’utilisation du programme Corvus, version 5.0.

n 134

Prédiction des effets secondaires tardifs après radiothérapie par le taux d’apoptose lymphocytaire CD8 : résultats d’une étude prospective sur 399 patients

Azria D1, Crompton N2, Gourgou S1, Kramar A1, Li L3, Shi YQ2, Sozzi J, Zouhair A3, Mirimanoff RO3, Ozsahin M3

1 CRLC Val d’Aurelle, Montpellier, France ;
2 Institut Paul Scherrer, Villigen, Suisse ;
3
 Radio-oncologie, CHUV, Lausanne, Suisse.

Objectifs. La prédiction des effets secondaires tardifs après radiothérapie a été évaluée par le taux d’apoptose radio-induit des lymphocytes CD8 (TAL) in vitro.
Patients et méthodes
. Dans une étude prospective, un tube de sang hépariné de 5 ml a été prélevé chez 399 patients traités par radiothérapie externe (RT) dans un but curateur. Chaque prélèvement a été préparé puis irradié (8 Gy). Quarante-huit heures après, les lymphocytes ont été sélectionnés et le taux d’apoptose a été mesuré par cytométrie en flux. Tous les patients ont été suivis régulièrement et les toxicités tardives ont été répertoriées et classées selon la classification RTOG/EORTC. Six patients ont refusé la RT après le prélèvement de sang et ont été exclus des analyses. L’aire sous la courbe (AUC) des analyses de type ROC a été utilisée pour calculer la prédiction des effets secondaires tardifs par le TAL. L’analyse des risques compétitifs a permis d’estimer l’incidence cumulative des effets secondaires tardifs en fonction de l’apoptose radio-induite.
Résultats. La majorité des patients présentaient un cancer du sein (149), un cancer ORL (75) et un cancer de la prostate (36). Les taux de toxicités tardives de grades 2 et 3 ont été respectivement de 31 % (121/393) et de 7 % (28/393). Un taux bas du TAL a été statistiquement corrélé au pourcentage de toxicités tardives de grade ≥ 2 (p < 0,0001). Un taux de TAL supérieur à 24 a été retrouvé chez tous les patients n’ayant pas présenté de toxicité de grade 3 (p < 0,0001). Les AUC ont été de 0,827 pour les patients ayant présenté une toxicité tardive de grad ≥ 2. La valeur prédictive positive a été de 83 % pour un TAL = 16 % et la valeur prédictive négative de 86 % pour un TAL > 24 %. Les taux d’incidence cumulative des toxicités tardives de grade ≥ 2 ont été respectivement de 70, 32 et 12 % pour les TAL ≤ 16, 16-24 et > 24 %.
Conclusions. Le TAL prédit significativement le risque des effets secondaires tardifs après radiothérapie. Il pourrait être utilisé afin d’écarter des protocoles d’escalade de dose les patients intrinsèquement hypersensibles à la radiothérapie.

n 135

Radiothérapie conformationnelle avec modulation d’intensité des cancers localisés de la prostate : expérience du Centre René Huguenin

Breton-Callu C, Valinta D, Labib A, Moisson P, Dejean C, Poinsignon A, Floiras JL

Département de radiothérapie, Centre René Huguenin, Saint-Cloud.

La mise en œuvre de la radiothérapie conformationnelle avec modulation d’intensité (RCMI), dans le traitement des cancers de prostate localisés, a permis d’augmenter la dose délivrée au volume cible, facteur associé au contrôle local de la maladie, tout en épargnant les organes critiques et les tissus sains. Cette étude rapporte les résultats préliminaires en termes de toxicité aiguë, tardive et du suivi biochimique (élévation du PSA, prostatic specific antigen).
Matériels et méthodes. Entre janvier 2001 et mars 2003, 44 patients présentant un cancer de la prostate localisé ont été traités par radiothérapie externe avec modulation d’intensité. Il s’agissait essentiellement de tumeurs de stade T1c-T2a (86 %), de score de Gleason 6 et 7 (86 %). Le PSA moyen était initialement de 10,17 ng/ml (1,31-34,18). Les patients ont bénéficié, dans un premier temps, d’un traitement par radiothérapie conformationnelle jusqu’à la dose moyenne de 47 Gy (45-50), dans un volume incluant la prostate et les vésicules séminales. La deuxième partie du traitement a consisté en un complément par RCMI dans le seul volume prostatique à la dose moyenne de 31 Gy (26-33). La dose totale moyenne était donc de 78 Gy (75-80), à laquelle s’ajoute en moyenne une dose de 1,5 Gy délivrée par les contrôles d’imagerie portale. Le suivi moyen des patients est de 22 mois (10-36).
Résultats
. En termes de tolérance, aucun patient n’a présenté de toxicité rectale aiguë. Une toxicité urinaire de grade 2 ou inférieure a été notée chez 24 (54,5 %), en cours de traitement. Celle-ci est dépendante de la condition urinaire avant traitement car 29,5 % des patients présentaient des troubles préexistants à type de dysurie ou pollakiurie. Les troubles urinaires ont été résolutifs dans les 6 mois suivant la fin de la radiothérapie pour l’ensemble des patients. Après un recul moyen de 22 mois, il n’a été noté aucune toxicité rectale tardive, ni urinaire. La survie actuarielle à 2 ans sans récidive biochimique est de 96,8 %.
Conclusions. La faisabilité de la RCMI a été largement démontrée dans cette indication. Les résultats préliminaires de l’étude menée au Centre René Huguenin confirme l’excellente tolérance rectale et urinaire de ce traitement. Le recul est encore insuffisant mais les résultats concernant la survie actuarielle à 2 ans sans récidive biochimique sont prometteurs.

n 136

Étude de la distribution de dose dans le volume-cible des cancers de la tête et du cou traités par radiothérapie conformationnelle avec modulation d’intensité

Martin E, Peignaux K, Bonnetain F, Barillot I,Truc G, Brenier JP, Maingon P.

Département de radiothérapie, Centre G-F Leclerc, 1 rue du Pr Marion, 21079 Dijon Cedex.

Objectif. Etudier l’hétérogénéité de doses délivrées dans les volume cibles au cours d’une radiothérapie par modulation d’intensité (RCMI) dans les cancers de la tête et du cou.
Patients et méthodes. D’août 2001 à avril 2004, 40 patients (31 hommes et 9 femmes) porteurs de cancers de la tête et du cou ont été traités à visée curative par RCMI. Les sites traités étaient sinus de la face (10), hypopharynx (7), adénopathies en apparence primitive (6), cavité buccale (7), oropharynx (5), nasopharynx (3), thyroïde (2). Il s’agissait majoritairement de carcinomes épidermoïdes (62,5 %), indifférenciés (12,5 %), de cylindromes (10 %), d’esthésioneuroblastomes (5 %). Une dose de 50 à 72 Gy a été prescrite au volume cible anatomoclinique (CTV). Une marge symétrique de 3 mm a été ajoutée autour du CTV pour créer le PTV (planning target volume). Lors de la planification du traitement, des contraintes de dose et de volume ont été appliquées aux organes à risque. La dose moyenne (Dmean) délivrée à chaque parotide ne devait pas excéder 25 Gy et la dose maximale (Dmax) reçue par la moelle ne devait pas dépasser 40 Gy. Ces variables ont ensuite été extraites des histogrammes dose-volume issus de la dosimétrie inverse, en prenant en compte pour le PTV des critères ICRU 62 (– 5 % et + 7 %). Elles sont décrites par la moyenne, l’intervalle de confiance à 95 % et l’étendue.
Résultats. La dose moyenne délivrée au PTV est de 64 Gy (62-66, min 48, max 75) et ne diffère pas significativement de la dose prescrite (p = 0,7). En termes d’hétérogénéité, 16 % des patients ont reçu dans le volume cible moins de 95 % ou plus de 107 % de la dose prescrite ; 54 % (49-60) du volume a reçu entre 100 % et 107 % de la dose prescrite ; 30 % (25-35) du volume a reçu entre 95 % et 100 % de la dose prescrite. Les doses moyennes délivrées à la parotide droite et gauche sont respectivement de 25 Gy (21-30, min 5, max 47) et de 28 Gy (24-33, min 5, max 52). Elles ne diffèrent pas significativement des 25 Gy prescrits. La Dmax moyenne reçue par la moelle est de 33 Gy (28-38, min 0, max 63). Elle est significativement inférieure aux 40 Gy recommandés.
La radiothérapie par modulation d’intensité génère des hétérogénéités parfois importantes dans les volumes cibles. Elle autorise une accélération de l’irradiation et respecte les limites des contraintes de dose appliquées aux organes sains. Les doses reçues par les parotides sont compatibles avec une conservation salivaire.

n 137

Radiothérapie bifractionnée avec ou sans chimiothérapie de type cisplatine-5FU dans les cancers de l’oro et de l’hypopharynx inopérables : résultats avec plus de 24 mois de suivi (essai de phase III FNCLCC-Gortec)

Ginot A1, Fiore R1, Manzo R1, Ortholan C1, Magné N1, Bénézery K1, Bensadoun RJ1

1 Département de radiothérapie, Centre Antoine Lacassagne, 33 av Valombrose, 06000 Nice.

Nous avons réalisé un essai de phase III multicentrique randomisé portant sur 171 patients porteurs de tumeurs de l’oropharynx et de l’hypopharynx non opérables de novembre 1997 à mars 2002.
Matériels et méthodes. Les patients étaient porteurs de cancers de l’oropharynx et l’hypopharynx non résécables non prétraités. Le statut ganglionnaire était indifférent. Les critères d’éligibilité étaient un performans status supérieur à 70 %, un âge inférieur à 75 ans et un statut biologique, rénal et cardiaque acceptable. Les patients étaient pris en charge pendant la durée du traitement (7 semaines) par support nutritionnel entéral et traitement préventif des mucites. L’essai comparait deux bras, le bras A comportant une radiothérapie bifractionnée externe seule, le bras B associant à la même radiothérapie une chimiothérapie concomitante par cisplatine-5FU. Le volume cible correspondait à la tumeur primitive et aux aires ganglionnaires satellites. L’irradiation était effectuée par deux faisceaux latéraux opposés (cobalt 60 ou photons de 5-6 MV) à raison de 2 fractions de 1,2 Gy par jour (intervalle entre les fractions de 6 heures minimum), 5 jours par semaine de J1 à J46 sans split course. La dose totale délivrée était de 80,4 Gy en 46 jours dans les tumeurs oropharyngées et de 75,6 Gy en 44 jours dans les tumeurs de l’hypopharynx. Dans le bras B, le cisplatine était délivré à J1 à la posologie de 100 mg/m2, le 5FU était délivré en perfusion continue de J1 à J5 à la dose de 750 mg/m2 au premier cycle et de 430 mg/m2 aux deuxième et troisième cycles avec adaptation des doses de 5FU à J4 selon la pharmacocinétique. Les cycles sont réalisés tous les 21 jours pour un total de trois cycles.
Résultats. 163 patients ont été évalués (123 oropharynx, 40 hypopharynx). Dans la population générale, la survie sans récidive (SSR) et la survie globale (SG) sont significativement meilleures dans le bras avec chimiothérapie, la SSR passant de 37,5 % (bras A) à 54,32 % (bras B) (p < 0,002) et la SG de 35,8 % à 48,15 % (p < 0,05). Pour les 123 oropharynx (108 hommes, âge moyen 53 ans, médiane de suivi 24 mois) (79 T4, 44 T3, 5 T2N3,60 N2b/N2c, 17 N3, 16N0) : la SG et la SSR étaient respectivement de 36 % et 29,1 % dans le bras A contre 54,2 % et 51 % dans le bras B (p < 0,01 et p < 0,002). La médiane de survie était de 10 mois dans le bras A et de 17 mois dans le bras B (p < 0,05). Les complications aiguës étaient une mucite de grade 3-4 dans 82 % des cas dans le bras B et 69 % dans le bras A (non significatif), une épithélite de grade 2-3 dans 65 % des cas (bras B) et 49 % dans le bras A (non significatif), 39 % de neutropénies de grade 3-4 dans la bras avec chimiothérapie. Le suivi à plus de 24 mois de 38 patients n’a montré que des séquelles tardives modérées, essentiellement au niveau osseux et salivaire. Dans la sous-population des hypopharynx, la différence entre les deux bras n’était pas significative.
Conclusion
. Ces résultats mettent en évidence une amélioration significative des résultats du traitement des cancers de l’oropharynx non résécables en utilisant une radio-chimiothérapie concomitante avec notamment une amélioration du contrôle local et de la survie globale par rapport à la radiothérapie externe bifractionnée seule. Ce type d’association est réalisable, la toxicité aiguë n’étant pas significativement supérieure à celle de la radiothérapie seule, la toxicité à long terme étant modérée.

n 138

Mise en place de la radiothérapie par modulation d’intensité à l’Institut Gustave Roussy

Saint Martin A, Pichenot C, Girinsky T.

Institut Gustave Roussy, 39, rue Camille-Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex.

L’application de la technique de radiothérapie conformationnelle par modulation d’intensité a débuté à l’Institut en décembre 2002 à un rythme d’un nouveau patient tous les 15 jours.
Les traitements sont délivrés en mode dynamique sur un accélérateur Varian/Clinac 2300 C/D disposant d’un collimateur de 52 lames de largeur 1 cm pour des photons de 6 et/ou 20 MV. Le patient est immobilisé par un masque thermoformé type 3 points dans le cas des tumeurs cérébrales et 5 points pour les localisations tête et cou et médiastinales. La simulation virtuelle est réalisée à partir de coupes scanner et/ou IRM dans l’environnement Varian/Somavision 6.1. Le contourage des volumes GTV, CTV et PTV et des organes à risque est pris en charge par le radiothérapeute. La planification inverse et la distribution de dose sont calculées par le logiciel Varian/Cadplan/Hélios puis contr ôlées par le physicien mé dical avant traitement. Enfin, une fois le plan de traitement validé par le radiothérapeute en observant d’une part la distribution de doses sur différentes coupes transverses et d’autre part les histogrammes dose-volume, il est enregistré dans le logiciel de Record and Verify Varian/Varis 6.2. Le positionnement du patient est vérifié par une imagerie portale quotidienne en incidence antérieure et latérale validée par un radiothérapeute.
Trente patients répartis selon les localisations suivantes, 4 tumeurs intracrâniennes, 4 tumeurs pédiatriques, 11 tumeurs tête et cou et 12 tumeurs du médiastin, ont bénéficié de cette technique. Les prescriptions de dose restent identiques à celles des traitements classiques. Le temps de contourage est compris entre 2 et 6 heures et le temps de planification avec contrôle de qualité entre 5 et 8 heures. Les niveaux de tolérance sur le rapport entre la dose mesurée et calculée, pris comme étant 2 fois l’écart-type, sont égaux à 5 %.
Après une année de traitement, nous avons réduit le temps de traitement (compris entre 15 et 30 minutes) par une diminution du nombre de contrôle par imagerie portale refait par séance (1 portal antérieur et 1 latéral). Nous avons également allégé la procédure de contrôle de qualité de l’accélérateur et des traitements par une meilleure confiance des outils. Un des objectifs est d’augmenter le nombre de patients bénéficiant de cette technique innovante.

Divers

n 139

Participation des femmes aux campagnes de dépistage organisé du cancer du sein : le succès passe par les médecins de famille

Boyer B1, Boitel Y2, Morel C3, Gaucher F3, Stinès J1

1 Centre Alexis Vautrin, 54511 Vandœuvre-lès-Nancy Cedex ;
2
 Association médicale de perfectionnement postuniversitaire AMPPU 54, 8 rue Isabey, 54000 Nancy ;
3
 Association pour le dépistage des cancers Adeca 54, 2, rue du Doyen Jacques Parisot, 54501 Vandœuvre-lès-Nancy Cedex.

La participation des femmes au dépistage organisé du cancer du sein (DO) est l’enjeu central de cette action de santé publique ; les médecins généralistes doivent être mobilisés vers cet objectif. « Le dépistage organisé du cancer du sein pour les femmes de 50 à 74 ans, préconisé par le Plan Cancer, est à présent opérationnel dans tous les départements français sauf en Guyane » (J.-F. Mattéi, 16 janvier 2004) ; la participation suffisante des femmes concernées est la condition sine qua non de l’efficacité du DO sur la mortalité.
Dans les départements participant au DO en 2000, la participation était, selon l’InVS, de 43 %. Le taux nécessaire est de 70 %, le taux souhaité est de 80 %. Il est donc nécessaire d’agir sur les freins à une augmentation de la participation. Le défaut d’engagement des médecins généralistes dans le DO est l’un des principaux freins : ils ont été très peu consultés et impliqués initialement alors que 98 % d’entre eux prescrivent des mammographies, ils sont démobilisés par la lourdeur administrative du DO dont ils se sentent exclus et expriment une forte demande de formation. Leur action de promotion du DO sera majeure, en particulier sur deux types de femmes : les femmes socio-économiquement fragiles fréquentant un médecin de famille qui n’encourage pas à participer au DO, et les femmes connaissant mieux le système de soin qui privilégient le dépistage hors campagne par souci de « qualité apparente ».
Nous dégageons les conditions d’une meilleure adhésion des médecins généralistes au DO en nous appuyant sur les résultats d’une enquête auprès des structures de gestion du DO de l’ensemble des départements français et ceux d’une enquête auprès de l’ensemble des médecins généralistes installés en Meurthe-et-Moselle. Une revue de la bibliographie récente est réalisée. Il appartient à tous les acteurs de la communauté médicale de rendre efficace le DO : les médecins généralistes sont un acteur central du système de soin et doivent être impliqués dans ce cadre.

n 140

Évaluation multiparamétrique des réactifs de l’Access 2® Immunoassay System (Beckman Coulter)

Dortet L1, Drouard-Troalen L1, Alliot L2, Bonnay M1, Troalen F3

1 Service de biochimie clinique et
3 service de biologie oncologie, Institut Gustave Roussy, 39, rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex ;
2
 Beckman Coulter France SA, Paris Nord 2, 33, rue des Vanesses, BP 50359, Villepinte, 95942 Roissy CDG Cedex.

Dans le cadre d’un changement d’automates, une évaluation préalable du futur système de dosage a été réalisée. Ainsi, pour la détermination du bilan thyroïdien (TSH, T3 et T4 libre), le dosage de la troponine et le dosage du cortisol ; les résultats obtenus avec l’Access 2® Immunoassay System (Beckman Coulter) ont été comparés à ceux obtenus, en routine, sur l’Immulite 2000® (Diagnostic Products Corporation). Les coefficients de corrélation obtenus pour les dosages de la TSH (n = 213), la T3 (n = 116), la T4 libre (n = 112), la troponine (n = 139) et le cortisol (n = 11) sont respectivement de 0,991, 0,784, 0,946, 0,976 et 0,987. Cependant, bien que la corrélation soit bonne, la concordance ne l’est pas forcément. Ainsi, pour la T4 libre, les résultats obtenus avec l’Access 2® sont en moyenne 27,3 % inférieurs à ceux obtenus avec l’Immulite 2000® ; ou encore pour la détermination de la troponine pour laquelle les cut off sont différents entre les deux automates (seuil décisionnel pour l’infarctus du myocarde 0,4 ng/ml pour l’Immulite 2000® et 0,06 ng/ml pour l’Access 2®).
Pour les dosages de certains marqueurs tumoraux (AFP, PSA total, CA15.3, CA125, CA19.9, HCG, ACE), les résultats obtenus avec l’Access 2® ont été comparés à ceux déterminés en routine avec le Kryptor® (Brahms) ou le kit RIA-gnost® HCG (CIS Bio international). Les résultats de l’évaluation montrent respectivement pour l’AFP (n = 174), le PSA total (n = 165), le CA125 (n = 200), le CA19.9 (n = 104), le CA15.3 (n = 215), l’HCG (n = 166) et l’ACE (n = 262) des coefficients de corrélation de 0,999, 0,998, 0,984, 0,990, 0.,905, 1,000 et 0,983.
En conclusion, les analyses réalisées avec l’Access 2® semblent être correctement corrélées à celles effectuées actuellement sur les automates de routine et ne nécessiteront que quelques adaptations de bornes décisionnelles pour les cliniciens.

n 141

Étude épidémiologique des lymphomes malins non hodgkiniens ganglionnaires de l’adulte en Algérie

Boudjerra N1, Saidi D2, Hamladji RM1, Abad MT3, Hamdi S4, Griffi F5, Ouchemane Z6, Ramaoun M, Djouadi K7, Mesli N8, Allouda M9, Talbi M10, Ouarlhent Y11

1 Service hématologie EHS Pierre et Marie Curie, Alger,
2 Service hématologie, CHU Oran,
3
 Service hématologie, CHU Blida,
4 Service hématologie, CHU Sétif,
5 Service hématologie, CHU Annaba,
6
 Service hématologie, CHU Tizi-Ouzou,
7 Service hématologie hôpital central de l’armée Ain Naadja,
8 Service hématologie, CHU Tlemcen,
9
 Service hématologie, CHU Sidi Belabbes,
10 Service de médecine, Hôpital Béchar,
11 Service hématologie Hôpital Batna.

Ce travail a pour but d’étudier l’incidence et les caractéristiques épidémiologiques des lymphomes malins non hodgkiniens (LMNH) ganglionnaires de l’adulte sur le territoire algérien.
Matériel et méthodes. L’étude a porté sur les dossiers des patients traités dans les 13 services d’hématologie existant en Algérie, sur une période allant de 1993 à 2002. Les enfants âgés de moins de 16 ans et les patients ne présentant pas d’atteinte ganglionnaire ont été exclus de l’étude.
Résultats
. 1723 dossiers ont été colligés, le sex ratio était de 1,62 (F/M), l’âge moyen au diagnostic est de 49 ans (16-98), la profession la plus fréquemment rencontrée est celle de fellah (travailleur de la terre) 18 %, puis arrive en deuxième position le commerçant 8 %. Le taux d’incidence selon les régions est de 5,04 % pour la région sanitaire centre, 6,25 % pour la région sanitaire ouest, 5,86 % pour la région sanitaire est, 4,23 % pour la région sanitaire sud -ouest, 1,46 % pour la région sanitaire sud-est. L’incidence moyenne est de 4,65 % (0-11,50).
Le diagnostic a été porté sur un examen anatomopathologique dans 1603 cas, dans 80 cas sur un examen cytologique, dans 40 cas un diagnostic de lymphome a été posé sans précision du type histologique. Sur les 1603 cas, les lymphomes agressifs représentent 40,48 %, les lymphomes indolents 57,8 %, inclassables 2,06 %. Les lymphomes folliculaires représentent 14,66 %
Conclusion. Ce travail nous a permis d’établir nos données épidémiologiques nationales, qui constitueront une base de données en vue d’une étude prospective.

n 142

L’exposition professionnelle : une cause éventuelle de cancer peu recherchée en Tunisie

M’barek B, Kochbati L, Maalej M

Service de Radiothérapie, Institut Salah Azaiz, Bab Saadoun, Tunis.

