Etude de la clonalité dans la thrombocytémie essentielle

ARTICLE

La thrombocytémie essentielle étant un diagnostic d'exclusion de toute cause d'hyperplaquettose [1], l'étude de la clonalité des cellules sanguines pourrait aider au diagnostic de l'affection en démontrant une éventuelle hématopoïèse monoclonale.
L'analyse de la clonalité repose sur l'hypothèse d'inactivation au hasard du chromosome X chez les femmes. Dans le cas d'une population polyclonale, il existe un mélange de cellules, dont la moitié a inactivé le chromosome X paternel et l'autre moitié a inactivé le chromosome X maternel. Dans le cas d'une population monoclonale, on observe une inactivation d'un seul des deux chromosomes X. Ainsi, en utilisant un gène polymorphe présent sur le chromosome X et sensible au processus de l'inactivation, il est possible de démontrer le caractère monoclonal ou polyclonal d'une population cellulaire selon le profil d'inactivation observé [2].
Avant d'aborder plus précisément les principales études de clonalité dans la thrombocytémie essentielle, il convient de rappeler quelques caractéristiques de ce phénomène d'inactivation.

Le processus d'inactivation chez les mammifères

Principales caractéristiques de ce phénomène

Un seul chromosome X est actif chez la femme. Le second est inactivé précocement au cours de l'embryogenèse. Cette inactivation survient au hasard. Elle reste stable durant toute la vie de la cellule et est transmise aux cellules filles après division cellulaire. Elle est également stable après culture in vitro ou lorsque la cellule devient néoplasique [3]. Le chromosome X inactif est détectable dès le 16e jour (C. de Barr, 1949) dans l'embryon humain. Ce phénomène d'inactivation, encore appelé phénomène de lyonisation, a été proposé pour expliquer le mosaïcisme du phénotype des souris hétérozygotes pour certains gènes mutants sur le chromosome X [4]. Depuis, ce principe a été largement appliqué à l'étude de maladies génétiques liées au chromosome X et à l'analyse de la clonalité des tumeurs [2, 5].
L'inactivation de nombreux gènes sur le chromosome X s'accompagne de variations dans la méthylation des régions CpG en 5' des gènes, alors que la méthylation des autres régions du chromosome X semble indépendante du phénomène d'inactivation. La méthylation apparaît essentiellement impliquée dans la stabilisation de l'inactivation durant la différenciation des différents tissus embryonnaires. Quoi qu'il en soit, cette méthylation permet de reconnaître le chromosome X actif du chromosome X inactif en étudiant l'action différentielle d'enzymes de restriction sensibles à la méthylation. Quand le site est méthylé, l'enzyme ne coupe pas l'ADN [2, 3].
Rappelons enfin qu'un seul chromosome X est actif dans les cellules somatiques diploïdes quel que soit le nombre de chromosomes X par cellule, et que la région pseudo-autosomique, lieu de l'appariement et de l'échange entre les chromosomes X et Y au cours de la méïose mâle, échappe à l'inactivation, cette région étant homologue sur les deux chromosomes [3, 6].