L’origine professionnelle des cancers est rarement recherchée. Ce travail cherche à démontrer la sous-estimation de cette cause éventuelle du cancer à travers une étude prospective et une autre rétrospective.
Une recherche prospective d’une éventuelle exposition aux agents carcinogènes pour le cancer du poumon selon la classification du Centre international de recherche sur le cancer a été réalisée moyennant un interrogatoire type mis à la disposition des médecins effectuant la première consultation. Cet interrogatoire simple, ne comportant qu’une liste de professions et de secteurs professionnels, a été rempli pour chaque patient adressé pour la prise en charge d’un cancer du poumon histologiquement prouvé. Parallèlement, une étude rétrospective recherchant les données se rapportant à l’exposition professionnelle dans les cas de cancers de la vessie a été réalisée.

Cent sept patients atteints de cancers du poumon ont été interrogés. Parmi ces patients 7 cas d’exposition à un agent carcinogène possible pour le cancer du poumon selon la classification du Centre international de recherche sur le cancer ont été retrouvés. L’exposition à l’arsenic a été retrouvée chez 4 malades travaillant dans la métallurgie (2 cas), dans une mine de plomb et zinc (1 cas) et dans le traitement des vignes par des pesticides (1 cas). L’exposition à l’amiante a été retrouvée chez 3 malades travaillant dans la construction navale (1 cas), dans les chantiers des bâtiments (1 cas) et dans l’entretien des plaques de frein de grosses locomotives (1 cas). L’étude rétrospective a révélé un manque des données se rapportant à l’éventuelle exposition professionnelle dans les cancers de la vessie. Ces données n’ont pas été correctement recherchées dans les 43 dossiers étudiés.

L’origine professionnelle des cancer est sous-estimée en Tunisie car rarement recherchée. La recherche systématique d’une origine professionnelle, devant tout cas de cancer, permet une meilleure estimation de leur fréquence, l’indemnisation du malade et l’élaboration d’une stratégie de prévention primaire.

n 143

Dépistage organisé du cancer du sein dans l’Essonne

Bernoux A1, Michel N1

ADMC, Hôpital de Bligny, BP 4, 91640 Briis-sous-Forges

L’ADMC a mis en place depuis janvier 2000 un dépistage organisé du cancer du sein dans le département de l’Essonne : 58 385 mammographies de dépistage ont été réalisées entre 2000 et 2003. Parmi les 47 196 femmes ayant réalisé un premier dépistage dans le cadre de la campagne, 17 % n’avaient jamais eu de mammographie, 24 % avaient eu une mammographie qui remontait à plus de 3 ans et 16 % à 3 ans. Au total, 57 % de femmes étaient mal suivies. 243 cancers ont été dépistés, dont 81 % étaient invasifs. Parmi les cancers invasifs dépistés, 78 % étaient des T1 et 70 % ne présentaient pas d’envahissement ganglionnaire. Le taux de participation à la campagne est de 25 %.

Au total, la campagne de dépistage du cancer du sein organisée dans l’Essonne présente des indicateurs de qualité et d’efficacité satisfaisants. Cela devrait inciter les médecins et les femmes à s’inscrire davantage dans cette campagne de dépistage organisé.

Qualité de vie

n 144

Consultation d’annonce « médecin-infirmière » en cancérologie : évaluation de deux ans d’activité

Labourey JL, Suran C, Lhomme-Leoment J, Lavau-Denes S, Martin J, Pepion M, Quintane MA, Bouvet-Venat L, Genet D, Tubiana-Mathieu N

Service d’oncologie médicale, CHU Dupuytren, 87042 Limoges Cedex.

Dans le cadre du projet du service d’oncologie médicale de Limoges, dont l’objectif majeur était la qualité de l’accueil des patients, il a été proposé, en 1998, d’associer à la consultation médicale (CM) une consultation infirmière (CIDE).

But. Améliorer l’information du patient sur, entre autres, sa maladie et sa prise en charge thérapeutique ; améliorer les transmissions au sein de l’équipe soignante, en particulier sur les éléments abordés lors de l’entretien médecin-patient.

Matériels et méthode. La CIDE est proposée aux nouveaux patients ou lors de rechute. Avec l’accord du patient, elle débute, lors de la CM, par un recueil écrit des données. Elle se poursuit ensuite dans le bureau de l’IDE. Il y est effectuée une reformulation de données de la CM et tout point jugé utile y est abordé. À cette occasion un classeur de liaison « ville-hôpital » ainsi que différents supports informatifs sont remis au patient. La CIDE se termine par une visite du service et la présentation à l’équipe soignante. Si besoin une deuxième consultation peut être programmée. L’évaluation de la CIDE a été réalisée auprès des patients et des IDE du service par un questionnaire anonyme comportant des questions ouvertes et fermées.

Résultats. Sur 2000-2001 et 2001-2002, respectivement 146 et 150 patients ont été interviewés ainsi que 21 IDE de l’équipe en 2000. Les patients trouvaient que les informations et les documents remis en CIDE étaient complets dans 27 et 34 % des cas et incomplets dans moins de 5 %. La visite du service et la présentation de l’équipe sont apparues positives dans 95 % des cas. Vingt pour cent des patients souhaitaient une 2e CIDE et une fois sur deux en présence d’un membre familial. L’accueil au premier traitement a été ressenti comme excellent dans 48 % et 61 %. Toutes les IDE interrogées lisent le compte rendu fait par leur collègue durant la CM. Vingt pour cent estimaient qu’il manquait des détails sur l’abord psychologique et 10 % que le rapport était insuffisamment précis.

Conclusion. Les consultations d’annonce « médecin-infirmière » sont un maillon informatif essentiel, tant pour le patient que pour l’équipe soignante. Cette évaluation a permis une modification des pratiques début 2004.

n 145

Efficacité antalgique de l’hydromorphone LP dans la douleur cancéreuse

Poulain P

Institut Gustave-Roussy, 39, rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex.

L’objectif de cet essai était d’évaluer l’efficacité antalgique et la tolérance de l’hydromorphone LP chez des patients cancéreux intolérants à la morphine.
Méthodes. Il s’agissait d’un essai multicentrique, en ouvert, réalisé auprès de patients cancéreux douloureux présentant une intolérance à la morphine. Après accord d’un CCPPRB et obtention de leur consentement éclairé, les patients recevaient pendant 28 jours de l’hydromorphone LP. L’efficacité antalgique était évaluée toutes les semaines à l’aide des mesures suivantes : intensité douloureuse sur une échelle numérique (EN) (0 = absente, 10 = maximale) et une échelle verbale simple (EVS) (0 = absente, 3 = sévère) ; différences d’intensité douloureuse par rapport à l’inclusion, classées selon 3 grades : amélioration, stabilisation, aggravation ; soulagement sur une échelle de pourcentages en 11 points (0 % = nul, 100 % = total) ; appréciation globale par le patient, cotée sur une EVS (0 = nulle, 3 = excellente) ; préférence du patient pour l’un ou l’autre traitement ; recours à un traitement de secours (paracétamol et/ou morphine LI). La tolérance était évaluée à l’aide d’un score global de tolérance (EVS ; 0 = mauvaise, 3 = excellente). L’intensité des signes d’intolérance aux opioïdes était évaluée sur une EVS (0 = absent, 3 = sévère).

Résultats. Soixante-trois patients ont été inclus, 61 ont été analysés (60,4 ± 10,9 ans), 2 n’ayant pas reçu le traitement ; 77 % d’entre eux présentait une douleur d’intensité modérée à sévère à l’inclusion. Ils recevaient à l’inclusion 222,0 ± 246,4 mg de morphine et à J28, 72,8 ± 146,2 mg d’hydromorphone LP. L’intensité douloureuse a diminué au cours de l’essai : 5,5 ± 2,3 à l’inclusion versus 3,1 ± 2,3 à J28. Une amélioration de l’intensité douloureuse a été notée chez 61 % des patients à J28. Le pourcentage de patients ayant un soulagement supérieur à 50 % a augmenté : 62 % à l’inclusion versus 87 % à J28. Le pourcentage de patients présentant une douleur sévère a diminué : 44 % à l’inclusion versus 8 % à J28. L’efficacité du traitement a été jugée bonne ou excellente par 66 % des patients à J28 versus 38 % à l’inclusion. A J28, 75 % des patients ont déclaré préférer le traitement par hydromorphone LP. Le pourcentage de patients ayant eu recours à un traitement de secours a diminué au cours de l’essai (morphine LI 84 % versus 47 %, paracétamol 72 % versus 62 %). Le score global moyen de tolérance a augmenté significativement (p < 0,0001) de 0,5 ± 0,6 (morphine) à 1,8 ± 0,9 à J28 (hydromorphone LP), ce score s’améliorant chez 74 % des patients. Le pourcentage de patients présentant des signes d’intolérance aux opioïdes d’intensité modérée ou sévère a diminué significativement au cours de l’essai.

Conclusion. Chez les patients cancéreux douloureux intolérants à la morphine, l’hydromorphone LP est une alternative efficace et bien tolérée, s’accompagnant d’une amélioration de la symptomatologie douloureuse et d’une amélioration des signes d’intolérance aux opioïdes.

n 146

Le cancer du sein : un retentissement important sur la qualité de vie de l’entourage

Serin D1, Brun-Strang C2, Auquier P3, Auray JP4, Genot JY5, Pelicier N6, Roché H7, Romestaing P8

1 Clinique Ste Catherine, 84082 Avignon ;
2 Novartis-Pharma SAS, 92506 rueil-Malmaison ;
3 Laboratoire de Santé Publique, 13385 Marseille ;
4 Université Lyon 1, 69100 Villeurbanne ;
5 Centre F. Baclesse, 14000 Caen ;
6
 Hôpital Européen G. Pompidou, 75015 Paris ;
7 Centre Claudius Regaud 31300 Toulouse ;
8 Hôpital Lyon Sud, 69495 Pierre-Bénite.

L’objectif de cette étude consiste, d’une part, à évaluer l’impact du cancer du sein sur la qualité de vie (QV) de la femme atteinte et, d’autre part, la perception de la QV de la femme par son entourage et l’impact de la maladie sur le conjoint et/ou l’un des enfants.

Méthode. Enquête prospective portant sur une population de femmes atteintes de cancer du sein non métastatique, incluses plus de 3 mois et moins de 2 ans après la fin des traitements actifs en phase adjuvante et entourées d’un conjoint et/ou d’un enfant de plus de 18 ans. La mesure de la QV de la femme est réalisée par l’échelle Functional Assessment of Cancer Therapy-Breast (Fact-B). Des autoquestionnaires de QV ont été construits pour l’entourage sur le modèle du Fact-B et sur la base d’entretiens conjoints et enfants. Ces questionnaires explorent l’implication dans la maladie, l’impact familial, psychologique et émotionnel, socioprofessionnel et économique.
Résultats
. 103 médecins ont participé à l’étude. 607 questionnaires ont été retournés entre décembre 2002 et décembre 2003. Parmi eux, 201 questionnaires femmes, 164 conjoints et 95 enfants ont été exploités. L’ancienneté moyenne du diagnostic est de 2 ans et demie. Les femmes incluses sont âgées de 56 ans et actives pour 48 % d’entre elles. La longévité moyenne de vie en couple est de 30 ans, le nombre moyen d’enfants est de 2 et l’âge du premier enfant est de 28 ans. 95 % ont été traitées par radiothérapie, 76 % par hormonothérapie et 65 % par chimiothérapie. Les conjoints sont actifs dans 55 % des cas, les enfants dans 60 % des cas. 59 % n’habitent plus chez leurs parents et 65 % sont des filles. La principale inquiétude des patientes est qu’un autre membre de leur famille ait, un jour, la même maladie. Elles sont satisfaites de la manière dont elles font face à la maladie (68 %) et de leur qualité de vie actuelle (60 %) mais près d’une patiente sur deux (48 %) n’a pas accepté sa maladie. 91 % disent ne pas perdre espoir mais, d’après leur entourage, le risque de rechute reste leur principale angoisse vis-à-vis de la maladie. Dans 83 % des cas, le conjoint est désigné comme étant le principal soutien. L’enfant a tendance à majorer l’impact du cancer sur le quotidien de sa mère. Pour lui la maladie laisse des séquelles (62 %) et est très difficile à surmonter (55 %). Il juge la QV de sa mère moins bonne que ce que sa mère n’exprime. Pour 99 % des répondants, le cancer du sein n’est pas une maladie chronique. Les premiers résultats de cette étude permettent de révéler les zones de concordances et de discordances quant à l’impact de la pathologie selon trois points de vue : les femmes, leurs conjoints et leurs enfants. Ils permettront d’optimiser la prise en charge des patientes dans une perspective plus globale.

Pharmacologie expérimentale

n 147

Surexpression de la protocadhérine PC dans le cancer de la prostate en échappement hormonal et son implication dans l’activité transcriptionnelle du récepteur des androgènes

Queires L1, Terry S1, Gil-Diez S1, De La Taille A2, Ceraline J3, Tran PL4, Abbou CC2, Buttyan R*, Chopin DK1 et Vacherot F1

1 Inserm-EMI 03 37, Créteil ;
2 Service d’urologie, hôpital Henri Mondor, Créteil ;
3 EA3430, hôpitaux universitaire de Strasbourg ;
4 UMR 8029 ENS de Cachan ;
* Département d’urologie, Université de Columbia, New York.

Le cancer de la prostate est le premier cancer diagnostiqué chez l’homme. Le traitement de sa forme métastatique est basé sur l’induction de l’apoptose des cellules tumorales par le blocage du récepteur des androgènes (RA). Néanmoins, certaines de ces cellules survivent à la privation hormonale et sont à l’origine du développement d’une tumeur résistante. Notre équipe travaille sur l’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans l’acquisition de la résistance au traitement hormonal du cancer prostatique afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé un nouveau membre de la famille des protocadhérines, la protocadhérine PC (Pcdh-PC). En utilisant un modèle de xénogreffe des cellules tumorales prostatiques (LNCaP), nous avons démontré que son expression est induite au cours de l’acquisition de la résistance à la suppression des androgènes. La transfection des cellules prostatiques par un vecteur permettant l’expression de cette protéine leur confère une résistance à l’apoptose induite par le phorbol ester. Les techniques de RT-PCR semi-quantitative et d’hybridation in situ ont montré que la Pcdh-PC est exprimée de façon préférentielle par les cellules tumorales du cancer prostatique hormonorésistant. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de ce gène serait associée à la résistance des cellules tumorales prostatiques au traitement hormonal. Par immunoprécipitation, nous avons montré que la Pcdh-PC se lie à la β-caténine. Dans les cellules surexprimant la Pcdh-PC, une distribution anormale de la β-caténine au niveau cytoplasmique et nucléaire a été observée ainsi qu’une augmentation significative de l’activité du facteur de transcription LEF/TCF. Par ailleurs, nous avons observé que l’augmentation de l’expression de la Pcdh-PC entraîne une diminution de l’activité transcriptionnelle du RA.
L’ensemble de nos travaux démontre le rôle potentiel de la Pcdh-PC dans la résistance des cellules tumorales de l’effet apoptotique induit par le traitement hormonal. Son mécanisme d’action passe vraisemblablement par la modification de l’expression intracellulaire de la β-caténine ainsi que l’activation de LEF/TCF.

n 148

A recombinant humanized anti-insulin-like growth factor receptor type I antibody (h7C10) enhances the antitumor activity of vinorelbine and anti-epidermal growth factor receptor therapy against human cancer xenografts

Goetsch L, Gonzalez A, Leger O, Pauwels PJ, Haeuw JF, Corvaia N

Centre d’Immunologie Pierre Fabre, 5 av. Napoléon III, BP 497 74160, St Julien en Genevois, France.

Interaction ofinsulin-like growth factor receptor I (IGF-IR) with its ligands has been reported to induce cell proliferation, transformation and blockade of cell apoptotic functions. IGF-IR is overexpressed on numerous tumor cell types and its blockade could be of importance for anti-cancer therapy. We have generated a humanized anti-IGF-IR antibody h7C10 that blocks in vitro IGF-I and IGF-II induced cell proliferation of MCF-7 breast cancer cells. Analysis of the IGF-I transduction cascade demonstrated that the humanized anti-IGF-IR antibody and its murine parental form block IGF-I-induced tyrosine phosphorylation, both its β -chain and IRS-1 tyrosine phosphorylation. This presumably leads to cell cycle arrest and, consequently, growth inhibition. Treatment of nude mice bearing either human breast cancer cells (MCF-7) or non small lung cancer cells (A549) with h7C10, or its murine parental form 7C10, inhibited significantly tumor growth. An almost, complete inhibition of A549 tumor growth was observed when mice were treated with the anti-IGF-IR antibody combined with either a chemotherapeutic agent, Vinorelbine, or an anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody, 225. Combined therapy prolonged significantly the life span of mice in an orthotopic in vivo model of A549 ; the combination of the anti-IGF-IR antibody with an anti-EGFR antibody was superior to the Vinorelbine combination. The present results indicate that the humanized anti-IGF-IR antibody h7C10 has a great potential for cancer therapy when combined with either a chemotherapeutic agent or an antibody that targets other growth factor receptors, such as the epidermal growth factor receptor.

n 149

Traitement de tumeurs cutanées par électrochimiothérapie : résultats cliniques dans le cas du sarcoïde du cheval

Rols MP1, Golzio M1, Tamzali Y2, Teissié J1

1 IPBS CNRS, UMR 5089, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse ;
2 École Nationale Vétérinaire de Toulouse, 23 chemin des Capelles, 31076 Toulouse.

L’électrochimiothérapie est une thérapie anticancéreuse récente dans laquelle la perméabilisation transitoire des cellules par application d’impulsions électriques induit l’augmentation significative de la pénétration et ainsi de la toxicité de drogues antitumorales dans les cellules cancéreuses. Cette méthode a été appliquée avec succès au traitement de tumeurs chez des modèles animaux et chez l’homme lors d’essais cliniques en phase I-II en utilisant des antimitotiques. L’utilisation de la méthode en clinique humaine nécessite à présent sa validation sur le gros animal. Les tumeurs cutanées sont fréquentes chez les équidés. Le sarcoïde en représente plus de 50 %. La chimiothérapie par injection intratumorale de cisplatine a une place prépondérante parmi les traitements dits conservateurs. Mais, pour l’instant, aucune thérapeutique n’assure 100 % de guérisons et les récidives sont fréquentes. Ce travail décrit la première utilisation de la méthode sur le sarcoïde du cheval. Plusieurs animaux, présentant un nombre et une localisation de tumeurs variés, ont été inclus dans le protocole. Le traitement est réalisé sous anesthésie générale de courte durée. Suite à l’injection intratumorale de cisplatine, des impulsions électriques sont appliquées directement sur la peau au niveau des tumeurs. Deux à quatre séances de traitement sont réalisées à deux semaines d’intervalle. Les chevaux ont bien supporté le traitement. Aucun effet secondaire n’a été observé, même dans le cas d’un nombre d’impulsions élevé ou lorsque plusieurs traitements consécutifs ont été appliqués. 25 chevaux ont été traités. 10 d’entre eux présentent une éradication des tumeurs sur une période de surveillance post-traitement supérieure à quatre années. Des effets antitumoraux ont été observés avec un pourcentage de réponse objective de 100 %. Ces résultats, obtenus dans le cadre de tumeurs spontanées développées chez l’animal de compagnie à des stades d’évolution différents et traitées par un anticancéreux utilisé en clinique humaine, confirment les potentialités de l’électrochimiothérapie en clinique humaine.

1. Mir LM et al. Br J Cancer 1998 ; 77 : 2336-42.

2. Tamzali Y, Teissié J, Rols MP. Revue Méd Vét 2001 ; 8-9 : 605-9.

3. Rols MP, Tamzali Y, Teissie J. Bioelectrochemistry 2002 ; 55 : 101-5.

4. RolsMP, Giraud P, Suc E, Bachaud JM, Teissié J. Melanoma Res 2000 ; 10 : 468-74.

n 150

Le trioxyde d’arsenic induit l’apoptose des monocytes humains en culture primaire lors de la différenciation macrophagique : implication du facteur nucléaire de transcription kappaB

Lemarié A, Morzadec C, Fardel O, Vernhet L

Inserm U620, Détoxication et Réparation Tissulaire, Faculté des Sciences Biologiques et Pharmaceutiques, Université de Rennes 1, 2 avenue du Pr Léon Bernard, 35043 Rennes.

Le trioxyde d’arsenic (As2O3, Trisenox®) est utilisé avec succès dans la prise en charge des leucémies aiguës promyélocytaires. Les effets thérapeutiques de ce métalloïde résultent, à très faibles concentrations, d’une induction de la différenciation des cellules myéloïdes tumorales et, pour des concentrations de 0,5 à 2 µM, de leur mort par apoptose. L’objectif de ce travail a été de déterminer si des concentrations d’As2O3 proches des taux plasmatiques obtenus en routine chez les patients traités par le Trisenox® peuvent être toxiques vis-à-vis de cellules immunitaires normales. Pour cela, nous avons étudié in vitro les effets d’As2O3 (0,125 à 2 µM) sur la différenciation macrophagique de monocytes humains en culture primaire induite par le GM-CSF en 6 jours.
Nos résultats montrent qu’As2O3 bloque l’adhésion des monocytes et l’expression de marqueurs de différenciation macrophagique (CD71 et CD11c) de façon dose-dépendante et dès 0,25 µM. Ces effets résultent d’une apoptose des monocytes qui est de 51 % après 6 jours de traitement par As2O3 1 µM. Ce processus apoptotique est associé : 1) à l’activation des caspases 8 et 3, 2) à une toxicité mitochondriale et 3) à une réduction de l’expression de protéines anti-apoptotiques, notamment de c-FLIPL qui joue un rôle majeur dans la survie des monocytes en voie de différenciation. Après 3 et 6 jours de traitement, As2O3 (1 µM) induit également une diminution respective de 22 et 49 % de l’activité de liaison à l’ADN du facteur nucléaire de transcription-kappa B (NFκB), connu pour réguler l’expression de c-FLIPL dans divers modèles cellulaires. Le Bay 11-7082 (2,5 µM), un inhibiteur sélectif de ce facteur de transcription : 1) réduit de la même façon l’activité NFκB des monocytes, 2) bloque l’expression de c-FLIPL et 3) induit une apoptose de 57 % après 3 jours.
Au total, ce travail a permis de démontrer que de faibles concentrations d’As2O3 exercent in vitro une toxicité importante vis-à-vis des monocytes/macrophages qui jouent un rôle prépondérant dans la défense de l’organisme. As2O3 induit ainsi une apoptose caspase-dépendante des monocytes en culture primaire par un mécanisme impliquant en partie le blocage de la voie NFκB et, secondairement, une inhibition de l’expression de la protéine anti-apoptotique c-FLIPL. L’étude des mécanismes de toxicité de ce métalloïde sur la différenciation macrophagique devrait contribuer à mieux appréhender ses effets globaux au niveau immunitaire et, ainsi, à définir les bases cellulaires et moléculaires d’effets secondaires pouvant survenir dans le cadre de son utilisation clinique.

n 151

Effet de la combrétastatine A4 sur des tumeurs vésicales de rat implantées sur des souris nude : étude longitudinale préliminaire par IRM anatomique et IRM fonctionnelle sous carbogène

Thomas CD1, Walczak C1, Kaffy J2, Pontikis R2, Jouanneau J3, Volk A1

1 Inserm, Institut Curie, Recherche, Centre Universitaire, Bât. 112, 91400 Orsay ;
2
CNRS UMR 176, Institut Curie, Recherche, 26 rue d’Ulm 75005 Paris, CNRS UMR 144, Institut Curie, Recherche, 12 rue Lhomond, 75005 Paris.

Les agents, comme la combrétastatine A4 dissodium phosphate (CA-4P), se liant à la tubuline, ont un potentiel anti-angiogénique et antivasculaire pour les tumeurs malignes. L’objectif de cette étude préliminaire non invasive est d’étudier comment la croissance tumorale et le signal d’IRMf sous administration de carbogène sont modifiés par l’administration de CA-4P.
Des tumeurs vésicales de rat NBTII-FGF1 ont été implantées en sous-cutané sur le flanc de souris femelles nude. CA-4P a été injectée en ip (100 mg/kg). Les expériences ont été réalisées sur un imageur Bruker Biospec (4,7 T). Les acquisitions d’IRM étaient synchronisées avec les mouvements respiratoires. Le protocole d’imagerie comprenait une séquence rapide d’écho de spin (3 D Rare) permettant d’obtenir des images de haute qualité de la tumeur en entier et aussi de mesurer les courbes de croissance. Une séquence rapide de d’écho de gradient permettaient de réaliser une image T2* par cycle respiratoire. 80 images de 15 coupes couvrant la tumeur en entier ont été acquises durant le protocole d’administration de gaz suivant : images 1-7 (air), 8-48 (carbogène), enfin 49-80 (air). Les fractions tumorales ayant une augmentation significative de signal quand l’animal respire du carbogène (T+) ont été déterminées en comptant les voxels correspondants sur des ROI couvrant la tumeur en entier. CA-4P a diminué considérablement la croissance tumorale de toutes les tumeurs. Avant traitement, T+ varie d’une tumeur à l’autre. Nous avons observé, rapidement après l’injections de CA-4P, une diminution de T+ (environ 35 min). De plus, après examen histologique (H,E), nous avons noté la présence de zones prénécrotiques et nécrotiques correspondant aux régions qui montraient une réponse positive avant traitement et peu ou pas de réponse après traitement.
Ces résultats préliminaires montrent que la croissance des tumeurs vésicales de rat est ralentie par la CA-4P et les résultats histologiques confirment les modifications et destructions de la structure tumorale par cet agent. De plus, les analyses d’IRMf montrent, rapidement après injection de CA-4P, une diminution de T+, compatible avec une diminution de la perfusion tumorale. Dans cette étude, T+ semble être un indicateur précoce de l’action du traitement antitumoral.

n 152

In vitro and in vivo antitumour profile of N-(4-iodophenyl)-N’-(2-chloroethyl)urea (CEU-98) : preclinical study in murine colon carcinoma

Miot-Noirault E1, Mounetou E1, Degoul F1, Legault J2, Cachin F3, Communal Y3, Moins N1, Gaudreault RC2, Madelmont JC1

1 UMR-Inserm 484, rue Montalembert,BP 184, 63005 Clermont-Ferrand Cedex ;
2
 Centre de recherche, CHUQ, Hôpital Saint-François d’Assise, Quebec, G1L 3L5, Canada ;
3 Centre Jean Perrin, rue Montalembert, 63005 Clermont Fd Cedex.

Considering the importance of microtubules in mitotic spindle formation and chromosomal organization during cell division, tubulin has became one of the most prominent targets for the development of anticancer agents, especially for solid tumours. To that end, we developed a series of N-aryl -N’-(2-chloroethyl)ureas as new weak-alkylating agents that covalently bind to β-tubulin. Among them, N-(4-iodophenyl)-N’-(2-chloroethyl)urea (CEU-98), synthesized in 80 % yield from 4-iodoaniline using 2-chloroethylisocyanate, preliminary exhibited IC50 values ranging from 3.9 to 12 µM, more especially in human and murine colon carcinoma cell lines. Here, we present the in vitro and in vivo antitumour profile of CEU-98, in the CT-26 colon carcinoma murine model, making this molecule a candidate for preclinical antitumoural investigations for colorectal cancer treatments.
In vitro, cell cycle analysis of CT-26 cells treated with CEU-98 for 24 h evidenced a significant dose-dependent accumulation of cells in G2 phase, with a treated/control ratio value of 4. Western blot analysis of CEU-98 treated cells (30 and 100 µM for 24 and 48h) confirmed the formation of an additional immunoreactive β-tubulin band, corresponding to modified β-tubulin. In vivo, when subcutaneously grafted CT-26-bearing mice received 5 intratumoural injections of CEU-98, the weight of treated tumours (T) was significantly reduced by 44 % respectively to controls (C) and life span was increased by 35 %. Furthermore, this activity was maintained when CEU-98 was given IP at the MTD of 13 mg/kg, according to an intermittent schedule starting Day 1 or Day 7 post implant : T/C = 29 % for the Day-1,5,9-treatment versus 40 % for the Day-7,11,15-treatment with a 40 % life span increase.
The in vivo biodistribution of the CEU-98 labelled with iodine – 125 by direct electrophilic radioiodination in a 75 % yield and 98 % purity, was also investigated in CT-26-tumour – bearing mice : The maximum uptake of125 I-CEU-98 within the tumour was 4 % ID/g at 3 hours post injection. Interestingly, a high retention of the drug was observed within the intestinal tract, more especially within the colon. 
Considering CEU-98 antitumour profile and accumulation within intestinal tract, our results may provide a new starting point for researchs into a targeted tubulin-interacting agent for the treatment of colorectal cancer.

5. Legault et al. Cancer Res 2000 ; 60 : 985-2.

6. Mounetou et al. J Med Chem 2003 ; 46 : 5055-63

7. Miot-Noirault et al. Invest New Drugs 2004, in press.

n 153

Vectorisation de la 2’-deoxyinosine, biomodulateur du 5-fluorouracile

Fanciullino R, Giacometti S, Pourroy B, Aubert C, Piccerelle P, Ciccolini J

UPRES-EA3286 et Laboratoire de Pharmacie Galénique, UFR Pharmacie, Marseille, France.

La 2’-deoxyinosine (d-Ino) est un modulateur de la thymidine phosphorylase dont l’association au 5FU se traduit par une optimisation de l’efficacité antitumorale du traitement, in vitro et chez l’animal xénogreffé [Ciccolini et al. Clin Cancer Res 2000]. Chez l’animal, les doses massives nécessaires à l’obtention d’une modulation significative rendent toutefois problématiques les perspectives cliniques d’une telle approche. Afin d’améliorer le profil pharmacocinétique de ce modulateur, l’objectif de notre travail était de développer une forme liposomale originale le soustrayant de son important catabolisme érythrocytaire.
Après avoir mis au point une forme encapsulée stable (taille moyenne 100 nm, taux d’encapsulation 6 %, relargage à 4 h 60 %), nous avons vérifié sur la lignée tumorale d’adénocarcinome colique humain SW620 que la d-Ino-liposomale ainsi obtenue présentait un potentiel modulateur inchangé comparativement à la forme nue (sensibilisation de la lignée au 5FU, atteinte pharmacologique accrue, induction de l’apoptose précoce et tardive), tout en présentant une élimination plasmatique significativement ralentie chez le rat (clairance réduite d’un facteur 7). La protection de la d-Ino vis-à-vis du catabolisme érythrocytaire a été confirmée ex vivo par des cinétiques comparatives de dégradation sur sang total des formes nues et encapsulées.
L’amélioration du profil cinétique observée permet ainsi d’envisager la poursuite de nos associations 5FU/d-Ino chez l’animal xénogreffé à des doses inférieures à celles utilisées jusqu’alors.

n 154

Implication de la P-glycoprotéine dans la neuropathie périphérique induite par la vincristine : dualité entre les systèmes nerveux central et périphérique

Balayssac D1, Cayre A2, Authier N1, Penault-Llorca F2, Maublant J3, Eschalier A4, Coudore F1

1 Inserm E9904, Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, 28, place Henri Dunant, BP 38, 63000 Clermont-Ferrand Cedex 01, France ;
2
 Laboratoire d’Anatomie Pathologique, Centre Jean Perrin, BP 392, 63011 Clermont-Ferrand Cedex 1, France ;
3 Service de Médecine Nucléaire, Centre Jean Perrin, BP 392, 63011 Clermont-Ferrand Cedex 1, France ;
4 Inserm E9904, Laboratoire de Pharmacologie Médicale, Faculté de Médecine, 28, place Henri Dunant, BP 38, 63000 Clermont-Ferrand Cedex 01, France.

La vincristine est responsable de nombreux effets indésirables parmi lesquels la neurotoxicité qui est probablement le plus incontrôlé. Cette neurotoxicité est néanmoins contradictoire, car la vincristine est un substrat des transporteurs de la multidrug resistance (MDR) exprimés au niveau des barrières hématotissulaires du système nerveux central (SNC) et périphérique (SNP).
Dans un modèle animal de douleur neuropathique induite par la vincristine, l’expression des gènes mdr1a, mdr1b codant pour la P-glycoprotéine (Pgp), mrp1 et mrp2 codant respectivement pour les multidrug resistance proteins 1 et 2 (MRP1 et MRP2), puis l’activité des transporteurs membranaires (Pgp, MRP1 et MRP2), ont été évaluées au sein de différents échantillons tissulaires provenant du SNC et du SNP. Les résultats montrent une expression significativement plus élevée des gènes mdr1a (3 fois, p < 0,01) et mdr1b (30 fois, p < 0,05) dans le cerveau comparée aux ganglions spinaux. L’activité des transporteurs membranaires est significativement plus importante (10 fois, p < 0,05) dans le SNC comparée au SNP. La Pgp aurait un rôle de protection quantitativement inférieure dans le SNP par rapport au SNC et pourrait être finalement responsable de la forte neurotoxicité périphérique des anticancéreux substrats de la Pgp tels que la vincristine ou le paclitaxel et, a contrario, de leur faible fréquence d’effets indésirables neurologiques centraux. Chez les animaux traités, les injections de vincristine ou la neuropathie chimio-induite ont augmenté l’expression du gène mdr1a dans le cerveau (1,7 fois, p < 0,05) et dans les ganglions spinaux (1,7 fois, p < 0,001), du gène mrp1 dans le SNP (1,7 fois, p < 0,01) et l’activité des transporteurs membranaires dans le SNC (4 fois, p < 0,05) et le SNP (8 fois, p <,0,05). En conséquence, cette induction des transporteurs de la MDR pourrait diminuer la résorption dans le tissu nerveux de médicaments substrats des protéines de la MDR comme les analgésiques (morphine, antiépileptiques et antidépresseurs), expliquant en partie les difficultés pour traiter efficacement ces douleurs neuropathiques.

Travail soutenu par la ligue nationale contre le cancer (comité du Puy-de-Dôme)

n 155

AZD2171 : a novel orally active inhibitor of VEGF receptor tyrosine kinases

Hennequin LF1, Plé P1, Wedge SR2, Dukes M2, Kendrew J2, Curwen JO2, Walker M2, Ogilvie DJ2

1 AstraZeneca, Centre de Recherches, ZI La Pompelle, BP 401, 51064 Reims, France ;
2 Cancer and Infection Research and Discovery DMPK, AstraZeneca, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, UK.

Inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF)-signaling is an attractive anti-tumor target, given its pivotal role in the regulation of tumor angiogenesis and vascular permeability. VEGF signals through the endothelial cell receptors VEGF-R1 (Flt-1) and VEGF-R2 (KDR) by inducing receptor homo- or heterodimerization and stimulating intrinsic tyrosine kinase activity.
AZD2171 is a highly potent ATP competitive inhibitor of recombinant KDR and Flt-1 kinase activity in vitro (IC50 values of < 2 nM and 5 nM respectively). This compound was selected from a novel series of Indole ether quinazolines. The structure activity relationship within this series will be described, with additional reference to the pharmacokinetic and physiochemical properties of these compounds. AZD2171 demonstrates excellent selectivity versus a range of tyrosine and serine/threonine kinases. Similarly, AZD2171 inhibited VEGF stimulated HUVEC proliferation with an IC50 value of 0.0004 µM. To model vessel sprouting in vitro, a modified fibroblast/endothelial cell co-culture system was used (TCS Angio-kit). AZD2171 demonstrated profound activity in this assay, reducing vessel area, length and branching at subnanomolar concentrations. AZD2171 (250 µg/kg iv) was found to completely reverse a hypotensive change induced by an intravenous bolus injection of VEGF (32 µg/kg). Chronic inhibition of VEGF signaling has been shown to prevent ossification during long bone growth, by inhibiting vascular invasion of the growth plate. AZD2171 (1.25-5 mg/kg/day) inhibited endochondral ossification significantly, producing a dose-dependent increase in the hypertrophic chondrocyte zone. To evaluate antitumor activity in rat, athymic animals bearing established xenografts were treated once daily with AZD2171 (0.1-3 mg/kg po) for 28 days. A dose-dependent inhibition of tumor growth was observed, with statistically significant activity at all doses and > 90 % growth inhibition at 3 mg/kg/day.
AZD2171 is currently in Phase I clinical development and has potential for activity in a wide range of tumors.

n 156

L’expression de la méthylguanine-méthyltransférase interfère avec le métabolisme phospholipidique dans les cellules de tumeurs de mélanome

Morvan D1, Rio P1, Pegg A2, Madelmont JC1, Demidem A1

1 UMR Inserm 484, Clermont-Ferrand, France ;
2
Pensylvania State University, Philadelphia, PA.

Le traitement par chloroéthylnitrosourée (CENU) induit de profondes altérations du métabolisme phospholipidique (Plp) dans les cellules parentales de tumeurs de mélanome B16. Certains de ces changements, tels que la chute du rapport de la concentration de phosphocholine (PC) à celle de phosphoéthanolamine (PE), sont irréversibles et accompagnent une diminution de l’agressivité des cellules parentales B16 traitées. Les cellules de mélanome B16 n’expriment pas la protéine de réparation de l’ADN, de manière constitutive la méthylguanine-methyltransferase (MGMT).
Afin de déterminer si l’expression de la MGMT pouvait modifier le phénotype des cellules de mélanome, des cellules de mélanome murin B16 ont été transfectées avec le gène codant pour l’enzyme de la MGMT humaine. Après transfection, plusieurs clones MGMT+ ont été obtenus, exprimant entre 300 et 3 000 fmol/mg protéines, activité déterminée par HPLC. Les cellules de mélanome B16 transfectées ont été cultivées pendant plusieurs semaines, maintenues en monocouche cellulaire en présence de 0,5 mg/ml de généticine afin de prévenir la perte des plasmides. Les études de phénotype ont utilisé comme contrôle des cellules B16 transfectées par le plasmide vide (MGMT-). Le métabolisme Plp a été analysé par spectroscopie RMN du proton à 500 MHz en sonde HRMAS, une technique maintenant validée dans cette application (1), et permettant d’étudier des cellules intactes avec une qualité analogue à celle d’extraits cellulaires. Une attention particulière a été portée aux dérivés Plp hydrosolubles PC et PE.
Nos résultats ont montré que : 1) l’expression de la MGMT n’affecte pas la prolifération cellulaire, 2) l’expression de la MGMT induit une augmentation du niveau de PE intracellulaire, 3) le rapport PC/PE est corrélé négativement avec le taux d’expression de la MGMT. La baisse du rapport PC/PE en relation avec l’expression de la MGMT reste moindre que celle observée dans le mélanome B16 parental, comme réponse au traitement par CENU. La baisse du rapport PC/PE dans les cellules MGMT+ témoigne d’une baisse d’agressivité par rapport aux cellules MGMT–, la cellule palliant un déficit d’agressivité par la disponibilité d’un nouveau système de réparation, d’un rééquilibrage de cascades effectrices de la signalisation cellulaire et/ou d’un remodelage membranaire.

n 157

Effets métabolique et cellulaire de la carence en méthionine sur les cellules de mélanome B16

Guénin S1, Morvan D1, Madelmont JC1, Demidem A1

1 UMR 484 Inserm, 63000 Clermont-Ferrand, France

Il a été montré sur des receveurs murins C57Bl6 porteurs de tumeurs de mélanome B16, qu’un régime alimentaire carencé en méthionine (Met) pendant la période du traitement par chloroéthylnitrosourée (CENU) renforçait l’effet du traitement chimiothérapeutique seul sur l’inhibition de la croissance tumorale. D’autres études ont démontré que le traitement par CENU augmentait le taux de créatine intratumoral et diminuait le transport des groupements méthyles par la phosphatidyléthanolamine-N-méthyltransférase (PEMT), méthyltransférase intervenant dans la synthèse de phosphatidylcholine. L’objectif de cette étude a été d’analyser certains effets cellulaires et métaboliques induits par la carence en Met.
Les cellules de mélanome B16 ont été cultivées en milieu complet (Met+) ou carencé (Met) en Met sur une période de 8 jours. L’étude du cycle cellulaire a été réalisée par cytométrie en flux. Le métabolisme de la Met a été étudié par : 1) dosage enzymatique de l’activité de la PEMT, 2) analyse du contenu intracellulaire des dérivés du métabolisme de la Met (créatine, taurine) par spectroscopie RMN-1H sur cellules entières.
La carence en Met provoque : 1) des phénomènes de blocage en phase G1 du cycle cellulaire (> 80 % versus 55 %, Met versus Met+, Mann-Whitney Test), 2) un effondrement précoce du taux de créatine, une baisse différée de la taurine, une diminution de la concentration protéique intracellulaire pouvant aller jusqu’à 45 % (p < 0,01, Met versus Met+), 3) une augmentation de l’activité de la PEMT de 1,5 à 3 fois (p < 0,01, Met- versus Met+). Ces observations nous conduisent à définir un phénotype de type carencé en Met. Après remise en milieu complet, les différents caractères du phénotype de type carencé récupèrent dans des délais variables.
La carence en Met et le traitement par CENU semblent avoir des cibles communes : prolifération cellulaire, transméthylations avec les variations du taux de créatine et de l’activité de la PEMT. Ces cibles communes pourraient participer à l’explication mécanistique de la potentialisation CENU-carence en Met.

n 158

Discovery of new and highly potent c-Src inhibitors

Plé PA1, Green TP2, Hennequin LF1, Curwen J2, Fennell M2, Allen J2, Lambert-van der Brempt C1, Costello G2

1 AstraZeneca, Centre de Recherches, ZISE La Pompelle BP 1050, 51689 Reims Cedex 2, France ;
2 AstraZeneca Pharmaceuticals, Mereside, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire SK10 4TG, UK.

Deregulated activity of the non-receptor tyrosine kinase c-Src is believed to result in signal transduction, cytoskeletal and adhesion changes, ultimately promoting a tumor invasive phenotype. The discovery of a new classes of anilinoquinazoline inhibitors with high affinity and specificity for the tyrosine kinase domain of the c-Src enzyme will be presented. Special attention was directed towards finding selective inhibitors against KDR tyrosine kinase in order to ensure that the in vivo profile of a specific Src inhibitor could be determined. The 4-aminobenzodioxole quinazoline series gave compounds with excellent potency and selectivity (Src < 4 nM ; KDR : Src ratio > 1000 folds ; cell IC50 : 100 nM or less). C-5 substitution of the quinazoline was investigated for the first time and gave very potent and selective compounds when coupled with 4-amino-5-halogenobenzodioxoles. The most interesting molecules were evaluated in vivo and displayed good pharmacokinetics (detectable levels at 24 hrs following a 20 mg/kg oral dose in rat). Compounds such as 4-aminobenzodioxole quinazolines were shown to be potent inhibitors of tumor growth in a c-Src transformed 3T3 xenograft model in vivo, resulting in more than 90 % growth inhibition at doses as low as 6 mg/kg p.o. once daily. This research program was successful in nominating AZD0530 for development.

n 159

Chimiorésistance aux inhibiteurs de topo-isomérases induite par la surexpression de la O6 méthylguanine-DNA-méthyltransférase (MGMT) dans des lignées mélaniques

Passagne I1, Evrard A1, Depeille P1, Cuq P1, Cupissol D1, Vian L1

1 Laboratoire de Toxicologie du médicament, 15, avenue Charles Flahault, BP14491, 34093 Montpellier Cedex 05.

Dans le mélanome malin, la fréquence élevée de tumeurs chimiorésistantes, notamment aux agents alkylants (témozolomide, nitrosourées, chlorambucil…), est souvent liée à la réparation des lésions chimio-induites par l’enzyme O6-méthylguanine DNA-méthyltransférase (MGMT). Nous avons précédemment démontré que l’expression de la MGMT diminuait l’effet cytotoxique du témozolomide et des nitrosourées. Une étude récente a également montré que le taux de réponse des patients aux agents alkylants était augmenté par l’administration concomitante de camptothécine, un inhibiteur de topo-isomérase I.
Afin d’évaluer l’impact de la MGMT sur la chimiosensibilité des cellules mélaniques aux inhibiteurs de topo-isomérases (camptothécine, doxorubicine, étoposide), la lignée CAL77 (Mer-) a été transfectée stablement par l’ADNc de la MGMT. L’expression de la MGMT dans les différents clones a été analysée par western-blot, RT-PCR et mesure d’activité enzymatique. Une autre approche a consisté en l’inhibition de la MGMT, par le substrat suicide O6-benzylguanine, dans la lignée mélanique A375 (Mer+). La viabilité des cellules mélaniques a été ensuite évaluée par des tests au rouge neutre et des tests clonogéniques. Les résultats obtenus ont montré que la différence de survie cellulaire entre les cellules sauvages et transfectées était significative avec des ratios compris entre 2 et 4. Pour exemple, la CI50 de l’étoposide passe de 6 µM à 26 µM après surexpression de la MGMT. L’inhibition de la MGMT par le substrat suicide O6-benzylguanine dans la lignée A375 a confirmé l’implication de la MGMT. Le co-traitement avec cet inhibiteur a entraîné la potentialisation du pouvoir cytotoxique des inhibiteurs de topo-isomérases avec une diminution de la capacité des cellules à former des colonies de 100, 65 et 50 % respectivement, pour la doxorubicine, l’étoposide et la campothécine. Une préincubation avec un anticancéreux provoquant une alkylation de la guanine, comme le témozolomide, permet d’annuler la chimiorésistance aux inhibiteurs de topo-isomérases. L’hypothèse d’une séquestration des topo-isomérases par des adduits de type alkylguanine est à envisager. A l’heure actuelle, la MGMT n’ayant été impliquée que dans la chimiorésistance d’anticancéreux à pouvoir alkylant, d’autres études mécanistiques sont nécessaires afin de mieux comprendre ce mécanisme de chimiorésistance aux inhibiteurs de topo-isomérases.

n 160

Le transfert du gène codant pour la nitroréductase bactérienne dans des cellules endothéliales prolonge la survie de souris porteuses d’une tumeur, suite au traitement par la pro-drogue CB1954

Benouchan M, Do Nascimento F, Rocca C, Perret GY1, Colombo BM

UPRES 2360 et1 ERIT-M 0204, Université de Médecine, Bobigny (France).