Le phénomène d'inactivation est un phénomène actif qui comporte trois étapes

Son initiation se fait à partir d'un centre unique de régulation en cis : le centre d'inactivation ou XIC chez l'homme (Xq13) et Xic chez la souris. Chez la souris, il existe un locus capable de contrôler l'inactivation [7]. Ce locus s'appelle Xce pour locus controlling element. Il semble affecter la probabilité qu'un chromosome soit inactivé, ce phénomène étant considéré comme le résultat d'une modulation de l'inactivation et non d'une sélection cellulaire. Trois allèles faible, intermédiaire, et fort ont été définis respectivement (Xcea, Xceb et Xcec). Les analyses d'expression sur des animaux porteurs de différents allèles du locus Xce, ont montré qu'un transcrit spécifique de l'inactivation (Xist pour X inactivation specific transcript) est transcrit de façon forte par les cellules femelles d'une souris porteuse de l'allèle faible du locus Xce (favorisant l'inactivation), intermédiaire quand elles portent l'allèle intermédiaire du Xce, tandis que l'allèle fort défavorise son inactivation. Xce et Xic sont localisés dans la même région sur le chromosome X murin et sont souvent considérés comme étant un seul et même locus. Il est supposé par ailleurs qu'un signal de nature inconnue est capable de bloquer en trans l'inactivation d'un des deux chromosomes X dans une cellule diploïde, afin de conserver un seul chromosome X actif par cellule. La seconde étape de l'inactivation est son expansion. Elle est discontinue le long du chromosome, laissant des gènes échapper à l'inactivation, du moins chez l'homme. Enfin, la troisième étape est le maintien de l'inactivation par la méthylation. Cette méthylation semblerait se faire progressivement et en fonction, au moins en partie, de la distance du gène par rapport au Xce. Par exemple, le gène PGK qui est situé à proximité du Xce, est méthylé à J + 3,5 ; avant le gène de la
G-6-PD (J + 5,5) et le gène HPRT (J + 6,5) [8].
Le gène XIST chez la femme est très similaire au gène Xist chez la souris (70 %) [3, 9] dans son profil d'expression et dans sa localisation. Il n'y a pas de phase de lecture ouverte (donc pas de traduction possible en protéine). L'ARNm n'est pas associé aux polyribosomes. Les auteurs ne peuvent cependant pas éliminer la possibilité d'un produit protéique de 25 acides aminés (nt : 9788-9863). Pour que XIST puisse s'exprimer, il est indispensable d'en avoir une autre copie en position trans (la duplication de la région Xq13 en cis comprenant XIST chez un patient XY n'entraîne pas l'expression de ce dernier et il n'y a donc pas d'inactivation) [3,9].
Cette séquence, qui est transcrite par le chromosome X inactif, ne l'est pas par le chromosome X actif. La séquence XIST ne possède pas de copie Y et est localisée dans l'intervalle contenant le centre d'inactivation. Au moment de la fécondation, le chromosome X d'origine maternelle est actif et celui d'origine paternelle est inactif. Dans le zygote, les deux chromosomes X sont actifs par réactivation du X paternel. Chez la souris, le transcrit Xist apparaît au stade de morula puis dans le blastocyste (J + 3,5), codé par le chromosome X d'origine paternelle dans les tissus extraembryonnaires. Cependant, à partir de J + 3,5, dans les blastocystes femelles dont les deux chromosomes X portent des allèles différents au locus Xce, l'expression de Xist est modulée en fonction de l'allèle Xcep ou Xcem, Xce contrecarrant ainsi l'empreinte génomique sur le X paternel. De même, l'inactivation préférentielle du chromosome X paternel des tissus extraembronnaires dans l'embryon tardif (J + 13,5) est modifiée en fonction de l'allèle Xce que les deux chromosomes portent [3, 10].