Les vaisseaux tumoraux représentent une cible récente de la thérapie génique antitumorale. Nous proposons ici une approche basée sur le transfert du gène codant pour la nitroréductase (ntr) d’Escherichia coli, dont le produit est une enzyme capable de convertir une prodrogue non toxique, le CB1954, en puissant agent cytolytique.
Après la transfection d’une lignée de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUV-EC-C), à l’aide d’un ADN plasmidique porteur du gène ntr, nous avons analysé in vitro les effets du CB1954 sur ces cellules. Nous avons identifié deux clones HUV-EC-C/ntr+ présentant une sensibilité au CB1954, 15 à 30 fois plus élevée que celle des cellules HUV-EC-C non transfectées (HUV-EC-C/ntr-). Ces clones ont été ensuite co-injectés, par voie sous-cutanée, avec la lignée de mélanome murin B16-F10 dans des souris nude. Suite au traitement des animaux avec le CB1954, nous avons constaté une survie prolongée des souris porteuses des clones HUV-EC-C/ntr+ par rapport aux animaux témoins, injectés avec les cellules HUV-EC-C/ntr-. Cependant, aucune différence significative de la croissance tumorale n’a été mise en évidence. L’analyse histologique des tumeurs a montré de larges zones de nécrose, vraisemblablement dues à une ischémie tumorale en présence des clones HUV-EC-C : ntr+. L’analyse histologique des poumons, foies et des rates n’a montré aucune présence de métastases tumorales ni de toxicité du traitement.
L’ensemble de ces résultats montre que le ciblage des vaisseaux tumoraux par thérapie génique pourrait être une approche efficace dans le traitement du cancer in vivo, mettant en jeu un effet bystander basé sur l’ischémie tumorale et sans induction de toxicité chez l’animal.

n 161

Intérêt du rat nude dans l’étude des relations pharmacocinétique-pharmacodynamie d’agents anticancéreux

Bari V, Bichat F, Duchamp O, Hoffmann N, Bataille A, Eon J, Narboux N, Genne P, Guilbaud N

Oncodesign, Dijon, France.

L’objectif de ce travail a été de démontrer que le rat nude est un modèle adapté à l’étude des relations pharmacocinétique-pharmacodynamie (PK/PD) d’agents anticancéreux. En cancérologie expérimentale, le rat nude, qui a été jusqu’à présent peu utilisé, permet de réaliser des greffes de tumeurs humaines après chirurgie ainsi que des traitements répétés par différentes voies. De plus, son métabolisme est plus proche de celui l’homme que celui de la souris.
Nous avons tout d’abord montré que l’activité des enzymes de détoxification à cytochromes P450 (CYP) 1A, 2B et 2E était supérieure dans le foie et les reins de souris nude par rapport aux rats nude et à l’homme. A l’inverse, l’activité des CYP 1A, 2E et 3A était supérieure dans l’intestin des rats nude par rapport aux souris nude. Nous avons ensuite étudié la PK/PD du paclitaxel (PXL) chez les rats porteurs de tumeurs humaines pulmonaires (Calu-6) greffées en sous-cutané. Les rats ont reçu une injection intraveineuse (IV bolus) de PXL à 5 mg/kg/j pendant 4 jours consécutifs (Q1Dx4, J0-J3) ou une perfusion de PXL à la dose totale de 20, 80 et 200 mg/kg sur 4 jours via un cathéter implanté dans la veine fémorale. La PK du PXL a été étudiée à J0 et J3 pour la voie IV bolus et en cours de perfusion. Les concentrations plasmatiques de PXL ont été mesurées par une méthode de CLHP/SM-SM utilisant le docétaxel comme étalon interne. A J3, la bile a été collectée via un drain puis étudiée par SM-SM afin d’identifier les métabolites du PXL. Enfin, les tumeurs ont été prélevées afin d’évaluer le taux d’apopotose.
A J2-J3, nous avons observé une mortalité des rats traités par perfusion à 80 et 200 mg/kg/4j. A 20 mg/kg/inj, nous avons observé une activité antitumorale et un taux de cellules apoptotiques supérieur après injection IV bolus du PXL par rapport à la perfusion. L’exposition plasmatique des rats au PXL a augmenté de manière dose-dépendante après traitement par perfusion. Cinq métabolites du PXL (3’ p-OH-PXL, 2 m-OH-PXL, 8-OH-PXL 10-déacétyl-PXL, Baccatin III) ont été identifiés dans la bile des rats.
Le rat nude porteur de tumeurs apparaît comme un modèle approprié pour obtenir de nombreuses informations (PK, PD, métabolisme) lors du développement pré-clinique d’agents anticancéreux.

n 162

Évaluation préclinique par imagerie de résonance magnétique de la réponse antitumorale après déplétion hormonale dans des modèles de cancers mammaires et prostatiques chez le rat

Duchamp O1, Walker P2, Bataille A1, Genne P1, Brunotte F2, Bichat F1, Just N1, Guilbaud N1

1 Oncodesign SA, Dijon, France ;
2
 Laboratoire de Biophysique, Faculté de Medicine, Dijon, France.

La déplétion hormonale par castration chirurgicale ou chimique (tamoxifène, letrozol ou anti-LH-RH) est le traitement le plus utilisé pour les cancers mammaires et prostatiques. Nous avons précédemment démontré l’effet antitumoral de ces traitements dans un modèle de cancer mammaire chimio-induit par le DMBA chez le rat Sprague-Dawley et dans le modèle R3327H de cancer prostatique chez le rat Copenhague. Le but de cette étude était d’observer par imagerie de résonance magnétique (IRM) l’effet de la déplétion hormonale sur l’angiogenèse tumorale. Nous avons étudié l’effet de différents protocoles de thérapies hormonales en quantifiant la perméabilité vasculaire (Ktofts), l’espace extracellulaire (Ue) et les paramètres de croissance tumorale dans des modèles syngéniques et xénogéniques de cancers mammaires et prostatiques hormonodépendants chez le rat. Les tumeurs ont été imagées à 1.5T à différents temps cinétiques après déplétion hormonale. Les mesures de volume tumoral ont été réalisées à l’aide d’une séquence d’acquisition d’images pondérées en T2 de type Turbo Spin Echo (TR/TE : 4500/54). Ces mesures ont confirmé l’inhibition de croissance tumorale après castration des animaux porteurs de tumeurs mammaires et prostatiques hormonodépendantes (valeurs de T/C comprises entre 15 et 30 % en fonction du modèle). Une séquence d’imagerie dynamique de type écho de gradient pondérée en T1 avec injection de Gadomer (Schering AG, Allemagne) a permis de démontrer un effet de la thérapie sur les paramètres de perméabilité vasculaire. Ces paramètres ont été quantifiés selon le modèle d’analyse cinétique décrit par Tofts et al. [JMRI, 1997].
La déplétion en estradiol induit une diminution significative et permanente des valeurs de perméabilité vasculaire sur les tumeurs mammaires hormonodépendantes. Par contre, pour des rats porteurs de tumeurs prostatiques hormonodépendantes, la castration induit une diminution transitoire (14 jours après castration) de ces mêmes paramètres alors que la croissance tumorale est inhibée. Nous avons également montré que la déplétion hormonale n’avait aucun effet sur la perméabilité vasculaire des tumeurs mammaires et prostatiques hormono-indépendantes.
Ces résultats suggèrent que l’IRM est un outil pertinent d’évaluation préclinique de nouvelles thérapies hormonales des cancers hormonodépendants.

n 163

Détermination par imagerie de résonance magnétique de l’index de taille des vaisseaux et de volume sanguin d’un panel de gliomes pour l’évaluation de leur sensibilité au BCNU

Just N1, van der Sanden B2, Duchamp O1, Lamalle L2, Guilbaud N1, Genne P1, Rémy C2

1 Oncodesign SA, Dijon, France ;
2 Inserm U594, UJF-CHU Grenoble, France.

L’évaluation de l’index de taille des vaisseaux (ITV) et du volume sanguin (VS) par imagerie à résonance magnétique (IRM) permet de caractériser le niveau de vascularisation de gliomes. Le réseau vasculaire est un paramètre important de la réponse de ces tumeurs à la chimiothérapie.
La sensibilité à la carmustine (BCNU) de sept lignées cellulaires de gliomes (3 lignées murines et 4 humaines) a été évaluée in vitro et in vivo. Des différences de sensibilité au BCNU ont été mesurées. L’objectif de l’étude était de corréler ces différences de réponse antitumorale avec les caractéristiques vasculaires des tumeurs. Les modèles de gliomes syngéniques C6 et GV1A1 ont été étudiés plus particulièrement. Une cartographie de l’ITV et du VS a été obtenue à partir d’images acquises à 2,35 T avant et après injection de Sinerem (Guerbet, France) sur des tumeurs C6 et GV1A1 implantées en intracérébral chez le rat Wistar et BDIX respectivement. Ces cartes montrent des différences significatives entre la tumeur et le tissu sain de l’hémisphère cérébral controlatéral (ITV tumeur > ITV sain ; VS tumeur < VS sain) pour les deux modèles tumoraux étudiés. Ces mesures ont été vérifiées par analyse histologique après injection de marqueurs fluorescents (Hoechst, Dextran-FITC).
De plus, la comparaison des deux modèles a montré des différences de répartition du réseau vasculaire tumoral. Les tumeurs C6 sont caractérisées par une périphérie tumorale plus vascularisée (VS = 31,4 ± 14,7 s–1) et des capillaires de taille importante (ITV = 20 ± 6 µm) par rapport à leur région centrale (VS = 18,2 ± 10,5 s–1). Comparativement aux tumeurs C6, les capillaires des tumeurs GV1A1 sont plus petits (ITV = 6 ± 3 µm) et mieux répartis dans le volume tumoral malgré un VS plus faible (VS = 20,6 ± 9,6 s–1).
L’IRM de l’index de taille des vaisseaux et du volume sanguin des tumeurs cérébrales permet de mesurer et de suivre l’évolution du réseau vasculaire de chaque tumeur et devrait ainsi permettre une adaptation plus spécifique des thérapies antitumorales.

n 164

Inhibiteurs des domaines SH3 de Grb2 : effets antitumoraux en synergie avec le docetaxel

Gril B1, Assayag F2, Poupon MF2, Vidal M1, Garbay C1

1 Laboratoire de Pharmacochimie moléculaire et cellulaire, Inserm U648-CNRS FRE 2718, Université Paris 5, 45 rue des Saints-Pères, 75270 Paris ;
2
 Institut Curie, Section Recherche, 26 rue d’Ulm, 75248 Paris.

Ce travail a pour but de montrer l’importance de recherches ciblées, basées sur des résultats de biologie cellulaire, pour le développement de nouveaux traitements antitumoraux.

ErbB2 est un membre de la famille des récepteurs tyrosine kinase surexprimé dans plusieurs cancers (sein, prostate non hormonodépendants) associés à un mauvais pronostic. ErbB2 initie la voie d’activation dépendante de Ras en recrutant la protéine adaptatrice Grb2. Grb2 est constituée d’un domaine SH2 (Src homology) et de deux domaines SH3. Du fait de l’implication de Grb2 dans la voie Ras, nous avons synthétisé des inhibiteurs peptidiques des deux domaines SH3 de Grb2 capables d’interrompre la signalisation. L’un d’eux a été couplé à la pénétratine pour diffuser dans les cellules. Dans un test d’efficacité de clonage, il présente une CI50 de 0,3 µM sur des cellules NIH3T3/ErbB2 et sur des SKBr3, cellules de cancer mammaire humain exprimant ErbB2. De plus, le composé provoque une inhibition de l’activation de la protéine AKT et est sans effet sur les MAPKinases ERK 1/2.

En accord avec la surexpression de ErbB2 induite par un traitement avec le docetaxel, une synergie in vivo avec l’Herceptin®, anticorps monoclonal humanisé dirigé contre ErbB2, a été montré dans un modèle de xénogreffe de cancer prostate humain. La surexpression de ErbB2 après traitement au docetaxel a été observé sur nos deux modèles cellulaires et notre peptide vectorisé a été testé en association avec le docetaxel dans le test d’efficacité de clonage. A la concentration de 0,1 nM de docetaxel (dose subactive), il reste 90 % de colonies sur les deux lignées. Après administration conjointe d’une dose subactive de peptide vectorisé, le nombre de colonies restantes est inférieur à 10 %. Un effet synergique de notre peptide avec le docetaxel a également été montré sur la croissance d’une xénogreffe de cellules tumorales de cancer de prostate humain sur des souris nude.

Notre approche valide donc Grb2 comme cible potentielle antitumorale et ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques, en particulier en termes d’association avec d’autres agents antitumoraux.

Recherche et pharmacologie cliniques

n 165

Genetic polymorphisms of CES2 and their functional consequences

Jenabian A1, 2, Goasgen N1, Flinois JP1, Gad S1, Beaune P1, Laurent-Puig P1, 2

1 Laboratoire de Toxicologie Moléculaire, Inserm U490, Paris, France ;
2
 Pôle d’Oncologie et de Spécialité, Hôpital européen Georges Pompidou, APHP, Paris, France.

The carboxylesterase 2 (CES2) is a key enzyme for irinotecan bioactivation. The aims of this work were i) to search for genetic polymorphisms in promoter, coding sequence and intron-exon junctions of CES2, ii) to characterize the reported SNPs in data bases and iii) to study the functional consequences of these polymorphisms.
Methods. First we analysed the coding and the promoter region of CES2 by direct sequencing in a set of 60 human liver DNA. Second, the CES2 activity was measured in the cytosols and in the microsomes of the same set of human liver by spectrophotometry with the 4-Methylumbelliferyl acetate which is a human CES2 specific substrate. CES2 RNA expression was also quantified by real time PCR from RNA extracted from a subset of 31 human liver.
Results. No SNP was found in the coding sequence and in intron-exon boundaries of the CES2 gene. However, 5 SNPs were identified in non coding regions : – 1050 C > T, – 1035 G > A, – 363 C > G, 7555 G > A, 8772 a > G (allelic frequencies were respectively 2.5 %, 4.2 %, 10 %, 11 %, 3.3 %). All of these SNPs were in linkage disequilibrium. The overall CES2 activity was on average 7 fold more important in cytosols than in microsomes. The range of CES2 activity in cytosols was 1 to 8.3 fold. Although a significant association was found between the – 363 C/G genotype and the 7555 G/A genotype and a low level of CES2 RNA expression, no significant difference in CES2 activity was observed among the different genotypes.
Conclusion. The level of CES2 activity appears to be variable between individuals but this variability is not explained by genetic polymorphisms. The study of irinotecan metabolism should continue by using a polygenic pharmacogenetic.

n 166

Effets antinociceptifs postopératoires du courant de Limoge en chirurgie cancérologique

Limoge A1, Lakdja F2, Dixmerias-Iskandar F2

1 Laboratoire d’électrophysiologie, Université Paris V, 1 rue Maurice Arnoux, 92120, Montrouge ;
2 Institut Bergonié, Centre de Lutte contre le Cancer, Département d’Anesthésie, 229 cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Cent ans après Leduc, inventeur de l’électrisation cérébrale en 1902, un des auteurs, âgé de 72 ans, pesant 75 kg, atteint d’un adénocarcinome du cardia, a voulu tester sur lui-même sa propre technique d’électro-analgésie par électro-stimulation cérébrale transcutanée avec le courant de Limoge (ESCT-CL), au cours d’une intervention de Lewis par cœlioscopie et thoracotomie. Etant donné les progrès considérables de l’anesthésie chimique, il ne s’agissait pas pour nous de remplacer l’anesthésie conventionnelle, mais de confirmer les résultats obtenus chez l’animal et chez l’homme, à savoir les effets antinociceptifs postopératoires de l’ESCT-CL [Pain 1990 ; 42 : 351-63 ; Anesth Analg 1996 ; 83 : 771-5]. Le courant de Limoge est un courant électrique bidirectionnel, constitué de trains de haute fréquence (166 kHz) d’une durée de 4 millisecondes avec une période de répétition de 100 Hz, une intensité crête à crête de 280 mA et une intensité moyenne de 0 mA. Il a été appliqué 2 heures en préopératoire, pendant toute la durée de l’intervention (6 heures) et continué pendant 48 heures en postopératoire, sans provoquer d’effets secondaires.
L’étude a porté sur la douleur évaluée toutes les 2 heures avec une échelle visuelle analogique (EVA), en adaptant les doses de ropivacaine et du sufentanil injectées dans le catheter péridural thoracique (T8-T9) mis en place à la fin de l’intervention. Pour obtenir une bonne analgésie postopératoire suite à ce type d’intervention et selon le poids du patient, la dose normale minimum préconisée par le laboratoire aurait du être de 192 mg/24 h de ropivacaine et de 360 µg/24 h de sufentanil ; or pendant les premières 48 heures postopératoires, cette dose a diminué respectivement de 48 mg pour la ropivacaine (25 %) et de 216 µg pour le sufentanil (60 %), et au troisième jour de 96 mg (50 %) pour la ropivacaine et de 96 µg (73 %) pour le sufentanil et enfin de 100 % dès le quatrième jour pour les deux drogues. La douleur évaluée avec l’EVA au repos et au cours de la kinésie respiratoire est toujours restée à zéro.
Il serait intéressant dans le futur de faire de nombreux essais cliniques pour montrer qu’en suivant ce nouveau protocole l’ESCT-CL permet de réduire les doses d’analgésiques en les potentialisant et d’obtenir d’excellents effets antinociceptifs postopératoires.

n 167

Les concentrations plasmatiques humaines de trans-resvératrol sont-elles en rapport avec son activité tumorale ?

Le Corre L1, Léger-Enreille A2, Chalabi N1, Delort L1, Bignon YJ1, Bernard-Gallon DJ1,

1 Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, Centre Jean Perrin ;
2
 Laboratoire de Biochimie et Pharmacocinétique, Centre Jean Perrin, 58 rue Montalembert, B.P. 392, 63011 Clermont-Ferrand Cedex 1.

Le trans-resvératrol est un polyphénol d’origine végétale qui est couramment présent dans l’alimentation humaine (raisins, baies, vins, thés). Il possède des propriétés phytœstrogéniques et a été montré capable d’inhiber les trois phases de développement d’une tumeur (initiation, promotion et prolifération) dans plusieurs types de cancers, notamment hormono-dépendants. Initialement, ses activités antitumorales ont été observées in vitro sur des cellules cancéreuses humaines en lignée continue à des concentrations en trans-resvératrol de l’ordre de 30 à 50 µM. Cependant, aucune étude n’a été réalisée pour déterminer les teneurs plasmatiques en trans-resvératrol dans une population humaine. Ainsi, l’objectif de cette étude est de déterminer la concentration en trans-resvératrol dans des plasmas humains et de les comparer à celles biologiquement actives in vitro. Le dosage de ce composé s’effectue par HPLC avec des seuils de détection à 5 ng/ml et de quantification à 20 ng/ml, définis avec des plasmas blancs enrichis en trans-resvératrol. Par ailleurs, l’analyse de plasmas riches en trans-resvératrol (témoins positifs) issus de personnes à forte consommation de vins permettra de valider la technique. Les résultats préliminaires obtenus sur 550 plasmas indiquent qu’environ 1 % des personnes étudiées présentent des faibles concentrations en trans-resvératrol (< 5 ng/ml).
En conclusion, les teneurs plasmatiques en trans-resvératrol observées dans notre échantillon de population humaine semblent insuffisantes pour exercer une activité antitumorale comme décrites in vitro dans plusieurs études antérieures.

n 168

Expression de la P53, Ki67 et CD34 dans les carcinomes épidermoïdes de la langue dans la population tunisienne

Fourati A, El May M, Ladgham A, El May Ahmed.

Institut Salah Azaeiz Ba Saadoun 1006, Tunis, Tunisie.

Le cancer de la langue résulte de l’accumulation d’altérations génétiques qui sont dans 90 % des cas la conséquence directe de l’exposition des voies aérodigestives aux carcinogènes du tabac et à l’alcool. Différents types d’altérations moléculaires ont été caractérisés et plusieurs gènes intervenant dans le processus de régulation et de prolifération cellulaire sont à l’origine de l’apparition de ce cancer. Le but de cette présentation est d’identifier le phénotype des gènes de prolifération Ki67, des gènes suppresseurs des tumeurs P53 et d’angiogenèse CD34.
Une étude immunohistochimique est réalisée sur 30 cas de cancers de la langue des malades diagnostiqués à l’Institut Salah Azaïez. Nos résultats préliminaires montrent que 73 % des cancers de la langue surexpriment la P53 et que 80 % des cas expriment l’antigène de prolifération Ki67. Cependant l’antigène précoce de la néovasculogenèse n’est exprimé que dans 13 % des cas.
Ces données suggèrent que les cancers de la langue présentent une surexpression importante des antigènes P53 et Ki67. Des recherches ultérieures permettront d’identifier les types d’altérations génétiques et d’influence du stress génotoxique dans le déclenchement du processus de cancérogenèse dans la population tunisienne.

n 169

Low level of stanniocalcin 2 gene expression is associated with high metastasis rate in estrogen receptor-positive infiltrating ductal carcinoma of the breast

Reyal F1, 2, Stransky N1, Vincent-Salomon A3, Savignoni A4, de Rycke Y4, Elvin P5, Cassidy A5, Graham A5, Spraggon C5, Desille Y1, Fourquet A6, Nos C2, Pouillart P7, Magdelenat H8, Stoppa-Lyonnet D9, Delattre O10, Sigal-Zafrani B3, Thiery JP1, Sastre-Garau X3, Radvanyi F1, Asselain B4

1 UMR 144, CNRS ;
2 Department of Breast Surgery ;
3 Department of Pathology ;
4
 Department of Bio-statistics ;
5 Astra Zeneca, Alderley Park, United Kingdom
6 Department of Radiotherapy ;
7 Department of Chemotherapy ;
8
 Translational Research Laboratory ;
9 Department of Oncology Genetics ;
10 U509, Inserm, Institut Curie, Paris, France.

Purpose. The strongest predictors of distant metastasis - tumor size, histological grade and axillary lymph node status - do not accurately classify breast tumors according to their clinical behavior. The aim of this study was to identify new molecular markers distinguishing patients at high risk of distant metastases.
Patients and methods. We used Affymetrix DNA microarrays to analyze the gene expression profiles of 132 invasive ductal breast carcinomas obtained from 132 patients included in our prospective database. These tumors were selected according to initial clinical and histological criteria and clinical outcome.
Results. We found that stanniocalcin 2 was the most statistically significant differentially expressed gene between tumors of poor and favorable outcome. High level of stanniocalcin 2 expression in the tumors was found to be significantly associated with lower grade (p < 0.001), estrogen receptor-positive status (p < 0.001) and favorable outcome (p < 0.001). Within the group of patients with estrogen receptor-positive tumors (n = 110), the metastasis-free interval was lower for patients with stanniocalcin 2 expression levels below the median (2-year rate, 66 % versus 90 % ; 5-year rate, 42 % versus 85 % ; p < 0.0001) ; the relative risk of distant metastasis was 4.48. Multivariate analysis showed that stanniocalcin 2 expression level was an independent pronostic factor for metastasis-free interval (RR 2.99 ; 1.55-5.76 ; p = 0.001).
Conclusion. We show here that low level of stanniocalcin 2 gene expression in estrogen receptor-positive tumors is an independent pronostic factor for the occurrence of distant metastasis. As stanniocalcin 2 is an estrogen-responsive gene, stanniocalcin 2 status could also be predictive of the response to antiestrogen therapy.

n 170

Signature moléculaire de la radio-induction : étude du transcriptome de tumeurs de la thyroïde radio-induites

Mallard C1, Ugolin N2, Schlumberger M3, Chevillard S2, Malfoy B1

1 FRE2584 CNRS Institut Curie, 26, rue d’Ulm,75248 Paris Cedex 05 ;
2 Laboratoire de Cancérologie Expérimentale, CEA, route du Panorama, 92265 Fontenay-aux-Roses ;
3 Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif.

L’accroissement des cancers de la thyroïde représente un effet secondaire majeur de l’utilisation des rayonnements ionisants en médecine, surtout chez les enfants exposés avant l’âge de 15 ans. Les tumeurs se développant dans la thyroïde après irradiation sont principalement de type papillaire et se caractérisent par la présence récurrente de réarrangements du gène RET, un membre de la famille des récepteurs de facteurs de croissance à activité tyrosine kinase. Les conséquences biologiques de cette anomalie ainsi que les spécificités pouvant être liées à la radio-induction sont encore mal connues. Afin d’aborder ces problèmes, nous avons entrepris de comparer les transcriptomes de tumeurs de la thyroïde radio-induites et sporadiques.

L’étude porte sur 7 tumeurs de la thyroïde sporadiques et 12 tumeurs de la thyroïde radio-induites. Ces deux séries comprennent à la fois des cancers papillaires et des adénomes folliculaires. Quatre tumeurs radio-induites (4 cancers sur 5) et 1 tumeur spontanée (1 cancer sur 4) présentent un réarrangement du gène RET. L’analyse globale par puce à ADN du transcriptome de l’ensemble des tumeurs a été réalisée et a permis d’identifier un ensemble de gènes différentiellement exprimés entre les tumeurs radio-induites et les tumeurs sporadiques qui permettent d’établir une signature de la radio-induction. Ces gènes se regroupent en trois catégories principales : 1) les gènes impliqués dans la réponse immunitaire ou au stress et dans l’apoptose ; 2) les gènes impliqués dans la réponse hormonale et le métabolisme du calcium ; 3) les gènes impliqués dans la régulation de la transcription et les gènes suppresseurs de tumeurs. Une analyse par RT-PCR en temps réel a permis de valider ces résultats ainsi que d’étudier le rôle de gènes spécifiques de la différenciation thyroïdienne (TSHR, TG, NIS) dans la cancérogenèse radio-induite.

En plus de l’intérêt fondamental des données en cours d’acquisition, la mise en évidence d’une signature fiable de la radio-induction pourrait avoir des applications importantes dans le contexte actuel d’inquiétude lié aux conséquences des irradiations éventuelles suite aux retombées de Tchernobyl en France.

n 171

Déséquilibre allélique en 20q11 et amplification du gène de la topoisomérase I : un marqueur de bon pronostic dans les tumeurs colorectales de stade A/B1-B2

Guérin E1, Pencreac’h E1, Guenot D2, Schneider A1, Rohr S3, Bachellier P4, Neuville A5, Meyer N6, Chenard MP5, Dufour P7, Meyer C3, Oudet P1, Gaub MP1

1 Laboratoire de biochimie et de biologie moléculaire ;
2
 Unité Inserm U381 ;
3 Service de chirurgie générale et digestive ;
4 Service de chirurgie générale, hépatique et endocrinienne ;
5 Service d’anatomie pathologique ;
6 Département d’information médicale ;
7 Département d’hématologie et d’oncologie, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg.

Si 80 % des cancers colorectaux humains présentent des instabilités chromosomiques, il n’a pas été possible à ce jour d’identifier de façon claire un ou des marqueur(s) moléculaire(s) à visée pronostique. La recherche de tels facteurs reste donc un objectif essentiel pour l’amélioration de la prise en charge des patients. Notre étude s’appuie sur la caractérisation systématique de sites génomiques altérés dans la tumeur à partir des données issues de l’allélotypage réalisé en routine dans le cadre de la détermination du phénotype RER ou LOH.

Sur une série de 300 tumeurs colorectales, nous avons pu observer que le locus D20S107, localisé en 20q11, était significativement plus fréquemment altéré dans les tumeurs de stades précoces que dans les tumeurs de stades avancés (fréquence d’altération de 70 à 80 % dans les stades A/B1 et B2 et de 50 % dans les stades C et D, selon la classification d’Astler-Coller). Nous nous sommes focalisés sur les tumeurs de stades précoces afin de préciser la nature du remaniement génomique (amplification ou délétion) et de corréler cette altération avec l’évolution clinique des patients.

Une étude sur 77 tumeurs de stade A/B1-B2 nous a permis de corréler l’altération du site D20S107 avec une meilleure survie sans récidive (log-rank p = 0,007). Le marqueur D20S107 étant proche du gène de la topo-isomérase I, qui est par ailleurs la cible de l’irinotecan utilisé dans le traitement des cancers colorectaux métastatiques, nous avons complété les données d’allélotypage en 20q11 par une quantification du nombre de copies du gène de la topo-isomérase I par PCR en temps réel. Nous avons pu démontrer que le déséquilibre allélique observé en 20q11 correspond à une amplification du gène de la topo-isomérase I. De plus, cette amplification génique s’accompagne d’une surexpression de la topo-isomérase I au niveau ARN et protéine dans la tumeur comparativement au tissu sain.

En conclusion, ces résultats montrent qu’un déséquilibre allélique en 20q11, correspondant à une amplification du gène de la topo-isomérase I, est un marqueur de bon pronostic dans les tumeurs colorectales de stade A/B1-B2. La détermination de ce paramètre pourrait présenter un intérêt afin d’identifier les patients non altérés à ce locus qui présenteraient un risque accru de récidive (risque relatif RR = 3,6) et pour lesquels un suivi clinique intensifié pourrait être proposé.

n 172

Expression de TAp73, ΔNp73, p14ARF et de p16INK4A dans les adénomes et les carcinomes différenciés de la thyroïde

Ferru A1, 3, Denis S1, Guilhot J2, Tourani JM3, Levillain P4, Kraimps JL5, Larsen CJ1, Karayan-Tapon L1

1 Laboratoire protéines et inflammation, EA 2224 ;
2 Centre de Recherche Clinique ;
3 Service d’oncologie médicale ;
4 Service de chirurgie viscérale et endocrinienne, CHU, 86021 Poitiers Cedex.

L’évolution des pratiques médicales conduit à diagnostiquer de plus en plus de pathologies thyroïdiennes, notamment des cancers infracliniques différenciés qui posent le problème de leur prise en charge. Par ailleurs, la discrimination entre pathologie bénigne et maligne pour les formes vésiculaires pose parfois des problèmes. La recherche de marqueurs biologiques de malignité ou pronostiques pourrait permettre une meilleure prise en charge et une désescalade thérapeutique pour ces cancers de bon pronostic.

Dans ce travail, nous avons étudié par RT-PCR quantitative l’expression des gènes supresseurs de tumeur TAp73, p14ARF et p16INK4a ainsi que l’expression de l’isoforme ΔNp73 de TAp73 considéré comme un oncogène. Ces gènes ont un rôle dans l’apoptose ainsi que dans la régulation du cycle cellulaire. Ces résultats ont été confrontés à l’histologie et aux données cliniques. Nous avons étudié 53 échantillons tumoraux dont 29 carcinomes papillaires (CP), 3 médullaires (CM), 5 vésiculaires (CV), 6 adénomes à cellules oxyphiles (AO), 10 adénomes vésiculaires (AV) et 36 tissus sains (TS) adjacents. En tenant compte de l’intervalle de confiance à 95 % de la moyenne, l’étude du rapport tissu tumoral/tissu sain retrouve une surexpression de p14ARF et de p16INK4a respectivement dans 65,52 % et 68,97 % des CP et dans 60 % et 100 % des AV ainsi qu’une sous-expression de ΔNp73 dans 48,28 % des CP et 50 % des AV. Ces différences d’expression sont statistiquement significatives (p < 0,05, test de Wilcoxon) en comparant les tissus sains et pathologiques. De même, nous retrouvons une augmentation du ratio TAp73/ΔNp73 dans les AV (p = 0,037) et les CP (p <,10-4). Le score AGES utilisé comme facteur pronostique pour les carcinomes n’est pas corrélé à l’expression de ces gènes.

Dans notre série, ΔNp73, p14ARF et p16INK4a sont dérégulés dans les AV et dans les CP indépendamment du pronostic et semblent donc être impliqués précocement dans la carcinogenèse thyroïdienne.

n 173

Contrôle de la toxicité rénale et de l’élimination du méthotrexate chez un patient âgé atteint d’un lymphome de Burkitt : intérêt de l’adaptation bayésienne de posologie

Pourroy B1, Salas S2, Cournède A1, Monjanel-Mouterde S1, Favre R2, Durand A1

1 Laboratoire de Pharmacocinétique,
2 Service d’Oncologie Médicale, CHU Timone, Marseille.

Nous décrivons ici le cas d’un patient âgé de 78 ans atteint d’un lymphome de Burkitt (stade II de la classification de Murphy). Le traitement engagé comprenait une phase de cytoréduction (COP) puis 2 cures COPADM d’induction suivi de 2 cures CYM de consolidation. Le méthotrexate (MTX) était administré suivant la stratégie d’adaptation bayésienne de posologie développée dans notre institution [Favre R et al., 1985, Bagarry-Liégey D et al., 1996], aussi bien pour l’induction que la consolidation. Chez ce patient âgé, nous avons fixé la valeur de la concentration cible à atteindre (Cmax) à 125 µmol/L. Pour la première cure, la posologie a été choisie en fonction des paramètres d’élimination de la population de référence et de la Cmax cible. Celle ci fut atteinte en 6 heures après administration de 2,25g de MTX. L’élimination fut ralentie : plus de 200 heures pour atteindre la concentration infratoxique de 0,2 µmol/L ; la T1/2 (demi-vie du MTX) était de 78 heures contre 13,5 heures pour notre population de référence. On observa une toxicité rénale modérée avec une augmentation de la créatininémie de 100 à 182 µmol/L et un retour à la valeur initiale en 300 heures. La détermination des paramètres d’élimination de ce patient pendant la première cure permit de proposer une dose de MTX pour la seconde cure, celle-ci faisant également l’objet d’une adaptation de posologie. La Cmax fut alors atteinte en 8 heures. L’élimination du MTX se fit plus rapidement (T1/2 = 41 heures, 100 heures pour atteindre 0,2 µmol/L) et la créatininémie resta inférieure à 100 µmol/L. De la même manière, les adaptations de posologies réalisées pour les 3e et 4e cures permirent d’atteindre la Cmax souhaitée en 8 heures, avec une élimination améliorée du MTX (T1/2 proches de 30 heures, concentration infratoxique atteinte en 70 heures).

En conclusion, nous montrons ici le grand intérêt de l’adaptation de posologie du MTX. En effet, cette stratégie nous a permis de traiter ce patient âgé en limitant la toxicité rénale du MTX lors de la première cure. De plus, la détermination des doses à administrer au cours des cures suivantes nous a permis d’administrer à ce patient de hautes doses de MTX sans apparition d’effets secondaires graves. Pour des cas plus complexes, comme chez des patients insuffisants rénaux, cette approche, pourrait apparaître également très intéressante.

n 174

Détermination de la durée optimale et de l’impact nutritionnel d’un régime alimentaire déplété en méthionine associé à un traitement par cystémustine : essai clinique de phase I

Thivat E1, 2, Durando X1, Farges M-C3,1 Cellarier E1, 2, Demidem A2, Leger A1, Madelmont JC2, Vasson MP1, 3, Chollet P1, 2

1 Centre Jean Perrin ;
2
 UMR 484 Inserm ;
3 Laboratoire de Biochimie Biologie Moléculaire et Nutrition, EA 2416, Faculté de Pharmacie ; Clermont-Ferrand, France.

Des résultats expérimentaux (culture cellulaire, modèles animaux) ont montré que la carence en méthionine (Met) limite le développement tumoral et augmente l’index thérapeutique des nitrosourées en inhibant les mécanismes de chimiorésistance. L’objectif de cet essai est d’étudier la faisabilité de l’association d’un régime carencé en Met (MET-) à une chimiothérapie par cystémustine et de déterminer la durée permettant d’obtenir une restriction optimale en Met. Dix patients atteints de gliome en rechute ou de mélanome métastatique reçoivent 4 cures de chimiothérapie espacées de 15 jours. Lors de chaque cure, ils reçoivent un régime standard le premier jour (J0) puis le régime MET- durant une période de 1, 2, 3 ou 4 jours selon un ordre randomisé. La cystémustine (60 mg/m2) est administrée le dernier jour de la période de régime MET-. L’état clinique général et l’état nutritionnel (IMC et PINI) sont évalués. Les concentrations plasmatiques en Met sont mesurées à 8 h (à jeun) et à 12 h (état nourri) de chaque jour de régime. Les résultats (moy ± sem) sont analysés par un test t apparié : régime MET- versus régime standard.
Les valeurs de l’IMC (25,0 ± 0,6 kg/m2) et du PINI (6,1 ± 1,8) ne varient pas au cours des 2 mois de traitement. Le taux plasmatique en Met à jeun n’est pas affecté par le régime MET- (25,2 ± 0,6 µM). Cependant, les concentrations plasmatiques en Met à l’état nourri sont diminuées dès le premier jour du régime, elles passent de 21,2 ± 1,3 µM (J0) à 12,0 ± 1,0 µM (J1) (p < 0,01) correspondant à la déplétion optimale de 45 % en médiane, 41 % en moyenne (maximum 84 %). L’allongement de la durée du régime MET- n’a pas d’effet cumulatif sur la déplétion, ce qui peut être expliqué par la remontée du taux plasmatique en Met durant le jeûne nocturne.
Ces résultats montrent la faisabilité du protocole. Le régime carencé en Met n’affectant pas l’état nutritionnel au cours du traitement. Enfin, le régime MET- permet d’obtenir une déplétion optimale d’environ 40 % dès le premier jour de déplétion soit 4 h après le début de la prise alimentaire du régime. Ceci nous amène à retenir une durée de 1 jour de régime alimentaire pour la phase II de cette étude, qui aura pour objectif d’évaluer l’efficacité thérapeutique de l’association du régime MET- et du traitement par cystémustine pour les malades porteurs de gliome en rechute ou d’un mélanome métastatique.

n 175

Évaluation rétrospective de marqueurs moléculaires prédictifs de la réponse au trastuzumab dans une population de patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique

Giuliani R, Desmedt C, Durbecq V, Paesmans M, Di Leo A, Sotiriou C, Piccart M, Larsimont D, Cardoso F au nom des investigateurs ayant participé à cette étude.

Unité de Recherche Translationelle, Service de Chimiothérapie, Institut Jules Bordet, Bruxelles, Belgique.

Le trastuzumab (Herceptin®-H), un anticorps dirigé contre le récepteur HER2, s’est révélé être un traitement oncologique hautement bénéfique en termes de taux de réponse et de survie pour des patientes atteintes de cancer mammaire métastatique présentant une surexpression du récepteur HER2. Cependant, même dans cette population ciblée, seulement 40 % des patientes répondent au traitement, raison pour laquelle nous nous sommes intéressés aux mécanismes de résistance à H.

Objectif. Evaluer rétrospectivement la valeur prédictive des récepteurs de la famille HER (HER1/EGFR, HER2, HER2 phosphorylé [pHER2], HER3 et HER4) et des effecteurs phosphorylés (état activé) en aval de la cascade de signalisation intracellulaire (pERK1/2, pP38, pAkt) dans une population de patientes atteintes d’un cancer métastatique et traitées par H seul ou en combinaison avec un agent de chimiothérapie (H + CT).

Matériel et méthodes. Quarante-six et 57 patientes, traitées respectivement par H ou H + CT, ont été sélectionnées sur la base de nos critères d’éligibilité, à savoir : évaluation objective de la réponse, échantillons tumoraux paraffinés disponibles, Her2 amplifié et absence de cancers bilatéraux ou concomitants. Le taux de réponse au traitement, défini comme réponse complète ou partielle, s’élève à 21,7 % et 54,4 % pour la population H et H + CT, respectivement. L’amplification de Her2 a été évaluée par hybridation in situ (FISH), tandis que les autres marqueurs ont été évalués par immunohistochimie (IHC).

Résultats. 1) Nous observons, pour les deux populations, une corrélation positive entre le niveau d’amplification de Her2 et la réponse au traitement (p = 0,09 et 0,04 pour la population H et H + CT, respectivement). 2) Dans les deux populations, nous observons une relation entre l’expression du récepteur pHER2 et le taux de réponse au traitement. Dans la population H, 5/6 patientes exprimant pHER2, ne présentent aucun bénéfice clinique, alors qu’une corrélation inverse est observée dans la population H + CT où 8/9 patientes exprimant pHER2 ont répondu au traitement. 3) Aucune relation n’a été observée entre le taux de réponse au traitement et l’expression des autres marqueurs évalués.

Conclusions. Bien que l’étude soit de nature rétrospective et ne comprenne qu’un nombre limité de patientes, le niveau d’amplification de Her2 et l’expression de pHER2 semblent influencer la réponse au traitement. Une analyse de p27 est en cours pour tenter d’expliquer la valeur prédictive opposée de pHER2 dans les deux populations.

n 176

Relation entre mastocytes et vaisseaux sanguins dans les cancers de l’ovaire

Labiche A, Elie N, Herlin P

Grecan (Groupe régional d’étude sur le cancer), EA 1772, Université de Caen, Centre de Lutte Contre le Cancer François Baclesse, 14076 Caen Cedex 5.

Dans de nombreux cancers (carcinomes colorectaux, cancers du sein, du poumons et mélanomes), une augmentation du nombre de mastocytes, à l’intérieur et autour de la tumeur, a été observée [1]. De plus, il a été montré que les substances sécrétées par ces cellules (cytokines, chimiokines, facteurs de croissance) ont un impact direct sur les processus de néoangiogenèse tumorale. Dans ce contexte, nous avons cherché à savoir s’il existait une relation quantitative ou géographique entre les mastocytes et les vaisseaux sanguins, dans les cancers de l’ovaire.
Dans le cadre d’une étude préliminaire, un immunomarquage des vaisseaux et des mastocytes a ainsi été réalisé, sur des coupes sériées de 14 cas de carcinomes ovariens, inclus en paraffine. Nous avons ensuite calculé la densité des sections vasculaires, ainsi que les proportions de surface occupées par les mastocytes et les vaisseaux. Ces valeurs ont été obtenues sur la totalité de la section histologique, grâce à une analyse d’images numériques grand champ, acquises à basse résolution [2]. L’étude topographique des interactions entre les deux marquages a été réalisée à l’aide d’un outil de recalage d’images développé au laboratoire [3]. Nous n’avons pas constaté de lien entre la densité de vaisseaux sanguins et la proportion de surface des mastocytes (p = 0,434), ni entre la proportion de surface des vaisseaux et la proportion de surface des mastocytes (p = 0,102). En revanche, 70 % des mastocytes présents sur ces tumeurs se situent à courte distance des vaisseaux (distance moyenne de 190 µm +/– 90 µm). En outre, les tumeurs qui présentent les mastocytes les plus proches des vaisseaux sont celles qui sont le plus vascularisées (p = 0,01).
Ces deux dernières observations constituent des arguments morphologique qui plaident eux aussi en faveur de l’implication des mastocytes dans les processus de néoangiogenèse tumorale [4]. 
Ce travail est réalisé grâce au soutien financier du comité départemental de la Manche de la Ligue de lutte contre le cancer et de l’Agence nationale pour la valorisation de la recherche. Les auteurs remercient M. Christian Lebeau et Mme Soizic Dutoit.

1 . Hiromatsu, Toda. Microsc Res Tech 2003 ; 6 : 64-9.

2 . Elie et al. Cytometry 2003 ; 56 : 37-45.