Un phénomène d'inactivation inégale a été décrit chez les femmes normales

En effet, plus de 20 % des femmes normales ont une image d'inactivation préférentielle d'un allèle par rapport à l'autre au niveau du tissu hématopoïétique, constituant la première difficulté dans l'analyse de la clonalité. C'est le phénomène de lyonisation (ou d'inactivation) inégale. Ce pourcentage est plus élevé que celui retrouvé dans les tissus non hématopoïétiques, et semble en partie lié au gène étudié et à la technique d'analyse, allant de 3 % par l'étude du polymorphisme protéique du gène de la G-6-PD (glucose-6-phosphate déshydrogénase) à 40 % par les marqueurs ADN [11, 12]. Cette inactivation inégale est retrouvée dans les différentes fractions cellulaires du sang : granulocytes, érythrocytes, lymphocytes T, lymphocytes B, cellules NK et plaquettes [12, 13]. Plusieurs hypothèses ont été évoquées pour expliquer ce taux de lyonisation inégale particulièrement élevé dans le tissu hématopoïétique [12] :
* L'inactivation survient normalement très tôt dans l'embryogenèse. Plus ce phénomène est précoce, plus la probabilité d'observer une inactivation inégale augmente. Il semble que l'inactivation du chromosome X survienne particulièrement tôt au niveau du pool de cellules destiné à la constitution du tissu hématopoïétique, et par conséquent, sur un faible nombre de cellules. Cela pourrait expliquer l'existence d'une inactivation inégale d'allèles dans les cellules sanguines, largement supérieure à celle observée dans les autres tissus, comme la peau (20 %), le muscle (25 %), et le côlon (11 %), chez les mêmes sujets.
* Il est parfois possible d'observer un phénomène de sélection spécifique d'allèle, survenant après le phénomène d'inactivation. Ce phénomène a été décrit dans les maladies de Lesh-Nyhan, Wiskott-Aldrich, l'agammaglobulinémie et le déficit immunologique combiné sévère ; pour expliquer le phénomène de lyonisation inégale chez des femmes hétérozygotes pour lesquelles le chromosome actif est souvent le chromosome normal. Il a été avancé que, dans ces cas-là, le gène défectueux interfère avec la maturation ou la survie de la cellule uniquement quand il est exprimé dans cette cellule, ce qui conduit la cellule à sélectionner l'allèle normal. Dans d'autres maladies comme l'adrénoleucodystrophie et la granulomatose chronique, c'est l'allèle mutant qui est favorisé.
* Puisque les cellules hématopoïétiques proviennent du sac extraembryonnaire, il est possible que l'inactivation du chromosome X de ces cellules se produise préférentiellement sur le chromosome paternel, comme c'est le cas chez la souris. La notion d'empreinte génomique a souvent été mise en cause pour expliquer cette inactivation préférentielle [14]. Cependant, dans une étude réalisée chez 5 patientes en rémission complète d'une leucémie aiguë myéloïde et considérées comme ayant une lyonisation inégale dans les granulocytes et les lymphocytes T, l'analyse de l'inactivation du chromosome X a montré que l'allèle inactif était paternel dans trois cas et maternel dans deux cas [12].
Quoi qu'il en soit, il existe une faible corrélation du pattern d'inactivation du chromosome X entre le tissu hématopoïétique et les tissus non hématopoïétiques, ce phénomène survenant à différents moments de l'embryogenèse dans les différents tissus [8, 12]. Par conséquent, on ne peut affirmer une monoclonalité de l'hématopoïèse qu'en démontrant l'existence d'une polyclonalité dans une ou plusieurs fractions hématopoïétiques.
La question des variations possibles du taux d'inactivation inégale en fonction de l'âge a été déjà évoquée par différents auteurs. Ce taux ne paraît pas être lié à l'âge quand on considère l'ensemble des résultats publiés dans la littérature (n = 100) [12]. Deux publications seulement semblent montrer le résultat inverse. Dans la première étude, la fréquence d'une lyonisation inégale sévère serait significativement plus importante chez les femmes âgées de plus de 75 ans par rapport à des femmes de 20 à 58 ans et à des enfants de 2 à 8 ans (p = 0,00125 ; c² test) [15]. De même, plus récemment, Busque et al. ont constaté une augmentation de l'incidence de lyonisation inégale chez les femmes avec l'âge : 37,9 % chez les femmes de plus de 60 ans, 16,4 % chez les femmes de 28 à 30 ans, et 8,6 % chez les nouveau-nés [16]. Ces auteurs considèrent que le taux réel d'inactivation inégale est celui observé à la naissance et, qu'avec l'âge, ce taux augmente en raison d'une déplétion en cellules souches ou d'un phénomène de sélection cellulaire. Dans toutes ces études, les marqueurs utilisés sont des gènes polymorphes présents sur le chromosome X, et dont l'étude repose sur les différences de méthylation de l'ADN génomique, dont les variations avec l'âge sont inconnues. Dans notre expérience, l'utilisation de marqueurs ARN semble donner une image d'inactivation inégale beaucoup moins fréquemment que l'utilisation de marqueurs ADN chez les témoins sains [17]. Ces résultats nécessitent d'être confirmés sur un nombre plus élevé de prélèvements de femmes normales.

Résultats des études de la clonalité dans la thrombocytémie essentielle

Les études de la clonalité de l'hématopoïèse dans la thrombocytémie essentielle sont à interpréter avec les réserves émises ci-dessus. Le terme « inactivation inégale » sera employé à chaque fois que la preuve d'une monoclonalité n'a pu être apportée par l'utilisation d'un tissu témoin adéquat de lyonisation. La possibilité d'une inactivation inégale doit toujours être prise en considération dans l'analyse de l'étude de la clonalité.

Étude de la clonalité au niveau de la protéine

C'est Fialkow qui, le premier, a postulé chez trois patientes l'origine clonale de la thrombocytémie essentielle, en utilisant l'enzyme de la G-6-PD [18]. Une seule isoforme a été retrouvée dans les granulocytes, les érythrocytes et les plaquettes, alors que les deux isoformes étaient présentes au niveau de la peau de ces patientes, la peau étant considérée à l'époque comme tissu témoin de lyonisation. Les lymphocytes T n'ont pas été analysés dans cette étude. Ces résultats ont été confirmés plus tard chez une quatrième patiente qui, par ailleurs, ne présentait pas d'atteinte des lignées monocytaires et lymphocytaires T et B [19].