3 . Signolle et al. ACP 2003 ; 2-3 : 226.

4 . Blair et al. J Clin Invest 1997 ; 99 : 2691-700.

n 177

Comparaison des effets du cisplatine et de l’oxaliplatine sur le profil d’expression génique d’une lignée cellulaire cancéreuse colo-rectale humaine

Meynard D, Le Morvan V, Vekris A, Haaz MC, Bonnet J, Robert J

CNRS FRE 2618, Institut Bergonié, 229 cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Malgré leur parenté chimique et leur mécanisme d’action putatif similaire, le cisplatine et l’oxaliplatine ont un spectre anticancéreux très différent. Cette différence ne peut pas être simplement expliquée par des considérations pharmacocinétiques. Nous avons exploré leurs effets sur le profil d’expression génique d’une lignée cellulaire dérivée de cancer colorectal humain du panel du NCI, HCT15, en utilisant des microarrays Atlas Plastic Human 8K de Clontech, après 24 h d’exposition de cellules en croissance exponentielle à l’IC50 de chacun des médicaments, déterminée par des tests de clonogénicité (1,0 µM pour le cisplatine et 1,9 µM pour l’oxaliplatine). Un total de 805 gènes sur 8126 sont différentiellement exprimés (rapport ≥ 2) après un traitement par le cisplatine (530 négativement et 275 positivement) alors qu’il y en a seulement 368 sur 7622 après un traitement par l’oxaliplatine (128 négativement et 240 positivement).
Pour identifier les fonctions des gènes modulées par ces médicaments, une analyse fonctionnelle a été faite en utilisant la base de données du Consortium Gene Ontology. Les fonctions affectées par le cisplatine sont : 1) la réparation de l’ADN, avec une régulation positive des voies de réparation par recombinaison homologue et non homologue, et une régulation négative des autres voies de réparation de l’ADN ; 2) l’apoptose, qui est induite ; 3) le cycle cellulaire, régulé négativement, 4) la détoxication et la réponse au stress, avec une régulation négative sauf pour les voies microsomales et mitochondriales ; 5) l’énergétique cellulaire, avec une inhibition de la glycolyse, une activation de la dégradation du glycogène, et une activation du cycle du citrate ; 6) la respiration mitochondriale, régulée négativement ; 7) l’activité de synthèse des protéines, de l’ADN et de l’ARN, avec une régulation négative. Certaines de ces fonctions ne sont pas modulées à la suite d’un traitement par l’oxaliplatine et les fonctions communes sont régulées de façon opposée par ces deux médicament. Les fonctions affectées par l’oxaliplatine sont : 1) l’apoptose, régulée négativement ; 2) le cycle cellulaire, qui est activé ; 3) la détoxication et la réponse au stress, avec une régulation positive ; 4) l’énergétique cellulaire, avec une activation de la glycolyse ; 6) la respiration mitochondriale, régulée positivement ; 7) la synthèse et la dégradation des protéines, qui sont toutes deux activées. L’oxaliplatine n’induit pas d’altération des voies de réparation de l’ADN. En conclusion, il apparaît que les effets des ces deux composés sur l’expression globale des gènes sont très différents, ce qui peut expliquer leur spectre d’activité différent. Ces résultats sont en cours de validation par des expériences de RT-PCR quantitative et des tests fonctionnels.

n 178

Analyse fonctionnelle des déterminants moléculaires de la cytotoxicité de l’oxaliplatine dans des lignées cellulaires tumorales d’origine colorectale

Meynard D, Le Morvan V, Vekris A, Haaz MC, Bonnet J, Robert J

CNRS FRE 2618, Institut Bergonié, 229 cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux Cedex.

Nous avons étudié les profils d’expression génique de six lignées cellulaires dérivées de cancer colorectal humain appartenant au panel du NCI, en utilisant des microarrays Atlas Plastic human 8K de Clontech. Les profils d’expression des gènes sont comparés à la cytotoxicité in vitro de l’oxaliplatine, déterminée par des tests MTT. Les coefficients de corrélation de Pearson (r) entre l’expression des gènes et l’IC50 de l’oxaliplatine sont compris entre – 0,99 et 0,98, avec 166 valeurs sur 7 772 supérieures à 0,73 ou inférieures à – 0,73 (p < 0,05) et dont l’expression est supérieure au bruit de fond dans au moins deux lignées cellulaires. Dans une première étape, les gènes dont l’expression est significativement corrélée à la cytotoxicité de l’oxaliplatine ont été sélectionnés pour une analyse fonctionnelle, réalisée grâce aux annotations du Consortium Gene Ontology. Nous avons identifié trois fonctions majeures impliquées dans l’activité de l’oxaliplatine : la synthèse protéique, le cycle cellulaire et la croissance cellulaire, le statut redox des cellules. Dans une deuxième étape, nous avons pris en considération tous les gènes dont le coefficient de corrélation était supérieur à 0,5 ou inférieur à – 0,5 et dont l’expression était supérieure au bruit de fond dans au moins deux lignées cellulaires. Les gènes ainsi pris en considération ont enrichi les trois fonctions sélectionnées lors de la première étape. Les résultats montrent que : 1) plus les cellules ont une activité de synthèse protéique importante, plus elles sont sensibles à l’oxaliplatine (61 gènes impliqués), 2) plus les cellules ont le cycle cellulaire activé ou plus leur croissance est rapide, plus elles sont sensibles à l’oxaliplatine (11 gènes impliqués), 3) plus le stress oxydant basal des cellules est important, plus les cellules sont sensibles à l’oxaliplatine (35 gènes impliqués). Contrairement à ce qui pouvait être attendu, on n’observe pas de corrélation entre la cytotoxicité de l’oxaliplatine et l’expression de gènes impliqués dans la réparation de l’ADN. Par ailleurs, les gènes corrélés avec la cytotoxicité de l’oxaliplatine ne sont pas corrélés avec la cytotoxicité du cisplatine. De plus, à l’aide d’une analyse Leave One Out, nous avons identifié un panel de 5 gènes permettant une très bonne prédiction de la cytotoxicité de l’oxaliplatine sur les lignées cellulaires en fonction de l’expression de ces gènes. Les résultats de microarrays ont été contrôlés sur une série de gènes représentatifs par RT-PCR quantitative.

Ces résultats nous permettent d’émettre l’hypothèse suivante : la cytotoxicité de l’oxaliplatine ne serait pas due à la formation d’adduits sur l’ADN mais à la formation d’adduits sur les protéines. Cette hypothèse est actuellement testée à l’aide de tests fonctionnels.

n 179

Cancer du sein et nutrigénétique : étude des polymorphismes des gènes CYP1A1 et CYP1B1 par la technique des sondes MGB (minor groove binding)

Delort L, Le Corre L, Chalabi N, Bignon YJ, Bernard-Gallon DJ

Laboratoire d’Oncologie Moléculaire, UMR 484-UdA, Centre Jean Perrin, 58 rue Montalembert, BP 392, 63011 Clermont Ferrand Cedex 1.

Le cancer du sein est aujourd’hui le cancer le plus répandu chez les femmes dans les pays occidentaux. Pourtant, seulement 5 % d’entre eux sont dus à une mutation dans les gènes de forte pénétrance, BRCA1 et BRCA2. Ainsi, la recherche de polymorphismes dans les gènes de faible pénétrance, c’est-à-dire des gènes de susceptibilité à des facteurs environnementaux responsables de 20 % des cancers du sein, s’avère nécessaire. Ces polymorphismes ont un rôle dans le métabolisme des estrogènes en modifiant l’exposition de l’organisme à ces composés et sont également impliqués dans l’activation ou la détoxication de composés carcinogènes. Par conséquent, ils peuvent affecter le développement de cancers dans le cas de polymorphismes fonctionnels. Ceci entraînerait alors une modification du phénotype des individus due à ces gènes de susceptibilité.

Ainsi, notre étude consiste à déterminer si les polymorphismes fonctionnels dans deux gènes (CYP1A1 et CYP1B1) codant pour des enzymes de phase I du métabolisme des xénobiotiques et impliqués dans le métabolisme des estrogènes (CYP1A1 codon 462 Ile/Val et CYP1B1 codon 432 Val/Leu) interviennent dans le processus de cancérogenèse.

A partir de l’ADN de 294 patientes qui ont développé un cancer du sein non héréditaire, la recherche de polymorphismes a été effectuée par discrimination allélique grâce à l’utilisation de sondes MGB (minor groove binding). Le génotypage de CYP1A1 a montré que 92 % des patientes sont homozygotes pour l’allèle 1 (Ile/Ile), 7 % hétérozygotes (Ile/Val) et 1 % homozygotes pour l’allèle 2 (Val/Val), soit une fréquence de 0,04 pour l’allèle muté contre 0,05 pour les ADN témoins (d’après l’étude de Miyoshi, 2003). Pour le polymorphisme de CYP1B1, 14 % des patientes sont homozygotes pour l’allèle 1 (Val/Val), 43 % hétérozygotes (Val/Leu) et 43 % homozygotes pour l’allèle 2 (Leu/Leu) avec une fréquence de l’allèle muté de 0,65 contre 0,59 pour les ADN témoins.

Ces résultats préliminaires suggèrent que le polymorphisme de CYP1A1 ne serait pas impliqué dans le processus de cancérogenèse mammaire (intervalle de confiance à 95 %, IC = 0,02-0,06) contrairement à CYP1B1 (95 %, IC = 0,6-0,7). Pour confirmer ces résultats, l’étude sera étendue à une population de 900 patientes.

n 180

Expression intratumorale des gènes codant pour les enzymes du métabolisme des xénobiotiques et réponse au traitement adjuvant par la tamoxifène dans le cancer du sein hormonodépendant

Girault I, Bièche I, Lidereau R

E0017 Inserm Oncogénétique, Centre René Huguenin, Saint-Cloud, France

Un des mécanismes moléculaires proposé pour expliquer la résistance au tamoxifène dans le cancer du sein serait lié à des anomalies du métabolisme et de la biodisponibilité du tamoxifène in situ au niveau de la tumeur.
Afin de tester cette hypothèse, nous avons analysé par RT-PCR quantitative en temps réel l’expression intratumorale de 27 gènes, codant les principales enzymes du métabolisme des xénobiotiques dans une série test comprenant du tissu normal mammaire et hépatique et des tumeurs du sein exprimant ou non le REα (récepteur aux estrogènes α). De cette série, 7 gènes, CYP2A6, CYP2B6, FMO5, NAT1, SULT2B1, GSTM3, et ABCC11 (présentant des niveaux d’expression significativement supérieurs entre les tumeurs REα-positives et le tissu mammaire normal ou les tumeurs REα-négatives), ont été analysés dans une série homogène de 97 tumeurs primitives du sein (REα-positives) provenant de patientes ménopausées ayant exclusivement reçu une hormonothérapie adjuvante à base de tamoxifène. Les altérations principalement observées ont été des surexpressions avec des fréquences allant de 25 % (CYP2A6) à 79 % (NAT1). CYP2A6, CYP2B6, FMO5 et NAT1 se sont révélés être des gènes potentiellement régulés par le REα. En analyse univariée (test du log-rank), les patientes ayant des tumeurs surexprimants FMO5 ou NAT1 ont présenté une survie sans rechute significativement plus longue (p = 0,0066 et p = 0,000052, respectivement), cependant la significativité en analyse multivariée (modèle de Cox) n’a été conservée que pour NAT1 (p = 0,0013).
En conclusion, cette étude suggère l’implication des gènes du métabolisme des xénobiotiques dans la tumorigenèse mammaire et met en évidence le gène NAT1 comme un marqueur prédictif potentiel de la réponse aux anti-estrogènes.

n 181

Characterization of gene expression profiles in cervical carcinoma

Rosty C1, 2, Tsafrir I3, Stransky N2, Tsafrir D3, Thiery JP2, Radvanyi F2, Domany E3, Sastre-Garau X1

1 Department of Pathology and
2 UMR 144 CNRS, Institut Curie, Paris, France ;
3 Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël.

Despite advances in early diagnosis and treatment, cervical cancer remains the second leading cause of cancer deaths after breast cancer for women aged 20 to 39 years. High-risk human papillomavirus types (HPV16 and HPV18) are critical etiologic factors but are not sufficient for malignant conversion of cervical epithelial cells. Moreover, HPV18 associated cancers are associated with a poor outcome compared to HPV16 associated cancers, without underlying molecular explanation. To identify molecular signatures associated with HPV types and clinical outcome, we conducted a global characterization of gene expression profiles, using U133A Affymetrix gene arrays, in 40 samples from cervical tissue : 5 normal cervical mucosae, 5 cell lines derived from human invasive cervical carcinoma, 30 primary invasive cervical carcinomas. Among the primary tumors, 16 were associated with HPV16, 12 with HPV18, 1 with HPV31 and 1 with HPV33 ; 12 patients had a poor outcome (relapse-free survival < 3 years) and 12 patients had a relapse-free survival > 5 years (data non available for the remaining 6 cases). Hierarchical clustering and principal component analysis of the data revealed three disctinctive clusters (cell lines, primary tumors, and normal mucosa with one primary tumor). Supervised analysis using ANOVA identified genes differentially expressed according to histological tumor types (squamous cell carcinoma versus adenocarcinoma) and HPV types (HPV18 versus HPV16). Using unsupervised methods (Coupled Two-Way Clustering and Sorting Points Into Neighborhoods), we identified a cluster of 123 genes which separated the normal samples and a subset of good outcome tumors from other tumors. This set of genes was extended by standard statistical methods. Many of the genes of this extended proliferation group are associated with cell cycle regulation, DNA replication and mitosis. These findings indicate that a specific molecular signature can distinguish a subset of tumors with good prognosis.

n 182

Breast cancer Profile ChipTM : un outil de diagnostic utilisant la technologie des puces à ADN appliqué au cancer du sein

Borie N1, Matinec A1, Birnbaum D2, Bertucci F2, Viens P2, Jacquemier J2, Bachelot T, Deraco S1, Debono S1, Hermitte F1, Fert V1, Koki A1

1 Ipsogen SAS, Marseille ;
2 Institut Paoli-Calmettes, UMR Inserm 119, Marseille.

Le cancer du sein est caractérisé par une importante hétérogénéité génétique, constituant l’un des obstacles majeurs à un traitement efficace. La technologie des puces à ADN a contribué à mieux comprendre la diversité des mécanismes moléculaires responsable de l’angiogenèse chez les patientes, et la mesure du profil d’expression des gènes (profiling) pourrait constituer un nouvel outil de choix dans l’amélioration du traitement du cancer du sein. Toutefois, le transfert des technologies de profiling à grande échelle à la recherche clinique reste à faire.
Dans cette étude, nous présentons le développement de la Breast Cancer Profile Chip (BCPC), qui utilise la technologie du profiling appliquée au diagnostic. Brièvement, nous avons réalisé des études de profiling à grande échelle, nous permettant ainsi d’identifier des signatures d’expression pour les principaux marqueurs phénotypiques (RE, PR, EGFR, ERBB2), ainsi que pour prédire la réponse au traitement par anthracyclines. Ces signatures ont été identifiées grâce à l’analyse de 220 échantillons tumoraux précisément annotés sur la plateforme DiscoveryChip d’Ipsogen (contenant 9000 gènes). L’analyse des données générées a été réalisée avec le logiciel ProfileSoftware Corporate (Ipsogen TM). Toutes les signatures ont été identifiées par t test sur un jeu de données de calcul (n = 159), et une méthode de leave-one-out a permis de sélectionner les gènes les plus discriminants. Toutes les signatures identifiées ont été validées par l’évaluation par leur capacité à classer correctement les échantillons d’un jeu de données de validation (n = 60). Pour chaque signature, spécificité et sensibilité ont été calculées par rapport à la méthode de référence (immunohistochimie ou FISH). Les signatures validées ont alors été transférées à la puce BCPC, une puce de type lame de verre contenant les 900 gènes les plus discriminants. L’analyse des échantillons de patients sur cette puce repose sur une amplification conservative (single primer amplification), une détection colorimétrique des molécules hybridées et une quantification automatique à partir d’une image acquise avec un scanner à plat. Les résultats obtenus sont quantitatifs, sensibles et très reproductibles (CV moyen à 5 %).
L’ensemble de ces résultats montre que la puce BCPC pourrait constituer un nouvel outil de diagnostic moléculaire utilisant la technologie des puces à ADN, capable de compléter les analyses classiques d’anatomopathologie et d’améliorer ainsi la prise en charge des patientes.

n 183 

Deux molécules, la chimiokine SDF1/CXCL12 et la molécule d’adhésion CD56, signent l’origine cellulaire des tumeurs de l’ovaire 

Coulomb-L’Hermine A2, Gaudin F1, Machelon V1  

1 U131 Inserm, 
2
Laboratoire d’Anatomie-Cytologie, Hôpital Antoine Béclère, 92140 Clamart. 

incidence des tumeurs malignes de l’ovaire est en France d’environ 10 pour 100 000 femmes, soit 4 000 nouveaux cas par an. Les tumeurs de l’épithélium ovarien représentent plus de 80 % des tumeurs malignes de l’ovaire chez des femmes entre 50 et 65 ans ; leur pronostic est mauvais, moins de 40 % de survie à 5 ans. Les tumeurs de la granulosa et des cellules germinales sont beaucoup plus rares ; on les retrouve chez des femmes plus jeunes ; leur pronostic est meilleur. 
Dans ce travail, nous avons identifié deux molécules signant l’origine cellulaire de ces tumeurs : SDF1 pour les tumeurs épithéliales et CD56 pour les tumeurs de la granulosa. SDF1 est une chimiokine (cytokine à pouvoir chimioattractant) qui contrôle la réponse immunitaire dans les tumeurs ovariennes. De très nombreuses cellules tumorales sont SDF1 + dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire séreuses, mucineuses, endométrioïdes, à cellules claires. En revanche SDF1 n’est exprimé ni dans les tumeurs de la granulosa, ni dans les dysgerminomes. Dans l’ovaire non tumoral, SDF1 est fortement exprimé dans l’épithélium de surface ; il n’y a pas de production de SDF1 dans les follicules ovariens. L’expression de la molécule d’adhésion CD56 dans les tumeurs peut être un signe d’invasivité. Dans les tumeurs épithéliales de l’ovaire, CD56 est très rarement exprimé par les cellules tumorales : quelques cellules positives dans 1 échantillon de cystadénocarcinome séreux. En revanche CD56 est fortement exprimé par les tumeurs de la granulosa. Dans les tumeurs germinales, on retrouve des cellules CD56+ dans le stroma en lien avec une infiltration leucocytaire importante tandis que les cellules tumorales sont CD56–. Dans l’ovaire sain, l’épithélium de surface est CD56– ; on retrouve quelques rares cellules CD56+ dans les follicules ovariens. En revanche les cellules de la granulosa de patientes traitées en fécondation in vitro sont en majorité CD56+. 
En conclusion, l’expression par les cellules tumorales de SDF1 semble exclusive des tumeurs de l’épithélium tandis que celle de CD56 caractérise les tumeurs de la granulosa. Les cellules des tumeurs germinales sont SDF1–/CD56–. CD56 et SDF1 sont aussi exprimées par les cellules non tumorales dans l’ovaire, leur expression n’est donc pas liée au processus de tumorisation. Elles signent l’origine cellulaire de la tumeur et permettent de confirmer un diagnostic de tumeur primitive. L’expression de CD56 dans les tumeurs de la granulosa suggère que ces tumeurs souvent associées à une hyperestrogénie proviendraient de la prolifération de cellules très différenciées.

n 184

Recherche de mutations du codon 12 du gène Ha-ras et étude immunohistochimique du produit de synthèse de ce gène dans des tumeurs de la thyroïde

Mnarek B1, Elmay MV1, Mrad R1, Elmay A2, Chaabouni H1

1 Faculté de médecine de Tunis, Bab Saadoun, Tunis ;
2 Service d’histopathologie, Institut Salah Azaiz, Bab Saadoun, Tunis.

Ce travail a recherché la mutation du codon 12 du gène Ha-ras dans des tumeurs bénignes et malignes de la thyroïde et évalué de manière semi-quantitative l’expression du produit de synthèse de ce gène.
Les mutations de gène Ha-ras ont été rapportées dans la littérature comme étant fréquentes dans les tumeurs de la thyroïde. Cependant, leur incidence est variable d’une publication à l’autre. Elles concernent aussi bien les tumeurs bénignes que malignes de la thyroïde. Elles sont des mutations ponctuelles et se répartissent, de façon tout à fait arbitraire, au niveau des codons : 12, 13 et 61. Ce travail a porté sur 18 cas de tumeur de la thyroïde, dont 9 malignes et 9 bénignes. Il a été effectué une extraction de l’ADN tumoral à partir de nodules macroscopiquement tumoraux, puis une amplification d’une séquence flanquant le codon 12 de l’exon 1 du gène Ha-ras. La mutation ponctuelle du codon 12 abolit le site de restriction de l’enzyme MSPI. Cette méthode enzymatique a été ainsi utilisée. Une étude immunohistochimique a été effectuée en parallèle sur ces 18 échantillons de tumeur évaluant de façon semi-quantitative l’expression du p21ras, produit de synthèse du gène Ha-ras. Il n’a pas été mis en évidence de mutation du gène H-ras au niveau du codon 12. Ces mutations étaient absentes au niveau aussi bien des tumeurs bénignes que malignes. Ce résultat a été aussi rapporté par certaines équipes dans la littérature.
L’étude immunohistochimique de la protéine p21ras a retrouvé que la majorité des tumeurs étudiées (15/18) ne surexprimaient pas (9-) ou exprimaient faiblement (6+) la protéine p21ras Seuls 3 échantillons avaient une surexpression de la protéine. Cependant, l’aspect de l’immunomarquage était différent dans les échantillons tumoraux de celui de la thyroïde normale avec une marquage cytoplasmique diffus à la place de l’aspect de gros grains périphériques. Aucune corrélation entre l’immunoréaction et le degré de différentiation des tumeurs n’a été retrouvée dans notre travail.
Ces résultats restent à confirmer par un élargissement de l’effectif étudié et par la recherche des mutations au niveau des autres codons du gène H-ras (12 et 61).

n 185

Dissociation entre l’expression du récepteur α des estrogènes et la fonctionnalité de la protéine à fixer l’hormone dans des cancers du sein localement avancés ou métastatiques

Hkima Abou Fakher F1, Turpin E1, Bertheau P2, Boudou P2, Plassa LF1, Espié M3, Misset JL3, de Thé H1

1 Service de Biochimie et CNRS UPR 9051 (IUH) ;
2 Service de Pathologie et Inserm ERM0220 (IUH) ;
3 Centre des Maladies du sein et Service d’Oncologie, Hôpital Saint-Louis, 1, av. Claude Vellefaux 75010 Paris.