Étude de la clonalité au niveau de l'ADN (figure 1)

Les allèles présents sur les chromosomes X actif et inactif se distinguent l'un de l'autre par leur état de méthylation. L'inactivation du chromosome X s'accompagnant le plus souvent d'une hyperméthylation, l'allèle présent sur le chromosome inactif est résistant à la digestion par des endonucléases de restriction reconnaissant les dinucléotides CpG et sensibles à la méthylation des cytosines [2]. Après digestion enzymatique, les allèles présents sur les chromosomes X actifs et inactifs sont séparés par Southern blot ou par PCR [2, 16].
Avec le développement des marqueurs ADN, un nombre plus élevé de malades a été étudié. En utilisant les sondes PGK (phosphoglycérate kinase) et HPRT (hypoxantine phosphoribosyl transférase) par la technique Southern blot, Lucas et al. ont retrouvé une polyclonalité sur sang total chez une patiente [20], alors que Anger et al. ont retrouvé une inactivation inégale chez les 4 patientes étudiées, dont une présentait une polyclonalité dans les lymphocytes T [21]. Chez deux soeurs atteintes de thrombocytémie essentielle, Janssen et al. ont analysé la clonalité dans les différentes fractions de cellules nucléées [22]. La même image d'inactivation inégale a été retrouvée chez l'une des deux soeurs, alors que chez l'autre était retrouvée une hématopoïèse monoclonale dans les granulocytes, avec une polyclonalité dans les lymphocytes T et les monocytes. Une étude intéressante a été réalisée plus tard par Turhan et al. Ces auteurs ont comparé la clonalité à l'existence d'une pousse spontanée des BFU-E en culture chez 9 patientes [23]. Une inactivation inégale a été retrouvée dans les granulocytes chez 6 patientes dont 5 avaient une pousse spontanée et la dernière ne l'avait pas. Une inactivation au hasard a été observée chez les 3 autres patientes dont 2 avaient une pousse spontanée mais pas la troisième. Il n'y avait donc pas de corrélation entre l'image de l'inactivation et l'existence d'une pousse spontanée des BFU-E en culture. Un nombre plus grand de patientes (n = 13) a été analysé par Tsukamoto et al. en utilisant toujours les mêmes marqueurs PGK et HPRT [24]. Une monoclonalité de l'hématopoïèse a pu être confirmée dans 8 cas, en raison de l'existence d'une polyclonalité dans les lymphocytes T, alors que chez les 5 autres, la même image d'inactivation inégale a été constatée dans les lymphocytes T.
Enfin, le gène HUMARA (gène du récepteur aux androgènes) s'est révélé être un marqueur très informatif et relativement simple à utiliser [25]. Une inactivation inégale a pu ainsi être démontrée chez une majorité de patientes atteintes de thrombocytémie essentielle (69 %). La fraction granulocytaire était toujours le reflet du sang total et la fraction mononucléée s'est révélée être un mauvais contrôle de lyonisation. En effet, la preuve d'une réelle monoclonalité de l'hématopoïèse n'a pu être apportée que chez 3 parmi 22 patientes qui présentaient un profil d'inactivation inégale.
Cependant, il est possible que la méthylation ne soit pas toujours un témoin fidèle de l'inactivation du chromosome X et que des anomalies secondaires de méthylation qui sont rapportées dans certaines tumeurs viennent fausser les résultats [2, 26] ; l'image obtenue étant une fausse polyclonalité. Le second problème est l'impossibilité d'étudier la clonalité dans certaines fractions hématopoïétiques comme les lignées rouge et plaquettaire. Pour ces raisons, l'analyse du polymorphisme des transcrits s'est développée.