Dans 10 à 15 % des cancers du sein, la tumeur est à un stade localement avancé ou métastatique (LABC) et est traitée par chimiothérapie première suivie éventuellement par une chirurgie. Parmi des LABC traitées à l’hôpital Saint-Louis, nous avons mis en évidence une sous-population de patientes dont la tumeur surexprime un récepteur α des estrogènes (RE) qui a perdu la capacité de lier l’hormone. Ces tumeurs de mauvais pronostic sont majoritairement de grade -3 (54 % de grade 3) et mutées pour TP53 (35 %), le statut TP53 étant déterminé par le test fonctionnel de Fasay dans la levure. Le test de liaison du récepteur à l’hormone est réalisé par mesure de la capacité de l’hormone E2 marquée à se lier à son récepteur préparé à partir de tissu tumoral congelé. L’expression du REα a par ailleurs été analysée par étude du transcriptome. Les ARN purifiés à partir de tissu tumoral congelé ont été quantifiés soit par QRT-PCR en temps réel, soit par hybridation sur microarray. Il y a totale concordance entre l’expression de REα en microarray, en QRT-PCR en temps réel et activation des gènes cibles en microarray.

 

LABC RE-ARN négatif RE-ARN positif
RE protéine (liaison ligand) négatif 20 (70 % TP53 mut) 27 (25 % TP53mut)
RE protéine (liaison ligand) positif 0 23 (9 % TP 53 mut)
P = 0,0012 (Chi2 corrigé)

La dissociation entre l’expression et la fonctionnalité de la protéine à fixer l’hormone est proche de 100 % chez les patientes avec tumeur TP53 mutée et/ou de grade 3. Il est à ce jour suggéré que l’expression de RE et sa capacité à lier l’hormone sont étroitement corrélées, cette dernière étant un facteur prédictif de la réponse au tamoxifène. Nous montrons l’existence d’un groupe de patientes RE+ probablement résistantes aux anti-estrogènes, comme à la chimiothérapie.

n 186

Détection par RT-PCR en temps réel de cellules tumorales dans la veine pulmonaire drainant les carcinomes bronchiques non à petites cellules

Coulon S1, Saintigny P2, Bazelly B3, Ricci S1, Le Pimpec-Barthes F4, Azorin J5, Milleron B6, Bernaudin JF1

1 Services d’histologie biologie tumorale ;
3 Chirurgie Thoracique et
6
 Pneumologie, Hôpital Tenon, 4 rue de la Chine, 75970 Paris Cedex 20 ;
2 Oncologie médicale et
5 Chirurgie Thoracique, Hôpital Avicenne, 125 rue Stalingrad, 93000 Bobigny ;
4 Chirurgie Thoracique, Hôpital Européen Georges Pompidou, 20 rue Leblanc, 75015 Paris.

Les patients atteints de carcinomes bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent un risque important de récidives, même après une chirurgie oncologiquement satisfaisante. La sous-estimation de l’extension tumorale étant probable, l’étude présentée explore l’hypothèse peu décrite dans la littérature, d’une dissémination de cellules tumorales via la veine pulmonaire drainant la tumeur.

Matériels et méthodes. 21 patients ayant des CBNPC opérables de tout stade ont été recrutés dans trois centres de chirurgie thoracique. Le prélèvement sanguin (16 mL) a été effectué sur seringue EDTA par le chirurgien sur pièce opératoire in situ. Le sang a été traité soit par lyse des globules rouges, soit par enrichissement des cellules mononucléées (Ficoll, Hypaque). L’ARN total (extraction Trizol/chloroforme ; précipitation isopropanol) a été quantifié et sa qualité vérifiée par migration sur micropuce (Bioanalyser, Agilent technologies). La détection a été effectuée par RT-PCR quantitative en temps réel (PCR-Q) avec un panel de marqueurs validés (ARNm de CK19, CK7). La PCR-Q a été réalisée, après transcription inverse, sur ADNc en utilisant la chimie Taqman®. Chaque amplification du gène (CK19 ou CK7) et du contrôle interne (CMH1) a été réalisée en triplicate. L’efficacité d’amplification est calculée à partir de la pente de la droite formée par 4 dilutions successives du standard de référence (CAPAN-1, A549) dans du sang de donneur sain. Les échantillons sanguins sont considérés comme contenant des cellules tumorales circulantes s’ils sont positifs pour au moins deux des triplicates sous réserve d’une amplification à un niveau habituel du contrôle interne.

Résultats. Sur 21 patients étudiés, la RT-PCR a donné un résultat positif chez 47,6 % patients pour les marqueurs CK19 (6/21) et/ou CK7 (5/21). Il a été détecté des cellules tumorales sur 6 des 8 patients n’ayant pas reçu de chimiothérapie néoadjuvante et sur 4 des 12 patients ayant reçu une chimiothérapie néoadjuvante.

Conclusion. Ces résultats préliminaires montrent la fréquence de l’extravasation de cellules tumorales dans la veine drainant les CBNPC. Le rôle d’une chimiothérapie néoadjuvante sera évaluée sur une plus grande série de patients.

n 187

Genotyping of thymidylate synthase, dihydropyrimidine dehydrogenase and p53 polymorphisms in orl cancers associated to 5-fluorouracil based-chemotherapy

De Bortoli C1, Boyer JC, Evrard A1,2, Polge A1, Bonnin P3, Lallemant JG3, Bali JP1

1 UF toxicologie, CHU Nîmes ;
2 Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie, Montpellier ;
\sup\}3 Service d’Otorhinolaryngologie, CHU Nîmes.

Effectiveness of 5-fluorouracil (5FU) based chemotherapy is variable according to the expression of thymidylate synthase (TS) which is affected by a double (2R) or a triple tandem repeat in the promoter region or by a deletion of 6 bp in the 3’UTR. Lethal or severe 5-FU toxicity is associated to the presence of a rare (0.1 %) polymorphism (DPYD*2A) in the splicing region of intron 14. In addition, the presence or absence of functional p53 in tumor may be an important determinant of the chemosensitivity of a tumor. In this context, we carried out a retrospective study of 24 patients ORL cancer treated with 5FU. After extraction of genomic DNA, DPYP*2A was analysed on a Lightcycler® automate, TS polymorphisms were analysed by RFLP analysis. P53 status was determined by SSCP and sequencing, immunohistochemical and antibodies anti-p53 detection. Distribution of 5’TS genotype was 18 % 2R/2R (n = 4), 36 % 2R/3R (n = 8) and 36 % 3R/3R (n = 8). Distribution of 3’TS genotype was 45 % 6bp/0bp (n = 10), 14 % 6bp/6bp (n = 3) and 32 % 0bp/0bp (n = 7). The median survival time was 26 months in patients homozygous or heterozygous for the 2R mutation versus 14 months in patients homozygous for the 3R mutation. 23 % of patients carried a mutation of p53, p 53 overexpression was detected in the tumors of 17 patients (81 %), anti-bodies anti-p53 were detected in the serum of 5 patients (33 %). P53 overexpression and TS status appear to be associated with poor response. In the patients who developped poor response to 5FU, analysis of the TS status showed that 55 % of the patients (n = 12) were heterozygous or homozygous for the 3R mutation for, 50 % (n = 11) for the 6bp deletion. Overexpression was detected in the tumor of 13 patients (62 %). Concerning hematological, digestive or mucositis/stomatitis toxicity related to DPYD*2A, all patients displayed a homozygous wild genotype whereas the TS status seemed to be relevant. Our study is a first step toward the goal of tailored cancer chemotherapy. These findings will be next discussed.

n 188

Chimiothérapie intra-artérielle hépatique (CIAH) chronomodulée de rattrapage associant irinotecan, 5-fluorouracil et oxaliplatine chez les patients atteints de métastases hépatiques de cancer colorectal multitraités

Bouchahda M, Tanaka K, Adam R, Giacchetti S, Brézault-Bonnet C, Gholam D, Sverdlin R, Hauteville D, Kunstlinger F, Castaing D, Jasmin C, Lévi F

Hôpital Paul Brousse et Inserm E0354, Villejuif, France.

Les processus de prolifération cellulaire et de détoxication hépatiques sont régulés par l’horloge moléculaire constituée de douze gènes circadiens [Fu et al., Cell 2002, Matsuo et al., Science 2003]. L’ajustement de la chimiothérapie à ces rythmes circadiens pourrait améliorer l’activité antitumorale.

Méthodes. L’objectif était l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’association de ces trois cytotoxiques administrés en perfusion intra-artérielle hépatique chronomodulée (IAH) hors hospitalisation chez 20 patients multitraités atteints de cancer colorectal métastatique (CCRM). Lors de chaque cycle, les patients (pts) ont reçu 5 jours de traitement tous les 21 jours associant à J1 irinotecan (160 mg/m2 de 02 : 00 à 08 : 00 avec un pic à 05 : 00) et de J2 à J5, oxaliplatine (20 mg/m2/j, de 10 : 00 à 22 : 00 avec un pic à 16 : 00) et 5-fluorouracile (600 mg/m2/j, de 22 : 00 à 10 : 00 avec un pic à 04 : 00). Cent-dix cycles (c) ont été administrés (moyenne de 5c par pt ; 2-15) en utilisant une pompe programmable multicanal (Mélodie, Aguettant, F). L’évaluation de la tolérance a été faite tous les 21 jours et l’efficacité appréciée par scanner après 3 cycles de traitement.

Résultats. Caractéristiques des patients (pts) : lignes antérieures de chimiothérapie : 1/2/3/4+ : 3/1/5/11 pts ; état général (OMS) 0/1/2 : 10/7/3 pts ; âge moyen 63 ans (32-73) ; atteinte hépatique exclusive 13 pts ; foie + poumons 7 pts. Arrêt thérapeutique pour thrombose (4 pts après 2-7 c) et/ou douleur abdominale de grade 3 (3 pts après 3-5 c). D’autres toxicités ont été observées chez moins de 20 % des patients et 5 % des cycles : leucopénie (3 pts, 6 c, thrombocytopénie (1 pt, 2c), vomissements (4 pts, 4 c), diarrhée (4 pts, 5 c), asthénie (2 pts, 2c), alopécie (3 pts), neuropathie sensitive (2 pts). Chez 18 pts présentant des lésions mesurables hépatiques, ont été observées une réponse partielle chez 7 (39 %), une stabilisation chez 6 (33 %), une progression hépatique chez 5 et une progression pulmonaire chez 8. Le temps médian de survie sans progression a été de 6 mois et la survie médiane de 11,92 mois (6 pts vivant à 20 mois).

Conclusions. La CIAH avec la triple association chrono modulée irinotecan-5FU-oxaliplatine offre un bon profil de tolérance et d’efficacité chez les patients multitraités atteints de CCRM. L’alternance avec un traitement systémique pourrait mieux contrôler ou prévenir une dissémination extra-hépatique. Elle fait l’objet d’une évaluation pilote en rattrapage pour le traitement préopératoire de métastases hépatiques de cancer colorectal non résécables.

Immunologie

n 189

Differences in cell-associated HTLV-1 expansion between CD4+ and CD8+ T cells in vivo

Sibon D1, 2, Gabet AS1, Mortreux F1, Gessain A3, Gout O4, Jacobson S5, Wattel E1, 2

1 Oncovirologie et Biothérapies, CNRS UMR 5537, Centre Léon Bérard, 28 rue Laennec 69373 Lyon Cedex 08 France ;
2
 Service d’Hématologie, Pavillon E, Hôpital Edouard Herriot, Place d’Arsonval, 69437 Lyon Cedex 03 France ;
3 Institut Pasteur, Paris ;
4
 Fondation Rotschild, Paris ;
5 National Institute of Health, Bethesda MD, USA.

As ex vivo and in vitro HTLV-1 infected CD4+ and CD8+ T cells exhibit differences in viral expression, growth kinetics and cell cycle distribution, the HTLV-1 replication pattern of these two cell subsets was compared in vivo. Real-time quantitative PCR and quadruplicate linker-mediated PCR were performed on the DNA extracted from highly purified CD4+ and CD8+ T cells deriving from patients with tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy (TSP/HAM). The proviral loads and clonality patterns of infected PBMCs were typical of TSP/HAM. The purity degree of isolated CD4+ or CD8+ fractions was under PCR detection thresholds. The mean proviral load was > 2.5-times higher in CD4+ than in CD8+ (p = 0.016). The overall number of infected clones was also significantly higher in CD4+ than in CD8+ : 44 vs 32/2µg of DNA (p = 0.008). The proportion of clones having a clonal frequency ranging from 1/3000 to 1/300 was not significantly different between the two subsets. By contrast, the proportion of clones of more than 1/300 infected PBMCs was significantly higher in CD4+ : 19 vs 13 (p = 0.032). For both T cell subsets, proviral loads negatively correlated with the number of low abundant clones, and positively correlated with the number of > 1/300 clones. The previously described cell-associated HTLV-1 expansion characterizes both CD4+ and CD8+ T cells, with a significantly higher degree of cellular accumulation and/or proliferation in the CD4+ subset.
Supported by the Ligue nationale contre le cancer (Equipe labellisée 2003).

n 190

Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T Lymphocyte/target cell interaction : manifestation of a dual activation threshold

Faroudi M1, Utzny C1, Salio M2, Cerundolo V2, Guiraud M1, Mller S1, Salvatore Valitutti S1

1 Inserm U563, Lymphocyte Interaction Group, Hôpital Toulouse-Purpan, 31059 Toulouse, France ;
2
Cancer Research UK, Tumor Immunology Group, John Radcliffe Hospital, OX3 9DS Oxford UK.

Rationale. Activation of biological functions in T lymphocytes is determined by the molecular dynamics occurring at the T cell/opposing cell interface. In the present study a central question of cytotoxic T lymphocyte (CTL) biology was studied at the single cell level : can two distinct activation thresholds for cytotoxicity and cytokine production be explained by inter-cellular molecular dynamics between CTLs and targets.

Methods. To address the above questions, signaling aspects of CTLs were studied in parallel with functional single CTL responses. We used confocal microscopy and FACS analysis to document morphological parameters of CTL activation. We measured [Ca2+]i in individual CTLs interacting with target cells, data of calcium measurements were collected and analysed. We combined morphological approaches with numerical analysis which allows to associate specific patterns of calcium mobilization with different biological responses.

Results. We show that CTLs selectively activated to cytotoxicity lack a mature immunological synapse while exhibiting a polarized low threshold secretion of lytic granules and spike-like patterns of calcium mobilization. This is contrasted by fully activated CTLs which exhibit a mature immunological synapse as well as smooth and sustained calcium mobilization.

Conclusions. Our results indicate that inter-cellular molecular dynamics as well as signaling characteristics allow the definition of two activation thresholds in individual CTLs : one for polarized granule secretion (lytic synapse formation) the other for cytokine production (stimulatory synapse formation). We are currently studying lytic and simulatory synapse in CTLs interacting with tumor cells in order to define whether alteration in synapse formation may contribute to tumor cell escape from immune-surveillance.

n 191

Engagement of non-synaptic T cell receptors induces rapid remodelling of immunological synapses

Depoil D1, Zaru R2, Guiraud M1, Mller S1, Valitutti S1

1 Inserm U563, CHU Purpan, 31059 Toulouse Cedex 3, France ;
2 University of Dundee, Dow Street Dundee DD1 5EH, UK.

Rationale. Mature immunological synapses have traditionally been described as stable structures located at the cell-cell contact site for a prolonged time. This, together with the notion that activation of cytokine production by T lymphocytes requires a sustained signal contributed to create a “static” idea of T cell activation. In the present work we investigated the possibility that immunological synapses are dynamic and adaptable structures allowing T cells to communicate with multiple cells.
Methods
. We employed confocal microscopy to study in Th1 and Th2 human T cells interacting simultaneously with antigen presenting cells offering different stimuli : i) the immunological synapse formation as a parameter of ongoing signal transduction ; ii) the polarization of CD40L and cytokines as parameter of help delivery.
Results. Our results show that while T cells could form more than one synapse at the same time, immunological synapses were more pronounced at the contact site with the cells offering the strongest antigenic stimulus. Towards these cells, T cells selectively oriented CD40L and secretory machinery. When antigen-presenting cells displayed comparable levels of antigenic determinants, synapse formation and T cell polarization were decided by CD2/CD58 interaction. Remarkably, in living T cells, the TCRs already enriched in one immunological synapse rapidly re-positioned towards an opposing cell offering a stronger antigenic stimulus.
Conclusions. Our results illustrate that, although T cell activation requires sustained signaling, T cells are capable of rapid synapse remodelling and swift polarization responses. The combination of sustained signaling with preferential and rapid polarization provides a mechanism for the high sensitivity and selectivity of T cell responses.

n 192

Étude in vitro et in vivo de l’activité anti-tumorale des cellules mononucléées naïves du sang périphérique

Joseph-Pietras D1, Carlier A1, Madoulet C2, Albert P1

1 Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, EA 3306-IPCM, UFR Sciences ;
2 Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, EA 3306-IPCM, UFR Pharmacie, IFR53 Biomolécules, Reims.

Devant la résistance multiple de certaines cellules tumorales aux agents anticancéreux, et suite à la mise en évidence de l’existence d’antigènes tumoraux, apparaissent la possibilité et la faisabilité d’une immunothérapie cellulaire spécifique pour détruire les cellules malignes.
A la différence des cultures cellulaires en monocouche, les sphéroïdes constituent un modèle tridimensionnel de choix pour étudier in vitro les relations entre les cellules tumorales et les cellules effectrices du système immunitaire. Lors de co-cultures de sphéroïdes préparés à partir de cellules de mélanome B16 résistantes à la doxorubicine avec des cellules mononucléées naïves du sang périphérique de souris B6D2F1 isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll, nous avons observé une diminution significative de la taille du sphéroïde résistant. Nous avons mesuré l’activité cytolytique des cellules mononucléées vis-à-vis des cellules du sphéroïde. Les résultats de cette analyse mettent en évidence une augmentation de la cytotoxicité à partir de 38h de co-culture. Par la technique TUNEL, nous avons montré une corrélation entre les mesures d’activité cytolytique et la mort des cellules des couches périphériques des sphéroïdes cultivés en présence de cellules mononucléées. Des études histologiques réalisées après immunomarquage mettent en évidence la présence de cellules mononucléées infiltrant les sphéroïdes. Nos résultats montrent que les cellules mononucléées naïves ont in vitro une activité anti-tumorale contre les cellules de mélanome murin cultivées en système tridimensionnel. Nous avons alors réalisé une étude in vivo. L’injection intra-tumorale (i.t.) de cellules mononucléées à des souris B6D2F1 ne semble pas avoir de répercussion macroscopique visible sur le développement tumoral.
Maîtrisant la culture de cellules souches médullaires, nous avons voulu voir l’influence d’injections i.t. de types cellulaires définis. A la différence des cellules mononucléées, lorsque nous injectons en i.t. des cellules dendritiques naïves obtenues à partir de cellules souches médullaires, nous observons dans 66 % des cas, une régression de la tumeur allant jusqu’à la disparition de la masse tumorale.
Les mécanismes immunitaires mis en jeu afin d’identifier les acteurs de cette réponse in vivo sont en cours de développement. Pour l’avenir, nous chercherons à optimiser leur action en contrôlant le stade de maturation des cellules injectées, en les sensibilisant préalablement et/ou en utilisant des co-facteurs favorisant leur réponse.

n 193

Immunothérapie associée à un traitement au curcumin dans la lutte contre le mélanome murin

Odot J1, Thevenard J1, Albert P1, Madoulet C2

1 Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, EA 3306-IPCM, UFR Sciences ;
2
 Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, EA3306-IPCM, UFR Pharmacie, IFR53 Biomolécules, Reims.

Contrairement à la chimiothérapie qui progresse peu, le développement de l’immunothérapie cellulaire est actuellement un domaine de recherche actif contre le mélanome. Les travaux que nous avons menés portent sur la mise en place d’une réponse immunitaire adaptative chez la souris B6D2F1 suite à des immunisations (lysats totaux, protéines solubles, 104 cellules B16R viables) avec une lignée cellulaire syngénique de mélanocytes tumoraux résistants à la doxorubicine (B16R).
Nous avons montré que l’immunité à médiation humorale n’est pas suffisante pour expliquer l’amélioration de la durée de vie et la diminution de la progression tumorale. L’injection de 104 cellules B16R viables a permis d’observer l’apparition d’un phénotype vitiligo, décrit dans la littérature comme étant une réaction auto-immune des CTL contre des mélanocytes sains. Nos travaux se sont orientés vers la détection et l’évolution de la réponse immunitaire à médiation cellulaire par mesure de l’activité lytique des splénocytes, pour expliquer : 1) l’amélioration de la durée de vie de 21 à 50 % ; 2) l’inhibition du développement tumoral de 50 à 90 %, 30 jours après injection des cellules B16R avec certains traitements ; 3) une régression tumorale dans 17 % des cas chez les animaux présensibilisés avec 104 cellules B16R. Certaines améliorations sont dues à l’adjonction d’un traitement curatif journalier au curcumin. Cette molécule est cytotoxique pour les cellules B16R cultivées en monocouche ou en sphéroïde (IC50 respectivement 25 µM et 170 µM). Cette cytotoxicité se fait via le déclenchement de l’apoptose, permettant, in vivo, le retard du développement tumoral sans toxicité pour l’animal et donc pour son système immunitaire. 
Les mesures d’activité lytique des splénocytes d’animaux présensibilisés sur les cellules B16R montrent que le système immunitaire réagit efficacement contre cette tumeur dans un premier temps puis devient inefficace au cours du développement tumoral. Ces mêmes mesures mettent en évidence également que le curcumin permet d’améliorer et de prolonger l’efficacité de l’immunité mise en place. Les résultats encourageants obtenus orientent donc nos travaux vers la mise au point d’un modèle de développement métastatique pour voir si l’efficacité préventive est retrouvée en traitement curatif sur la métastase. Nous tenterons également de caractériser les populations cellulaires responsables de la cytotoxicité sur les cellules B16R

n 194

Potentiation of a tumor cell susceptibility to autologous CTL killing by restoration of wild type p53 function involves Fas and mitochondrial pathways

Thiery J, Abouzahr S, Dorothee G, Jalil A, Richon C, Vergnon I, Mami-Chouaib F, Chouaib S

Inserm U487, Institut Gustave Roussy, 94805 Villejuif, France.

Inactivation of p53 has been implicated in many types of tumors particularly in non-small lung carcinoma (NSLCC), one of the most common cancers in which p53 mutation have been frequently identified. The aim of this study was to investigate the influence of p53 status on the regulation of tumor susceptibility to specific CTL-mediated cell death. For this purpose, we used a cytotoxic T lymphocyte clone, Heu127, able to lyse the human autologous lung carcinoma cell line, IGR-Heu, in an HLA-A2-restricted manner. Direct genomic DNA sequencing revealed that IGR-Heu expresses a mutated p53 at codon 132 of the exon 5, which results in the loss of p53 capacity to induce the expression of the p53-regulated gene product p21waf/CIP1. Initial experiments demonstrated that IGR-Heu was resistant to Fas, TNF and TRAIL apoptotic pathways. This correlated with the lack of p55 TNF receptor, Fas, DR4 and DR5 expression. The effect of wild type (wt) p53 restoration on the sensitization of IGR-Heu to autologous CTL clone lysis was investigated following infection of the tumor cell line with a recombinant adenovirus encoding the wt p53 (Adwtp53). We demonstrate that the restoration of wt p53 expression and function resulted in a significant potentiation of target cell susceptibility to CTL-mediated lysis. The wt p53-induced optimization of tumor cell killing by specific CTL involves at least in part Fas-mediated pathway via induction of CD95 expression by tumor cells but does not appear to interfere with granzyme B cytotoxic pathway. However, when IGR-Heu cells were transfected with Fas cDNA, no potentiation to Heu127-mediated lysis was observed, indicating that CD95 itself is not sufficient to sensitize target cells to CTL killing. Our data indicate that the effect of wtp53 on Fas-mediated pathway involves a degradation of short cellular FLICE-inhibitory protein (cFLIP short) resulting in subsequent caspase 8 activation. Furthermore, we demonstrate that wtp53 restoration also resulted in CTL-induced Bid translocation and a subsequent mitochondrial membrane permeabilization leading to cytochrome c release. These results indicate that tumor cell killing by autologous CTL can be enhanced by targeting degranulation-independent mechanisms via restoration of wtp53, a key determinant of apoptotic machinery regulation.

n 195

Biodistribution des cellules souches mésenchymateuses humaines Stro1+ et Stro1 dans le modèle NOD/SCID : leurs rôles dans la prise de greffe des cellules CD34+ de sang de cordon

Bensidhoum M, Chapel A, François S, Mazurier C, Bouchet S, Charbord P, Gorin NC, Thierry D, Lopez M

Laboratoire de Thérapie Cellulaire et de Radioprotection Accidentelle IRSN et Inserm U76 Paris, France.

La moelle osseuse contient, outre le compartiment hématopoïétique (CSH), un compartiment stromal contenant les MSC, cellules multipotentes qui donnent naissance aux lignages stromal, adipocytaire, chondrogénique et ostéoblastique. Ces cellules régulent l’hématopoïèse par la production de facteurs de croissance et de molécules d’adhérence. Elles ont une énorme potentialité en thérapie cellulaire. En onco-hématologie, étant donné que l’altération du stroma est une importante séquelle de la chimiothérapie à hautes doses, on conçoit que l’apport de MSC conjointement à une greffe de CSH pourrait améliorer et accélérer l’hématopoïèse. En outre, il est maintenant établi que les MSC pourraient réduire la GVH dans une allogreffe, ce qui augure d’une immunomodulation in vivo par ce type de cellules.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) représentent une population hétérogène, on connaît peu le rôle des différentes sous-populations dans l’implantation des précurseurs hématopoïétiques dans la MO après greffe ainsi que leur biodistribution. L’antigène Stro1 permet de caractériser deux sous-populations, les cellules Stro1+ et les cellules Stro1. Les cellules Stro1+ constituent une sous-population de cellules de la moelle osseuse adulte. Cette sous-population contient l’ensemble des colony-forming unit fibroblast (CFU-F) généralement considérés comme les précurseurs du stroma médullaire.
Nous avons analysé la capacité des cellules Stro1+ et Stro1, après amplification ex vivo, à favoriser la prise de greffe des cellules CD34+ humaines de sang de cordon dans le modèle NOD/SCID. Nos résultats montrent que la co-injection des CSM Stro1- et des cellules CD34+ augmente de façon significative la cinétique de greffe des cellules CD45+ humaine dans le sang pendant 12 semaines. 12 semaines après injection, dans la moelle, la rate et le sang le pourcentage de cellules humaines CD45 et CD19 est supérieur avec le co-injection de cellule Stro1 par rapport la co-injection de cellule Stro1+ Nous obtenons des résultats similaires avec les cellules humaines CD34 et CD11b dans la moelle osseuse, la rate et le sang.
Nous avons dans un second temps analysé la localisation des cellules Stro1 et Stro1+ 12 semaines après injection dans la souris NOD/SCID. L’analyse est effectuée par PCR-quantitative de la β-globine humaine dans différents tissus (moelle osseuse, rate, foie, muscle, cerveau, cœur, rein et poumon). Nos résultats montrent que l’implantation des cellules Stro1+ est supérieure à l’implantation des cellules Stro1 dans la rate, la moelle osseuse, le muscle et le rein. Nous n’observons pas de différences significatives dans le cerveau et le foie.
Nous montrons ici un lien entre l’état de différenciation des CSM et leur capacité à soutenir la greffe de cellules souches hématopoïétiques humaines in vivo ainsi que leur localisation dans les différents organes. La différence entre les deux sous-populations Stro1 et Stro1+ dans le soutien hématopoïétique et le homing est important pour les applications cliniques des CSM. Les cellules Stro1+ peuvent être utilisées en thérapie génique pour la synthèse de facteurs thérapeutiques dans les tissus tandis que les cellules Stro1 sont plus ciblées dans le support hématopoïétique après greffe.

n 196

La présentation croisée de la métalloprotéinase matricielle 2 par les mélanomes génère un nouvel antigène et ouvre des perspectives thérapeutiques innovantes de ce cancer

Godefroy E1, Moreau-Aubry A1, 2, Diez E1, Dreno B1, 3, Jotereau F1, 2, Guilloux Y1, 2

1 Inserm U601, 9,quai Moncousu, 44035 Nantes Cedex 1 ;
2
 Faculté des sciences et des techniques, 2, rue de la Houssinière, 44322 Nantes Cedex 3 ;
3 CHR, 9,quai Moncousu, 44035 Nantes Cedex 1.

Un grand nombre d’antigènes spécifiques de tumeurs, reconnus par des lymphocytes T CD8, ont été identifiés. Ces antigènes sont générés par différents mécanismes tels que mutations, surexpression, transcription ou traduction aberrantes. Ils sont utilisés comme cibles pour la réalisation d’immunothérapies visant à stimuler des réponses T antitumorales.
Nous montrons que la métalloprotéinase matricielle 2 (MMP2) est l’antigène reconnu sur le mélanome autologue, dans le contexte HLA-A2, par un clone de CTL dérivé des TIL d’un patient en rémission complète 8 ans après par injection de ces TIL et d’IL2 en situation adjuvante. Nous montrons que cet antigène est présenté par la majorité des mélanomes, mais pas par les cellules normales, exprimant HLA-A2 et MMP2. Nous montrons de plus que cette présentation dépend de la sécrétion de MMP2 ou de l’addition de MMP2 recombinante, de l’expression de l’intégrine αvβ3, de l’activité des vésicules à clathrine et de celle du protéasome.
Ces résultats montrent que MMP2 est un antigène spécifique de mélanome et que l’épitope HLA-A2 restreint est présenté exclusivement à partir de la protéine sécrétée après une endocytose dépendante du récepteur αvβ3 et un découpage par le protéasome dans le cytosol. Il s’agit de la première description d’une présentation croisée d’un antigène par des cellules tumorales, fonction que l’on croyait réservée aux cellules immunitaires.
Nous montrons enfin que l’épitope HLA-A2 restreint de MMP2 est contenu dans le domaine C-terminal de la protéine, correspondant au peptide PEX. Celui-ci étant un compétiteur naturel de l’activité protumorale de MMP2, nos résultats offrent des perspectives thérapeutiques nouvelles combinant deux approches, vaccinale et anti-invasive, par l’utilisation d’un fragment de MMP2 contenant l’épitope et le peptide PEX.

n 197

L’activation de cellules épithéliales mammaires murines par le LPS est dépendante du TLR4

Duthey A1, Sassi N1, Chantôme A1, Gauthier N1, Reisser D1, Jeannin JF1, Reveneau S1

1 Laboratoire d’immunologie et d’immunothérapie des cancers, EPHE-Inserm U517, Faculté de Médecine, BP 87900, 21079 Dijon Cedex.

Dans un modèle de cancer murin (tumeurs mammaires EMT6/souris Balb/c), nous avons mis au point une immunothérapie utilisant un lipide A, partie lipidique des endotoxines bactériennes (LPS). L’efficacité du traitement est dépendante de la production de monoxyde d’azote (NO) par les cellules tumorales elles-mêmes. In vitro, les cellules EMT6 répondent au LPS et au lipide A en produisant du NO. Les mécanismes par lesquels les cellules du système immunitaire sont activées par les dérivés bactériens tels que le LPS sont désormais bien décrits. Cependant, peu de données sont disponibles concernant la réponse de cellules épithéliales à ces dérivés. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les processus permettant aux cellules épithéliales mammaires de répondre au LPS et au lipide A in vitro, afin de mieux comprendre les mécanismes expliquant l’efficacité de l’immunothérapie que nous avons développée.
En utilisant un anticorps bloquant anti-TLR4/MD2, nous avons montré que la réponse au LPS est inhibée à 70 % en termes de production de NO, ce qui montre que le TLR4 est bien le récepteur recherché. La présence du récepteur TLR4 a été confirmée par immunoblotting. L’expression des ARNm de ce récepteur n’est pas modifiée par le traitement par le LPS ou le lipide A. Nous avons également montré la présence de molécules associées à la signalisation de TLR4 telles que CD14, l’adaptateur MyD88, la kinase IRAK1 ou encore TRAF6. Enfin, dans notre système, l’activation de TLR4 par le LPS induit l’activation de la voie des MAPK JNK, p38 et ERK, de la voie PI3K et des petites protéines G de la famille Rho. L’objectif à long terme est d’utiliser, en thérapie humaine, le traitement que nous avons développé ; un essai clinique de phase I étant déjà actuellement en cours.

n 198

Le cyclophosphamide potentialise les effets antitumoraux des exosomes de cellules dendritiques

Taïeb J, Chaput N, Baillard E, Novault S, Lemonnier F, Carpentier A, Angevin E, Zitvogel L

Inserm ERM0208, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France.

Les exosomes de cellules dendritiques (DEX) constituent une nouvelle approche dans les stratégies de vaccination antitumorale [1]. Nous avons récemment montré que l’adjuvantisation des DEX avec les séquences CpG et Poly-I : C augmentait l’efficacité de vaccinations antitumorales dans le modèle de mélanome murin B16F10/gp100 chez la souris transgénique HHD2 (HLA-A2.1)2. Par ailleurs, les propriétés immunomodulatrices du cyclophosphamide (CTX) ont largement été décrites. Nous rapportons ici l’effet d’une injection de CTX préalable à la vaccinothérapie par DEX dans ce même modèle.
Deux types d’expériences ont été réalisées. Les expériences antitumorales utilisaient des DEX chargés avec le peptide 209M de la protéine gp100, chez des souris HHD2 porteuses de mélanome B16F10/gp100. Les expériences évaluant les réponses effectrice et mémoire, étaient réalisées chez des souris HHD2, sans tumeur, en utilisant des DEX chargés avec le peptide Mart1. Le suivi de ces réponses était assuré par quantification des tétramères spécifiques A2/Mart dans les ganglions de drainage.
Nous avons montré qu’une injection unique de CTX (100 mg/kg) : 1) augmentait l’efficacité vaccinale des DEX adjuvantisés en CpG comme en témoignent les mesures tumorales (16 ± 5 mm2/DEX/CpG + CTX versus 423 ± 108 mm2/DEX/CpG à J26, p < 0,05) ; 2) améliorait la réponse primaire T CD8 + spécifique de peptide (animaux > 1,5.103 cellules tétramères positives : 75 % DEX/CpG + CTX versus 25 %/DEX/CpG, p < 0,05) ; 3) potentialisait la réponse mémoire en termes de nombre de cellules T CD8 + spécifiques de peptide (6 à 9.103 cellules tétramères positives DEX/CpG versus 9 à 139.103 DEX/CpG + CTX, p < 0,05), dans les ganglions de drainage. La persistance de l’efficacité antitumorale de cette stratégie alors que le CTX était injecté plusieurs jours avant l’implantation tumorale, confirme qu’il ne s’agit pas d’un effet cytotoxique direct du produit sur la lignée tumorale étudiée. De plus, le taux de contrôle de la croissance tumorale (tumeurs inférieures à 50 mm2 à J26) obtenu avec l’association DEX + CTX sans CpG était supérieur à celui de l’association de référence DEX/CpG (100 % et 20 %, respectivement, p < 0,05). L’absence d’efficacité d’une vaccination par DEX vides montre que cet effet est antigène spécifique/T dépendant. Enfin, il semble que la déplétion des cellules NK n’affecte pas l’efficacité de la combinaison DEX + CTX.
Le CTX semble donc être capable d’induire une réponse immunitaire antitumorale T-spécifique particulièrement efficace chez des animaux ayant bénéficié d’une vaccination par DEX. L’association DEX + CTX est la plus efficace que nous ayons observé dans une stratégie d’immunothérapie antitumorale utilisant des exosomes. Elle devrait prochainement être évaluée chez des patients atteints de mélanomes au-delà de toute ressource thérapeutique.

1. Zitvogel et al. Nature Med 1998.

2. Chaput et al. J Immunol 2004.

n 199

Identification of apoptosis-related genes differentially expressed in mature dendritic cells used in clinical trials

Hatzfeld-Charbonnier AS1, Mortier L1, 2, Detournay O3, Formstecher P1, Velu T3, Toungouz M3, Marchetti P1

1 Inserm U459, 1 place Verdun, 59045 Lille Cedex ;
2
 Clinique de Dermatologie, CHRU, Lille  ;
3 Unit é de thérapie cellulaire et moléculaire, ULB, Hôpital Erasme, Bruxelles

Background. Numerous clinical trials were initiated which used dendritic cells (DCs)-based immunotherapies to treat cancer patients. Although the results of several clinical trials were quite optimistic, the presence of patients with limited or no responses indicates the actual need for the improvement of modern DCs-based therapies. One of the reasons for the limited efficacy of the immune responses in treated patients may be premature suppression and elimination of DCs by apoptosis. DCs used for anti-cancer vaccines are mainly generated ex vivo from peripheral monocytes differentiated in the presence of GM-CSF and IL-4 (G4 DCs). A new DCs type obtained by culture of monocytes in the presence of IFN- β and IL-3 (I3 DCs) was recently used in clinical trials. The purpose of this study was to analyze patterns of apoptosis-related genes expression in these two populations of DCs. Methods : G4 DCs and I3 DCs were generated from blood sample of the same donors following ordinary procedures used for the preparation of DCs vaccines. Mature G4 DCs and mature I3 DCs were generated by an additional 18 hrs of incubation in the presence of LPS (1 µg/ml) or polyI : C (the most potent maturation agent for I3 DCs) (10 µg/ml), respectively. DCs were extracted for RNA (Quiagen kit). RNA was amplified and then utilized for a focused gene array analysis using GEArray Q series human apoptosis gene arrays (SuperArray Inc.). To compare signal intensities of each gene, quantification of spot intensities and substraction of backgroung were performed using Kodak 1D Image analysis software. A 3-fold or greater modulation of genes expression was considered as significant. Results : Of 96 genes examined, 6 genes were upregulated in G4 DCs compared with I3 DCs. Higher expression of caspases including the pro-inflammatory caspase-1 and the effector caspases, caspase-3 and caspase-7 were found in G4 DCs. However, high expression levels of the inhibitor of apoptosis proteins (NIAP, IAP2, IPA1) were found in both DC populations. Among TNF ligand family members, the expression of TRAIL was greatly up-regulated in G4DCs. No significant difference was observed in the expression of Bcl-2 family members. Conclusion : Our results identify some significant differences in apoptosis-related genes expression patterns between G4 DCs and I3 DCs. These findings provide a basis for future efforts to understand the mechanisms and the differences in the apoptotic execution machinery in DCs used in clinical trials.

Supported by grants (to PM) from the Ligue nationale contre le cancer (Comité du Nord) and the Société française de dermatologie.

n 200

Résultats cliniques d’un protocole bicentrique de thérapie cellulaire du mélanome, à l’aide de cellules dendritiques matures chargées d’antigènes peptidiques

Quillien V1, Lesimple T1, Neidhardt EM2, Adamski H3, Lefeuvre C1, Philip I2, Clapisson G2, Toujas L1

1 Centre Eugène Marquis, rue bataille Flandres-Dunkerque, 35042 Rennes ;
2 Centre Leon Berard, 28 rue Laennec 69008 Lyon ;
3 CHU Pontchaillou,rue Henri le Guilloux, 35000 Rennes.

Dans le cadre d’un protocole multicentrique de thérapie cellulaire (CRLCC de Rennes et Lyon, U463 Nantes pour l’immunomonitorage), des patients atteints de mélanomes métastatiques ont reçu des injections de cellules dendritiques matures chargées par des antigènes de tumeur.

Les cellules dendritiques (CD) ont été préparées en utilisant le système VacCell®Processor (IDM). Une partie des CD a été incubée en présence KLH (Keyhole-limpet hemocyanin) avant d’être maturée une nuit à l’aide d’interféron gamma et de Ribomunyl®. Ces cellules ont ensuite été exposées aux antigènes de tumeur Melan-A et/ou NA-17A avant d’être injectées dans un lymphatique pédieux (injection semaine 0). L’autre partie des CD a été congelée au stade immature. Les CD décongelées en semaines 4 et 8 ont été traitées dans les mêmes conditions qu’en semaine 0, avant d’être injectées par voie intraganglionnaire. Quatorze patients répondant aux critères de sélection (mélanome métastatique à l’exception des stades M3 AJCC, de groupe HLA02-01 et exprimant Melan-A et/ou Na17A au niveau de leur tumeur) ont été inclus. Ils ont reçu en moyenne 82 millions de CD lors de la première injection, 49 et 48 millions de CD lors de la seconde et troisième injection. Huit patients ont présenté, suite aux injections, des réaction cutanées généralisées avec parfois suttonisation des naevi et sensation de douleurs au niveau des nodules tumoraux. Les autres effets secondaires étaient de type frisson et hyperthermie. Sur les 13 patients ayant actuellement terminé le protocole, 4 ont été stabilisés au décours du traitement, les autres étant progressifs. Parmi ces derniers, 2 patients avaient eu des régressions transitoires de nodules cutanés en cours de traitement (régression > 75 % dans un cas). Un des patients stabilisé a présenté une réponse dissociée tardive avec régression totale d’un nodule péritonéal mis en évidence en cours de traitement. Aucune régression n’a été observée dans les 4 cas de métastases pulmonaires.

L’injection de CD par voie intralymphatique n’a pas permis d’obtenir, pour ce protocole, de réponse clinique objective. Seules des réponses partielles et uniquement cutanées et sous-cutanées ont pu être obtenues.

n 201

La vaccination à l’aide de cellules dendritiques (DC) dérivées de progéniteurs hématopoïétiques induit des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques de tumeur chez les patients souffrant de mélanome métastatique

Paczesny S1, Fay J1, Burkholder S1, Dhodapkar M2, Steinman R2, Banchereau J1, Palucka A.K1

1 Baylor Institute for Immunology Research Dallas, TX ;
2 The Rockefeller University, NY.

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules uniques permettant la présentation d’antigènes aux lymphocytes T naïfs qui induisent les réponses immunes primaires. Le défi des dernières années est de reproduire ces réponses immunes in vivo, en utilisant des vaccins à l’aide de DC, chez les patients souffrant de cancer.
Nous avons immunisé 18 patients HLA A*0201+ ayant un mélanome métastatique avec des DC autologues dérivées de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (CD34-DC). Ce vaccin contient à la fois des cellules de Langerhans et des DC interstitielles. Ces DC ont été pulsées avec un mélange de peptides HLA A*0201 restreints Mart1, tyrosinase, Mage-3 et gp100, ainsi que le peptide du virus de la grippe et de la KLH. L’analyse à 10 semaines après l’entrée dans l’étude a indiqué une maladie progressive chez 6/7 des patients présentant une immunité à moins de 2 antigènes de mélanome (MelAgs). A l’opposé, la progression tumorale a été observée chez seulement 1/10 des patients présentant une immunité contre plus de 2 MelAgs. Les patients progressifs n’avaient pas développé de lymphocytes T spécifiques du mélanome à aucun moment après l’immunisation par le vaccin. Cependant, la plupart d’entre eux ont eu des cellules produisant de l’IFNγ en réponse à la grippe ou au CMV. Ainsi, la progression de la tumeur a été associée à la tolérance immunologique spécifique aux antigènes de tumeur. Les patients non – progresseurs cliniques (NP) ont des lymphocytes T CD8 capables de sécréter de l’IFNγ après stimulation par les MelAgs. La génération de CTL à partir du compartiment mémoire a été examinée grâce à une expérience de rappel où les lymphocytes T CD8 sont cultivées pendant 10 jours avec des DCs autologues pulsées avec le mélange de peptides (une stimulation). Les lymphocytes T des patients NP ont une activité CTL contre des cellules cibles TAP déficientes (T2) pulsées avec les peptides de mélanome ainsi que contre des lignées allogéniques de mélanome dans un essai de largage du 51Cr. En outre, une coculture de ces lymphocytes T avec les lignées de mélanome dans un essai de régression tumorale permet l’élimination des cellules tumorales tandis que les lymphocytes T des patients progressifs ne pouvaient pas le faire.
Ces résultats montrent la génération in vivo de lymphocytes T CD8 spécifiques de mélanome avec un pouvoir cytotoxique élevé chez les patients NP et survivants à long terme après la vaccination par les CD34-DC. Les résultats de cette étude justifient des essais cliniques de phase III utilisant les CD34-DC.

Patient Age (années) Diagnostic initial Facteurs de risque de MVO Posologie du DF (mg/kg/j) Durée du DF (en jours)
Nombre GCS H Type de conditionnement
1 5 Néphroblastome de stade III métastatique 1 Vépéside Carboplatine Melphalan 50 15
2 21 Ostéosarcome métastatique 2 Busulfan Melphalan 55 14
3 33 Sarcome d’Ewing 2 40 .