Étude de la clonalité au niveau de l'ARNm (figure 2)

L'identification de variations nucléotidiques par l'analyse des transcrits permet de déterminer chez des patientes hétérozygotes, si un seul ou deux allèles sont transcrits. Cela traduit l'inactivation préférentielle d'un chromosome X ou l'inactivation au hasard des deux chromosomes X au sein de la population étudiée.
Peu d'études ont été réalisées avec des marqueurs ARN. Prchal et al. ont analysé l'hématopoïèse chez une patiente atteinte de thrombocytémie essentielle, grâce à un polymorphisme du gène P55 (gène codant pour une protéine membranaire de 55 kd riche en acide palmitique) en utilisant la technique LDR/LCR (ligase detection reaction/ligase chain reaction) [27]. Ils ont constaté une monoclonalité dans les granulocytes, les réticulocytes et les plaquettes, alors qu'une polyclonalité a été observée dans les lymphocytes T et B et dans les progéniteurs médullaires les plus immatures (CD34+, Thy1+, lin-).
En utilisant les transcrits des gènes IDS (Iduronate-2-sulfatase), P55 et G-6-PD, il a été possible dans notre étude de démontrer l'existence d'une hématopoïèse monoclonale chez 28 des 35 patientes atteintes de thrombocytémie essentielle selon les critères du PVSG (Polycythemia Vera Study Group) (80 %) [28]. Chez 25 des 28 patientes, une monoclonalité a été retrouvée dans les granulocytes et les plaquettes, alors que les lymphocytes T étaient polyclonaux. Chez les 3 autres patientes, une monoclonalité isolée a été retrouvée dans les plaquettes malgré une polyclonalité dans toutes les autres fractions cellulaires. Sept patientes ont montré une hématopoïèse polyclonale dans toutes les fractions cellulaires. Enfin, chez 4 autres patientes, la même image d'inactivation inégale a été observée dans toutes les fractions cellulaires, empêchant toute conclusion sur la clonalité. La possibilité d'étudier la clonalité dans les plaquettes constitue un avantage notable de ces techniques puisqu'une monoclonalité isolée de cette fraction a pu être parfois constatée [25, 28].
Contrairement aux techniques basées sur les différences de méthylation au niveau de l'ADN génomique, celles basées sur la détection des ARNm permettent l'étude de la clonalité dans toutes les lignées hématopoïétiques. Cependant, pour l'étude de l'ARNm, il est important d'avoir des fractions cellulaires pures, l'expression des gènes étant souvent variable d'une lignée à l'autre. Pour cette même raison, le résultat de la clonalité sur sang total est difficile à interpréter, celle-ci étant corrélée à la lignée exprimant majoritairement le gène en question. En revanche, pour les marqueurs ADN, le sang total est habituellement le reflet de la fraction granulocytaire qui représente le plus souvent les deux tiers des cellules nucléées.

Discussion

L'étude de la clonalité reposant sur le principe de l'inactivation du chromosome X est d'interprétation délicate en raison de la complexité de ce phénomène et des problèmes spécifiques inhérents aux techniques utilisées. Il est cependant admis qu'une monoclonalité de l'hématopoïèse ne peut être affirmée qu'en présence d'une polyclonalité dans une ou plusieurs lignées hématopoïétiques non impliquées dans le processus néoplasique. Le choix de ce tissu témoin reste donc à définir en fonction de la pathologie étudiée.
Dans la thrombocytémie essentielle, l'hématopoïèse paraît le plus souvent monoclonale, permettant de différencier un syndrome myéloprolifératif d'une hyperplaquettose secondaire où l'hématopoïèse est toujours polyclonale dans notre expérience. Les plaquettes représentent la lignée hématopoïétique la plus intéressante à étudier dans cette maladie, avec une fréquence plus élevée de monoclonalité par rapport à la lignée granulocytaire. De même, les lymphocytes T semblent constituer le tissu témoin de lyonisation le plus adapté, la plupart des études dont la nôtre ayant montré une absence de leur atteinte dans cette maladie. Cependant, dans notre expérience, aucune hématopoïèse monoclonale n'a pu être détectée dans 20 % des cas. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer l'existence d'une hématopoïèse variable chez ces patients ; l'atteinte néoplasique peut se situer à des niveaux différents des progéniteurs médullaires ; de même, l'inhibition de l'hématopoïèse normale peut être variable en fonction des patients, incomplète en cas d'hématopoïèse polyclonale et complète en cas d'hématopoïèse monoclonale. Cela démontre une fois de plus l'hétérogénéité de la thrombocytémie essentielle, qui regroupe probablement sous ce terme une hyperplaquettose primitive d'étiologie variable ainsi que l'intérêt d'utiliser un faisceau d'arguments pour étayer ce diagnostic

CONCLUSION

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